• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TNF-α誘導人肺微血管內皮細胞凋亡Caspase-3活性的研究

    2016-03-06 11:57:36吉圣珺葉志堅陳耀豐劉劍張培芳鄭韶欣
    海南醫(yī)學 2016年14期
    關鍵詞:微血管空白對照內皮細胞

    吉圣珺,葉志堅,陳耀豐,劉劍,張培芳,鄭韶欣

    (1.佛山市第一人民醫(yī)院呼吸內科,廣東 佛山 528000;2.廣州市中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心內科,廣東 廣州 510120)

    ·論 著·

    TNF-α誘導人肺微血管內皮細胞凋亡Caspase-3活性的研究

    吉圣珺1,葉志堅1,陳耀豐1,劉劍1,張培芳1,鄭韶欣2

    (1.佛山市第一人民醫(yī)院呼吸內科,廣東 佛山 528000;2.廣州市中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心內科,廣東 廣州 510120)

    目的 探討凋亡“核心蛋白酶”-半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導人肺微血管內皮細胞(HPMVECs)凋亡中的作用。方法體外培養(yǎng)HPMVECs,空白對照組置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),TNF-α組分別以10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL濃度刺激HPMVECs,使用MTT比色法檢測各組細胞活性,AnnexinⅤ/PI雙染色聯(lián)合流式細胞術檢測細胞凋亡率,流式細胞術檢測Caspase-3的活性。結果空白對照組的細胞凋亡率及Caspase-3活性最低;空白對照組和TNF-α組(10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL)比較,100 ng/mL TNF-α組的相對細胞活性最低,而細胞凋亡率及Caspase-3活性最高,TNF-α誘導HPMVEC凋亡時呈現(xiàn)出濃度依賴性,隨著時間的延長,Caspase-3活性逐漸升高(P<0.05)。結論TNF-α誘導人肺微血管內皮細胞凋亡呈現(xiàn)濃度依賴性,Caspase-3可能參與了這一細胞凋亡過程的調控。

    腫瘤壞死因子-α;人肺微血管內皮細胞;凋亡;半胱氨酸蛋白酶-3

    慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是全世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。肺動脈高壓(Pulmonary hypertension,PH)是其常見的并發(fā)癥之一,PH的發(fā)生與COPD患者死亡率的顯著增加相關[1]。缺氧及炎癥引起肺血管收縮及重構是慢性阻塞性肺疾病發(fā)生肺動脈高壓的重要病理生理基礎,肺血管內皮損傷是PH發(fā)病的起始環(huán)節(jié),而血管內皮細胞凋亡是血管內皮損傷的重要機制[2-3]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族是一組特異性切割天冬氨酸殘基上的肽鍵繼而引起細胞凋亡的蛋白水解酶,是所有凋亡蛋白中最主要的執(zhí)行者[4]。Caspase-3在血管內皮細胞的凋亡信號傳導路徑中占據(jù)著的核心地位,是凋亡信號傳導的共同通路[5]。目前尚未見到有關于TNF-α誘導人肺微血管內皮細胞(HPMVEC)凋亡與Caspase-3活性變化的相關報道。本研究探討了TNF-α誘導HPMVEC的凋亡及其可能的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及儀器 HPMVEC株購自上海細胞庫,100 mL/L胎牛血清及高糖細胞培養(yǎng)基購自Hy-clone公司,四甲基偶氮唑藍購自Sigma公司,Caspase-3活性檢測試劑盒、流式細胞儀購自BD公司,異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(AnnexinⅤ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,AnnexinⅤ-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司。

    1.2 HPMVEC的復蘇和傳代培養(yǎng) 從液氮保存罐中取出凍存管(含原代HPMVEC),立即放入37℃水浴中,快速搖晃,直至凍存液完全融化。將其置于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液。內皮細胞呈鵝卵石樣貼壁生長,當細胞生長至90%匯合時用2.5 g/L乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)胰蛋白酶進行消化傳代,取第4代血管內皮細胞進行實驗。

    1.3 實驗分組及處理 空白對照組:用100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理內皮細胞,置于50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng);TNF-α組:分別用10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL TNF-α進行刺激,然后用100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理內皮細胞,置于50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

    1.4 MTT法檢測HPMVEC的增殖活性 MTT比色法測定各組細胞的活性。收集對數(shù)期細胞,調整細胞數(shù);以4 000個/孔細胞接種到96孔板中。37℃、50 mL/L CO2條件下孵育1 d;棄去培養(yǎng)液,按上述實驗分組方法處理細胞。吸干培養(yǎng)基,每孔加入20 μL MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液,每孔加入150 μL DMSO溶液,置搖床上低度振蕩10 min,用酶標儀檢測490 nm波長各孔的吸光度(A)值。細胞活力=(A處理組-A空白管)/(A空白對照組-A空白管)× 100%。

    1.5 AnnexinⅤ/PI雙染色聯(lián)合流式細胞術檢測HPMVEC的凋亡 細胞分為空白對照組、TNF-α處理組。每組取3個6孔板的培養(yǎng)孔,胰蛋白酶消化(不含EDTA)收集細胞,1 000×g離心5 min,棄上清。磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞后,離心,重復兩次后棄上清。分別加入結合緩沖液200 μL重懸并進行細胞計數(shù),調整細胞數(shù)。取200 μL細胞懸液,加入5 μL annexinⅤ-FITC混勻,室溫避光10 min。再加入5 μL PI染液混勻,流式細胞儀進行檢測分析:每份樣品取1×104個細胞PI染色,做DNA分析。

    1.6 Caspase-3的活性檢測 根據(jù)預實驗結果,實驗分為空白對照組、TNF-α處理組。分別收集各組細胞。1 500 r/min離心10 min,用預冷的PBS洗滌細胞兩次;4℃、300×g離心5 min,收集(1~5)×105個細胞;加氟甲基酮標記的轉錄因子2-天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸(Transcription factor 2-Asp-Glu-Val-A sp-fluoromethylketone,TF2-DEVD-FMK),37℃反應1 h;流式細胞術分析Caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度[6-7]。

    1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 MTT比色法檢測細胞活性 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mLTNF-α處理組與100 ng/mLTNF-α處理組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而100 ng/mL TNF-α處理組的相對細胞活性明顯低于空白對照組(P<0.01),TNF-α對細胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)劑量依賴關系,見表1。

    組別空白對照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL OD值1.97±0.05相對細胞活性(%) 100±0.00 1.84±0.01 1.81±0.02a1.71±0.02a1.53±0.02abcd93.68±3.30 92.24±2.55a87.30±2.64a77.93±2.97abcd

    2.2 AnnexinⅤ/PI檢測HPMVEC凋亡 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL TNF-α處理組與空白對照組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而100 ng/mL TNF-α處理組的細胞凋亡率最高(P<0.01),TNF-α對細胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)劑量依賴關系,見表2。

    表2 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的凋亡率檢測(n=3,±s)

    表2 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的凋亡率檢測(n=3,±s)

    組別空白對照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL細胞凋亡率(%) 0.00±0.005 5.57±0.23a6.69±0.17ab8.67±0.25abc10.76±0.25abcd

    2.3 HPMVEC的Caspase-3活性檢測 10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL TNF-α處理組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為43.85、96.24、26.45,P值分別為0.000 5、0.000 1、0.001,P<0.05),而100 ng/mL TNF-α處理組的Caspase-3活性最高(t=16.77,P= 0.004),隨著時間的延長,Caspase-3活性逐漸升高,與空白對照組比較,100 ng/mL TNF-α組在24 h時Caspase-3的活性最高(t=62.06,P=0.003),見表3。

    表3 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的Caspase-3活性檢測(n=3,±s)

    表3 不同劑量TNF-α刺激下HPMVEC的Caspase-3活性檢測(n=3,±s)

    注:與空白對照組比較,aP<0.05;與10 ng/mL TNF-α組比較,bP<0.05;與20 ng/mL TNF-α組比較,cP<0.05;與50 ng/mL TNF-α組比較,dP<0.05;與0 h組比較,eP<0.05;與6 h組比較,fP<0.05;與12 h組比較,gP<0.05。

    組別Caspase-3活性(%) 0 h 6 h 12 h 24 h空白對照組TNF-α處理組10 ng/mL 20 ng/mL 50 ng/mL 100 ng/mL 0.39±0.184.98±0.585.79±0.386.03±0.38 15.36±0.92aefg17.37±0.92aefg24.56±0.77abcefg25.39±0.59abcdef5.2±0.33a5.98±0.16a8.12±0.47abc11.33±1.00abcd9.2±0.56ae10.52±0.82ae13.39±1.00abce16.65±0.72abcde10.97±0.97ae14.05±0.55abef16.85±0.85abcef23.60±0.80abcdef

    3 討 論

    COPD是常見的呼吸系統(tǒng)疾病,其發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢,目前已成為全球第四大致死性病因[8]。PH是其重要的合并癥,炎癥反應是COPD患者形成PH的重要因素[9],炎癥引起的血管內皮細胞凋亡是PH發(fā)生的重要機制[10]。近年來,有關于血管內皮細胞凋亡與PH之間的研究逐漸增多[11-13]。

    本實驗發(fā)現(xiàn),10 ng/mL的TNF-α即可引起HPMVEC發(fā)生凋亡,隨著TNF-α濃度的增加,HPMVEC凋亡率亦增加;100 ng/mL的TNF-α作用于HPMVEC時,細胞凋亡率最高,TNF-α對細胞活性的抑制與TNF-α劑量呈現(xiàn)出劑量依賴關系。Chen等[14]研究也支持本實驗的結果。Kim等[15]發(fā)現(xiàn),細胞凋亡的增加與Caspase-3的表達增強相關。

    筆者進一步探討了TNF-α誘導HPMVEC凋亡的分子機制。目前研究發(fā)現(xiàn),血管內皮細胞凋亡主要有兩條信號轉導通路,分別由Caspase-8激活的外源性途徑即死亡受體途徑及Caspase-9激活的細胞內在途徑即線粒體通路,而兩者最終均需要通過激活Caspase-3來實現(xiàn),因此,目前認為,Caspase-3是血管內皮細胞發(fā)生凋亡的標志物。本實驗結果發(fā)現(xiàn),隨著TNF-α作用濃度的增加及時間的延長,Caspase-3的活性表達亦隨之增強,Caspase-3的活性表達與HPMVEC凋亡率的增加呈正相關關系。與Ohtsubo等[16]研究結果相符合。有關于血管內皮細胞凋亡信號通路的探討是近年來PH的研究熱點,除了 Caspase-3通路,還包括 PI3K/AKT[17]、P38MAPK[18]及STAT3[19-20]等通路途徑。在未來的研究中,我們將進一步探討Caspase-3的上游信號通路,進一步了解TNF-α誘導HPMVEC凋亡的完整信號分子傳導途徑。

    綜上所述,筆者認為TNF-α可誘導HPMVEC發(fā)生凋亡,并且這一凋亡作用呈現(xiàn)濃度依賴性。而在細胞凋亡過程中,Caspase-3的活性表達增強,因此,TNF-α誘導HPMVEC凋亡可能與上調Caspase-3的活性表達有關。

    [1]Hayes D Jr,Black SM,Tobias JD,et al.Prevalence of pulmonary hypertension and its influence on survival in patients with advanced chronic obstructive pulmonary disease prior to lung transplantation [J].COPD,2016,13(1):50-56.

    [2]Li S,Xu J,Yao W,et al.Sevoflurane pretreatment attenuates TNF-α-induced human endothelial cell dysfunction through activating eNOS/ NO pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,460(3): 879-886.

    [3]Yamaji-Kegan K,Takimoto E,Zhang A,et al.Hypoxia-induced mitogenic factor(FIZZ1/RELMα)induces endothelial cell apoptosis and subsequent interleukin-4-dependent pulmonary hypertension[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2014,306(12):L1090-L1103.

    [4] Choudhary GS,Al-Harbi S,Almasan A.Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[M].New York:Methods Mol Biol,2015:1-9.

    [5]吳云飛,鄭維銀,李焰.Caspase-3在血管內皮細胞凋亡中的作用研究進展[J].西南軍醫(yī),2013,15(4):408-411.

    [6]馮永東,陶德定,謝大興,等.流式細胞術檢測胱氡肽酶3原位激活與兩種檢測細胞凋亡方法的比較性研究[J].中華檢驗醫(yī)學雜志, 2004,27(9):582-585.

    [7] Porter AG,J?nicke RU.Emerging roles of Caspase-3 in apoptosis [J].Cell Death Differ,1999,6(2):99-104.

    [8] Vijayan VK.Chronic obstructive pulmonary disease[J].Indian J Med Res,2013,137(2):251-269.

    [9]李雪英.慢性阻塞性肺病相關肺動脈高壓與炎癥反應[J].臨床肺科雜志,2014,19(5):900-902.

    [10]Sage E,Mercier O,Van den Eyden F,et al.Endothelial cell apoptosis in chronically obstructed and reperfused pulmonary artery[J].Respiratory Research,2008,9:19.

    [11]Tian W,Jiang X,Tamosiuniene R,et al.Blocking macrophage leukotriene b4 prevents endothelial injury and reverses pulmonary hypertension[J].Sci Transl Med,2013,5(200):2418-2419.

    [12]Cao Y,Jiang Z,Zeng Z,et al.Bcl-2 silencing attenuates hypoxia-induced apoptosis resistance in pulmonary microvascular endothelial cells[J].Apoptosis,2016,21(1):69-84.

    [13]Liu P,Zhang HM,Tang YJ,et al.Influence of Rho kinase inhibitor fasudil on late endothelial progenitor cells in peripheral blood of COPD patients with pulmonary artery hypertension[J].Bratisl Lek Listy,2015,116(3):150-153.

    [14]Chen TG,Zhong ZY,Sun GF,et al.Effects of tumour necrosis factor-alpha on activity and nitric oxide synthase of endothelial progenitor cells from peripheral blood[J].Cell Prolif,2011,44(4): 352-359.

    [15]Kim KC,Lee JC,Lee H,et al.Changes in Caspase-3,B cell leukemia/lymphoma-2,interleukin-6,tumor necrosis factor-α and vascular endothelial growth factor gene expression after human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells transfusion in pulmonary hypertension rat models[J].Korean Circ J,2016,46(1): 79-92.

    [16]Ohtsubo H,Ichiki T,Imayama I,et al.Involvement of Mst1 in tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis of endothelial cells[J/OL].Biochem Biophys Res Commun,2008,367(2):474-480.

    [17]Wang J,Chen Y,Yang Y,et al.Endothelial progenitor cells and neural progenitor cells synergistically protect cerebral endothelial cells from Hypoxia/reoxygenation-induced injury via activating the PI3K/Akt pathway[J].Mol Brain,2016,9(1):1-12.

    [18]曾海龍,黃志秋,張藝能,等.p38MAPK/eNOS信號通道在胰高血糖素樣肽-1抑制AGEs誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡中的作用[J].南方醫(yī)科大學學報,2016,36(1):116-119.

    [19]Bader AM,Brodarac A,Klose K,et al.Cord blood mesenchymal stromal cell-conditioned medium protects endothelial cells via STAT3 signaling[J].Cell Physiol Biochem,2014,34(3):646-657.

    [20]Zhang S,Patel A,Moorthy B,et al.Adrenomedullin deficiency potentiates hyperoxic injury in fetal human pulmonary microvascularendothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,464(4): 1048-1053.

    Caspase-3 activity in TNF-α-induced apoptosis of human pulmonary microvascular endothelial cells.

    JI Sheng-jun1,YE Zhi-jian1,CHEN Yao-feng1,LIU Jian1,ZHANG Pei-fang1,ZHENG Shao-xin2.1.Department of Respiratory Medicine,the First People's Hospital of Foshan,Foshan 528000,Guangdong,CHINA;2.Department of Cardiology,Sun Yat-sen Memorial Hospital of the Sun Yat-sen University,Guangzhou 510120,Guangdong,CHINA

    ObjectiveTo investigate the change of Caspase-3 activity in tumor necrosis factor-α(TNF-α)induced apoptosis of human pulmonary microvascular endothelial cells(HPMVECs).MethodsHPMVECs were cultured in vitro.The blank control was treated in a carbon dioxide incubator.HPMVECs were treated by TNF-α at the concentration of 10 ng/mL,20 ng/mL,50 ng/mL,or 100 ng/mL.The activity of cells,apoptosis rate,as well as the expressions of Caspase-3 in HPMVECs were determined respectively by MTT cell viability assay,flow cytometric analysis with dual Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)staining and flow cytometry.ResultsApoptosis rate of cell and Caspase-3 activity were the lowest in the blank control group.Compared with the other groups(10 ng/mL,20 ng/mL,50 ng/mL),the Caspase-3 activity and apoptosis rate of cell in 100 ng/mL TNF-α group were highest,and with the lowest cell activity. The inhibition of TNF-α-induced cell activity was a manner of dose-dependent.The Caspase-3 activity increased gradually with time(P<0.05).ConclusionTNF-α-induced apoptosis of HPMVEC is a manner of dose-dependent,and Caspase-3 may be taking part in the control of apoptosis process.

    Tumor necrosis factor-α(TNF-α);Human pulmonary microvascular endothelial cells(HPMVECs);Apoptosis;Caspase-3

    R329.2+7

    A

    1003—6350(2016)14—2237—04

    2016-02-23)

    國家自然科學基金(編號:81400251);廣東省佛山市衛(wèi)生及計生局醫(yī)學科研立項課題(編號:2015255)

    鄭韶欣。E-mail:schwannnn@163.com

    猜你喜歡
    微血管空白對照內皮細胞
    乙型肝炎病毒與肝細胞癌微血管侵犯的相關性
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實驗教學中的應用
    淺議角膜內皮細胞檢查
    過表達H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內文第 96 ~ 101 頁)圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    雌激素治療保護去卵巢對血管內皮細胞損傷的初步機制
    細胞微泡miRNA對內皮細胞的調控
    8 種外源激素對當歸抽薹及產(chǎn)量的影響
    IMP3在不同宮頸組織中的表達及其與微血管密度的相關性
    上皮性卵巢癌組織中miR-126、EGFL7的表達與微血管密度的檢測
    精品国产一区二区三区久久久樱花| 69精品国产乱码久久久| 美女福利国产在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 麻豆av在线久日| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 丰满的人妻完整版| 免费观看人在逋| 久久久国产成人免费| 国产成人免费观看mmmm| 咕卡用的链子| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 他把我摸到了高潮在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲avbb在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 成年人黄色毛片网站| 久久精品91无色码中文字幕| 18禁美女被吸乳视频| 91成年电影在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 人妻一区二区av| 在线观看免费视频网站a站| 日本五十路高清| 精品亚洲成a人片在线观看| 好男人电影高清在线观看| 亚洲 国产 在线| 天天影视国产精品| 午夜福利,免费看| 久久99一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩黄片免| 另类亚洲欧美激情| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | a在线观看视频网站| 大片电影免费在线观看免费| 色老头精品视频在线观看| 午夜免费成人在线视频| 久久中文字幕人妻熟女| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品久久久久久精品古装| 国产免费av片在线观看野外av| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产亚洲欧美98| 真人做人爱边吃奶动态| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲av美国av| 久9热在线精品视频| 黄色怎么调成土黄色| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 搡老乐熟女国产| 一二三四在线观看免费中文在| 日本欧美视频一区| 亚洲黑人精品在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久久久久久精品吃奶| 91麻豆av在线| 国产精品久久久久成人av| 十八禁高潮呻吟视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品高清国产在线一区| 精品亚洲成国产av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品永久免费网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 黄色女人牲交| 大香蕉久久成人网| 国精品久久久久久国模美| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美大码av| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日韩欧美免费精品| 精品欧美一区二区三区在线| 又紧又爽又黄一区二区| www.999成人在线观看| 久久中文字幕一级| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲av片天天在线观看| 久久久久久久国产电影| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 91九色精品人成在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 国产有黄有色有爽视频| 热99re8久久精品国产| 亚洲色图综合在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 18禁美女被吸乳视频| 成人三级做爰电影| 一边摸一边做爽爽视频免费| 啦啦啦 在线观看视频| 久久久国产成人免费| 免费观看精品视频网站| 日本黄色视频三级网站网址 | 中文字幕高清在线视频| 99久久人妻综合| 免费高清在线观看日韩| 国产亚洲欧美精品永久| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美午夜高清在线| 免费在线观看黄色视频的| 国产1区2区3区精品| 丝袜在线中文字幕| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品国产一区二区久久| 岛国在线观看网站| 精品一区二区三卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 人人澡人人妻人| 在线观看www视频免费| 亚洲成人国产一区在线观看| 午夜精品在线福利| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美av亚洲av综合av国产av| 成年人免费黄色播放视频| 后天国语完整版免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 国产男靠女视频免费网站| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产单亲对白刺激| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 精品高清国产在线一区| 无遮挡黄片免费观看| 男女下面插进去视频免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 一二三四在线观看免费中文在| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 99久久国产精品久久久| 757午夜福利合集在线观看| 两个人免费观看高清视频| 日韩大码丰满熟妇| 看黄色毛片网站| 国产精品久久久av美女十八| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄片播放在线免费| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 午夜久久久在线观看| 久久国产精品影院| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 身体一侧抽搐| 免费观看人在逋| 多毛熟女@视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品高清国产在线一区| 两个人免费观看高清视频| 两性夫妻黄色片| 热re99久久国产66热| 国产精品久久久av美女十八| 国产色视频综合| 99精品在免费线老司机午夜| 波多野结衣av一区二区av| 精品福利永久在线观看| 91老司机精品| 精品久久久久久,| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久久久久免费视频了| 精品电影一区二区在线| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 在线观看一区二区三区激情| 午夜精品在线福利| 欧美国产精品va在线观看不卡| 午夜福利一区二区在线看| 两性夫妻黄色片| 午夜日韩欧美国产| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产有黄有色有爽视频| 黄色怎么调成土黄色| 国产日韩欧美亚洲二区| 夜夜爽天天搞| 一级毛片精品| av在线播放免费不卡| 国产黄色免费在线视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 天天影视国产精品| 国产精品偷伦视频观看了| 看黄色毛片网站| 美女午夜性视频免费| 一级,二级,三级黄色视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲专区中文字幕在线| 久久久久久久久久久久大奶| 在线观看舔阴道视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久性视频一级片| 久久精品国产综合久久久| 成年动漫av网址| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 丝袜人妻中文字幕| 国产在视频线精品| 十八禁网站免费在线| 99热网站在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 午夜福利免费观看在线| 国产人伦9x9x在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 最近最新免费中文字幕在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久热这里只有精品99| av福利片在线| 亚洲欧美激情在线| 高清黄色对白视频在线免费看| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品久久久av美女十八| 国产成人av教育| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 精品国产国语对白av| 精品一品国产午夜福利视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 香蕉丝袜av| 国产在线精品亚洲第一网站| 搡老岳熟女国产| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美性长视频在线观看| av有码第一页| 午夜成年电影在线免费观看| videos熟女内射| 大香蕉久久成人网| 99国产精品一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| www.精华液| 欧美日韩亚洲高清精品| 中国美女看黄片| 午夜日韩欧美国产| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美日韩乱码在线| 男男h啪啪无遮挡| 他把我摸到了高潮在线观看| 老司机福利观看| 国产精品久久久久久精品古装| 在线看a的网站| 丁香六月欧美| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产真人三级小视频在线观看| 69精品国产乱码久久久| 亚洲熟女毛片儿| 51午夜福利影视在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲人成伊人成综合网2020| 一区二区三区激情视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲av成人av| 欧美久久黑人一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 嫩草影视91久久| 大香蕉久久成人网| 又紧又爽又黄一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 岛国在线观看网站| 国产伦人伦偷精品视频| 看黄色毛片网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美另类亚洲清纯唯美| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日韩一级在线毛片| 中文亚洲av片在线观看爽 | 身体一侧抽搐| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲视频免费观看视频| 777米奇影视久久| 少妇粗大呻吟视频| 丝袜人妻中文字幕| 下体分泌物呈黄色| 男女之事视频高清在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 男女床上黄色一级片免费看| 久久影院123| 亚洲国产精品sss在线观看 | 高清在线国产一区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 桃红色精品国产亚洲av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄色视频,在线免费观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲中文字幕日韩| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日本黄色日本黄色录像| xxx96com| 亚洲,欧美精品.| 亚洲avbb在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 大码成人一级视频| 国产精品久久久av美女十八| 精品欧美一区二区三区在线| 国产成人系列免费观看| 国产亚洲欧美98| 男人舔女人的私密视频| 久久久国产成人免费| 午夜两性在线视频| 1024视频免费在线观看| 下体分泌物呈黄色| 中亚洲国语对白在线视频| 免费日韩欧美在线观看| 日韩欧美免费精品| 欧美乱色亚洲激情| 黄色视频,在线免费观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| a级片在线免费高清观看视频| 一级片'在线观看视频| 十八禁高潮呻吟视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 免费在线观看黄色视频的| 欧美日韩黄片免| 超色免费av| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产成人精品在线电影| 99国产精品99久久久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产1区2区3区精品| 久久久久精品人妻al黑| 黄色a级毛片大全视频| 午夜免费观看网址| 黄色丝袜av网址大全| 精品视频人人做人人爽| 人妻久久中文字幕网| 国产野战对白在线观看| 操美女的视频在线观看| 韩国精品一区二区三区| 国产成人av教育| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 亚洲中文日韩欧美视频| 国产三级黄色录像| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲久久久国产精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产免费av片在线观看野外av| 国产男女内射视频| 精品一品国产午夜福利视频| 色尼玛亚洲综合影院| av欧美777| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜福利一区二区在线看| 成人18禁在线播放| 黄片小视频在线播放| 正在播放国产对白刺激| 欧美激情 高清一区二区三区| 最新美女视频免费是黄的| 久久久精品免费免费高清| 亚洲综合色网址| tube8黄色片| 久久久国产成人精品二区 | 日韩视频一区二区在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 91成年电影在线观看| 在线国产一区二区在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 热re99久久国产66热| 久久久国产精品麻豆| 99国产精品99久久久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 一级,二级,三级黄色视频| 午夜激情av网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久午夜亚洲精品久久| 美女视频免费永久观看网站| 一区在线观看完整版| 热re99久久精品国产66热6| a在线观看视频网站| 精品国产亚洲在线| 一区二区三区精品91| 女同久久另类99精品国产91| 桃红色精品国产亚洲av| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久99久视频精品免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 首页视频小说图片口味搜索| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产1区2区3区精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品国产国语对白av| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲色图av天堂| 亚洲黑人精品在线| 在线观看www视频免费| 男人操女人黄网站| 黄色 视频免费看| 久99久视频精品免费| 激情视频va一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 一级毛片精品| 脱女人内裤的视频| 999久久久精品免费观看国产| 天堂动漫精品| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品久久久久久精品古装| 一二三四社区在线视频社区8| 精品久久久久久电影网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久午夜亚洲精品久久| 香蕉久久夜色| 一二三四社区在线视频社区8| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品国产av在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 国产99久久九九免费精品| 国产精品九九99| 男男h啪啪无遮挡| 大陆偷拍与自拍| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品福利观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 精品国产乱码久久久久久男人| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲av欧美aⅴ国产| 麻豆乱淫一区二区| 日韩有码中文字幕| 免费看a级黄色片| 欧美黄色淫秽网站| 国产淫语在线视频| 搡老乐熟女国产| 天堂√8在线中文| 在线国产一区二区在线| 欧美在线一区亚洲| 麻豆乱淫一区二区| 日本一区二区免费在线视频| 涩涩av久久男人的天堂| 人妻久久中文字幕网| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产1区2区3区精品| 午夜亚洲福利在线播放| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费av中文字幕在线| 午夜福利,免费看| 看黄色毛片网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲中文字幕日韩| aaaaa片日本免费| av欧美777| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩黄片免| 无人区码免费观看不卡| 成年动漫av网址| 精品久久久久久久久久免费视频 | a级毛片在线看网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品国产一区二区久久| 欧美黑人精品巨大| 我的亚洲天堂| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲欧美激情在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 午夜免费鲁丝| 午夜亚洲福利在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费少妇av软件| 9色porny在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 黄色成人免费大全| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜福利欧美成人| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产视频一区二区在线看| 在线观看免费午夜福利视频| 国产又爽黄色视频| 免费观看精品视频网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 很黄的视频免费| 一区福利在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费 | 欧美成狂野欧美在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲中文av在线| www日本在线高清视频| 18在线观看网站| 99国产极品粉嫩在线观看| www.精华液| 国产三级黄色录像| 色老头精品视频在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 国产高清国产精品国产三级| 露出奶头的视频| 国产乱人伦免费视频| tocl精华| 午夜福利视频在线观看免费| 黄片播放在线免费| 91av网站免费观看| 亚洲精品国产区一区二| 女人精品久久久久毛片| 久久中文看片网| 一本综合久久免费| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产男靠女视频免费网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产免费现黄频在线看| 黄色成人免费大全| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜免费成人在线视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲第一av免费看| 一夜夜www| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一级a爱视频在线免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久草成人影院| 嫩草影视91久久| 一级作爱视频免费观看| 国产乱人伦免费视频| 在线观看免费视频网站a站| 日韩欧美在线二视频 | 亚洲五月婷婷丁香| 欧美日韩黄片免| 在线观看日韩欧美| 婷婷成人精品国产| 两性夫妻黄色片| 老汉色∧v一级毛片| 黄片大片在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲国产精品合色在线| 1024视频免费在线观看| 久久国产精品影院| 国产精品 国内视频| 色老头精品视频在线观看| 男女免费视频国产| 国产乱人伦免费视频| 久久久久国内视频| 国产精品久久久久久精品古装| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久久国产欧美日韩av| 国产激情久久老熟女| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美久久黑人一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 看片在线看免费视频| 香蕉丝袜av| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 51午夜福利影视在线观看| av免费在线观看网站| 久久性视频一级片| av天堂在线播放| 大片电影免费在线观看免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产精品 国内视频| 身体一侧抽搐| 成人黄色视频免费在线看| 两人在一起打扑克的视频| 新久久久久国产一级毛片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线视频色国产色| 国产精品永久免费网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美性长视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 一进一出好大好爽视频| av一本久久久久| 亚洲av美国av| 黑人操中国人逼视频| 亚洲av熟女| 动漫黄色视频在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 高清视频免费观看一区二区| 色综合婷婷激情| 色精品久久人妻99蜜桃|