嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)免疫療法：絕處逢生的利劍

蔡亮，張凌華，楊子杰，裘麗珍

復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，上海 200433

嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)免疫療法：絕處逢生的利劍

蔡亮?，張凌華，楊子杰，裘麗珍

復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，上海 200433

癌癥，因癌細(xì)胞的內(nèi)源性、異質(zhì)性和突變抗藥性而難以治愈，被稱為“不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞損傷”。目前癌癥治療的常規(guī)方法包括手術(shù)、放療和化療，都不能達(dá)到徹底治愈的效果。同時(shí)，放療和化療都會(huì)對(duì)機(jī)體的正常細(xì)胞，尤其是生長(zhǎng)分裂旺盛的細(xì)胞，如造血干細(xì)胞造成損傷。癌癥干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)的存在，也給術(shù)后的復(fù)發(fā)增添了風(fēng)險(xiǎn)。作為一種針對(duì)人體免疫系統(tǒng)而非針對(duì)腫瘤的療法，癌癥免疫療法(cancer immunotherapy)近年來(lái)取得的一系列突破性成果得到了廣泛的關(guān)注。

背景：癌癥免疫療法與T細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)共信號(hào)機(jī)制

在詳細(xì)說(shuō)明癌癥免疫療法的原理以及嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)技術(shù)的發(fā)展之前，需要闡明T細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)共信號(hào)機(jī)制。

T細(xì)胞的激活依靠“雙信號(hào)”進(jìn)行精確調(diào)控。一個(gè)特異性激活信號(hào)是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)和T細(xì)胞受體(TCR)的結(jié)合，另一個(gè)則是來(lái)自共刺激信號(hào)受體CD28、CD134(OX40)或CD137 (4-1BB)的刺激信號(hào)，或者是來(lái)自共抑制信號(hào)受體CTLA4或PD-1的抑制信號(hào)。如果把共刺激信號(hào)比作汽車的“油門”，共抑制信號(hào)就好比是“剎車”。T細(xì)胞的免疫檢查點(diǎn)就是一類抑制性的分子，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來(lái)避免對(duì)正常細(xì)胞造成破壞，而癌細(xì)胞往往利用這一機(jī)制來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，如過(guò)表達(dá)PD-1的配體PD-L1。

癌癥免疫療法主要分為兩類。一類是干預(yù)療法，即開(kāi)發(fā)免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor)。以共抑制信號(hào)受體CTLA4、PD-1或PD-1的配體PD-L1為靶標(biāo)設(shè)計(jì)抗體，再將抗體注射到病人體內(nèi)。已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)的藥物如施貴寶公司的Yervoy (Ipilimumab, anti-CTLA4)，Opdivo (Nivolumab, anti-PD1)和默沙東公司的Keytruda (Pembrolizumab, anti-PD-1)。這一療法通過(guò)使T細(xì)胞跳過(guò)免疫檢查點(diǎn)來(lái)增強(qiáng)整個(gè)機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷功能，但這種療法的一個(gè)缺點(diǎn)是殺傷的特異性不夠高。另一類為細(xì)胞療法，即體外激活或改造病人的免疫細(xì)胞，再將其回輸入病人體內(nèi)，達(dá)到增強(qiáng)免疫功能或特異性識(shí)別癌細(xì)胞表面抗原，進(jìn)而清除癌細(xì)胞的目的。之前的細(xì)胞療法，如淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)療法，細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞(CIK)療法，細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞混合(CIK-DC)療法，由于前述的免疫檢查點(diǎn)共信號(hào)機(jī)制的存在，即使被激活也會(huì)在檢查點(diǎn)被阻斷，不能起到很好的療效。直到CAR-T的出現(xiàn)，細(xì)胞療法才取得了突破性進(jìn)展。

原理：嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)免疫療法

嵌合抗原受體，也稱作人工抗原受體(arti fi cial T cell receptor)。顧名思義，就是一類經(jīng)人工改造，由胞外抗原結(jié)合域、跨膜哉和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域組成，集特異性識(shí)別靶向腫瘤抗原和激活T細(xì)胞兩種作用于一身的T細(xì)胞受體。胞外抗原結(jié)合域通常來(lái)源于單克隆抗體的單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)，胞內(nèi)信號(hào)域?yàn)槊庖呤荏w酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，通常為CD3ζ或FcεRIγ。由于CD3ζ含有3個(gè)ITAM，相比于只含有1個(gè)ITAM的FcεRIγ能更有效地激活T細(xì)胞，所以把CD3ζ作為胞內(nèi)域的CAR更常見(jiàn)。CAR-T技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展了三代。第一代CAR在胞內(nèi)只有一個(gè)CD3ζ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域，由于沒(méi)有共刺激信號(hào)域(costimulatory domain)，不能使T細(xì)胞完全活化，無(wú)法達(dá)到理想的臨床效果。在此基礎(chǔ)上，第二代CAR的胞內(nèi)域引入了1個(gè)共刺激信號(hào)受體CD28的胞內(nèi)信號(hào)域。第三代則增加到2個(gè)共刺激信號(hào)域，在CD28胞內(nèi)信號(hào)域的基礎(chǔ)上又引入CD134或CD137的胞內(nèi)信號(hào)域。來(lái)自CD28和TCR的激活信號(hào)足以使T細(xì)胞產(chǎn)生多種白介素，尤其是IL-6。目前，用于臨床的主要為第二代CAR-T技術(shù)(圖1)。

CAR-T臨床治療，作為前述的癌癥免疫的細(xì)胞療法，需要從癌癥患者身上分離T細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染使患者的T細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)CAR-T，并在體外大量擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞，最后將擴(kuò)增好的CAR-T細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。

圖1 第二代嵌合抗原受體(CAR)結(jié)構(gòu)示意圖(圖片來(lái)源：https://junotherapeutics com/our-science/car-technology/)

與傳統(tǒng)的T細(xì)胞識(shí)別抗原相比，CAR識(shí)別腫瘤抗原繞過(guò)了抗原提呈階段，無(wú)需MHC的限制。同時(shí)CAR擁有增加的共刺激信號(hào)來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷性，因此CAR-T可以克服腫瘤細(xì)胞下調(diào)MHC、減少共刺激信號(hào)分子表達(dá)等免疫逃逸機(jī)制對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)帶來(lái)的不利條件?？贵w通常在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)失去效力，然而CAR-T細(xì)胞則有望在體內(nèi)循環(huán)數(shù)年，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)。

應(yīng)用：CAR-T，血癌病人絕處逢生

目前CAR-T的臨床應(yīng)用主要集中于血系腫瘤上。已有47項(xiàng)CAR-T臨床研究報(bào)道了在血系腫瘤中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中對(duì)于B細(xì)胞惡性腫瘤的療效顯著。2014年發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，在30例不同類型的B細(xì)胞惡性腫瘤的CAR-T治療中，27例患者(90%)獲得完全緩解(complete response，CR)，20人(67%)在半年后復(fù)查仍無(wú)癌細(xì)胞復(fù)發(fā)[1]。然而通常情況下，這些病人的生存期不會(huì)超過(guò)半年。

不足：CAR-T，并非盡善盡美

筆者將現(xiàn)階段主要的腫瘤治療方法列表進(jìn)行了比較(表1)。

從中可以看出，CAR-T療法雖然有著對(duì)病人創(chuàng)傷較小、治療周期較短等優(yōu)點(diǎn)，但也不是盡善盡美的。作為一種療法，CAR-T的安全性是需要關(guān)注的大問(wèn)題。目前的第三代CAR-T臨床試驗(yàn)只有兩年多的時(shí)間，對(duì)于其是否能治愈癌癥，尚無(wú)定論。就目前的CAR-T應(yīng)用來(lái)看，這一療法仍存在很多不足之處。

首先從CAR-T原理所涉及的方面考慮，由于CAR-T細(xì)胞表達(dá)的是一個(gè)直接識(shí)別腫瘤抗原且具有共激活信號(hào)域的受體，它跳過(guò)了免疫檢查點(diǎn)的限制，很可能對(duì)正常細(xì)胞造成非期望的損傷，也就是脫靶效應(yīng)；而且腫瘤特異性抗原目前仍知之甚少，這就限制了CAR-T的臨床應(yīng)用。2010年，研究者采用ERBB2靶向的第三代CAR-T治療一例結(jié)腸癌并伴有肺、肝轉(zhuǎn)移的患者，1010個(gè)細(xì)胞輸注15 min后，大量CAR-T累積于肺部，攻擊低表達(dá)ERBB2的肺上皮細(xì)胞，并釋放細(xì)胞因子，使患者出現(xiàn)肺水腫癥狀，5天后死亡[4]。

目前CAR-T療法在針對(duì)以CD19為靶抗原的B細(xì)胞惡性腫瘤等血系腫瘤上取得了令人激動(dòng)的結(jié)果，而在實(shí)體瘤治療方面還沒(méi)有理想的療效。早在2006年，全球第一項(xiàng)CAR-T臨床試驗(yàn)即是針對(duì)實(shí)體瘤的，目前15項(xiàng)CAR-T治療實(shí)體瘤的臨床研究大部分采用的是第一代CAR-T。然而，由于實(shí)體瘤免疫抑制的微環(huán)境，免疫細(xì)胞不易進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部，以及清除實(shí)體瘤所需的T細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)超過(guò)血系腫瘤治療所需，因此CAR-T技術(shù)對(duì)于實(shí)體瘤的治療還有很長(zhǎng)的路要走。

表1 現(xiàn)階段腫瘤療法比較

其次，從CAR-T細(xì)胞的整個(gè)改造過(guò)程考慮，基因載體主要為轉(zhuǎn)染效率高的病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體和腺相關(guān)病毒(AAV)載體。除腺相關(guān)病毒在人體基因組的整合位點(diǎn)可以定向至19號(hào)染色體的AAVS位點(diǎn)外，另兩種病毒載體都沒(méi)有特異性的位點(diǎn)整合能力，這就可能導(dǎo)致基因的插入突變，或由于插入位置在某一基因的調(diào)控區(qū)而導(dǎo)致該基因的表達(dá)水平變化，進(jìn)而產(chǎn)生不可預(yù)知的后果。

T細(xì)胞的體外基因改造會(huì)造成T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后凋亡，使轉(zhuǎn)入的基因不能長(zhǎng)期表達(dá)。有報(bào)道表明，去除CD3ζ的2個(gè)ITAM域能夠減少T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后凋亡[2-3]，但由于1個(gè)ITAM域?qū)細(xì)胞的激活能力有限，所以目前的改造仍然是使T細(xì)胞表達(dá)具有3個(gè)ITAM域CD3ζ的CAR。然而這樣一來(lái)，CAR的表達(dá)率也會(huì)降低。所以篩選CAR-T的穩(wěn)定株就是一項(xiàng)艱巨的工程，在這之后還需要大量擴(kuò)增CAR-T至幾十億乃至上百億個(gè)克隆以回輸入病人體內(nèi)，以產(chǎn)生明顯的臨床效果。這一過(guò)程可謂是“路漫漫其修遠(yuǎn)兮”。

再者，從CAR-T的臨床治療階段考慮。大量的CAR-T細(xì)胞回輸入病人體內(nèi)，結(jié)合相關(guān)抗原被激活后會(huì)產(chǎn)生超量的細(xì)胞因子，引發(fā)細(xì)胞因子釋放綜合癥(cytokine release syndrome，CRS)，造成高燒不退、心跳過(guò)速等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。例如，2014年由美國(guó)斯隆-凱特琳癌癥中心主導(dǎo)的一項(xiàng)利用CAR-T治療非霍奇金氏淋巴瘤的早期研究疑因引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”而造成患者死亡。然而，有了一定的臨床經(jīng)驗(yàn)后，配合使用IL-6受體的抗體Tocilizumab可以使這一副反應(yīng)得到有效控制。

最后，從癌癥免疫療法的適用對(duì)象考慮，癌癥免疫療法不適用于有自身免疫疾病和需要使用免疫抑制類藥物的病人，不過(guò)此類病人在患者群中并非絕大多數(shù)。

此外，在醫(yī)療過(guò)程中還不得不考慮到社會(huì)問(wèn)題。CAR-T療法的一大弱點(diǎn)是費(fèi)用高，在療效相同的情況下與其他藥物的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)不明顯。由于癌癥免疫的細(xì)胞療法需要從病人體內(nèi)分離T細(xì)胞并在體外進(jìn)行基因改造和大量擴(kuò)增，這一療法實(shí)際上可以看作是一種基因治療。因此，CAR-T療法極其昂貴，治療一次的費(fèi)用為30萬(wàn)～50萬(wàn)美元，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了普通家庭的承擔(dān)能力。所以，從治療費(fèi)用的角度看，對(duì)于某些疾病如費(fèi)城染色體陽(yáng)性急性淋巴細(xì)胞白血病，CAR-T療法相比于小分子的靶向治療藥物格列衛(wèi)(Gleevec)并沒(méi)有太大優(yōu)勢(shì)。

前景：改進(jìn)CAR-T，使之真正成為利劍

然而，拋開(kāi)一切社會(huì)因素不談，科研工作者的第一要?jiǎng)?wù)是改良CAR-T，抓住一切能夠治愈癌癥的希望。

CAR-T療法的致命弱點(diǎn)有兩個(gè)：一是可能會(huì)引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”；二是特異性抗原難找。前者通過(guò)配合使用IL-6受體的抗Tocilizumab可以被控制，而后者要發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞表面特異的抗原，就沒(méi)有那么容易。難道我們要等到基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)了這些“新大陸”，再發(fā)展特異性強(qiáng)的CAR-T，讓這幾十年間成千上萬(wàn)的患者坐以待斃嗎？因此，我們需要把目光重新投到免疫檢查點(diǎn)共信號(hào)機(jī)制，以此發(fā)掘可能的改進(jìn)方案。

第二代和第三代CAR-T都采用了免疫共激活分子，沒(méi)有利用免疫共抑制分子進(jìn)行抗原特異性的免疫檢查。設(shè)想同時(shí)在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞表面表達(dá)的抗原A，和只在正常細(xì)胞表面表達(dá)的抗原B。如果使T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)識(shí)別A的CAR和識(shí)別B的iCAR，當(dāng)只有CAR與配體結(jié)合時(shí)激活T細(xì)胞，當(dāng)CAR和iCAR都與配體結(jié)合時(shí)，iCAR產(chǎn)生抑制信號(hào)阻斷CAR的作用，即可提高CAR-T的特異性(圖2)。iCAR有望在對(duì)抗實(shí)體瘤中發(fā)揮作用。

圖2 針對(duì)CAR特異性的改進(jìn)：iCAR(圖片來(lái)源：https://junotherapeutics.com/ourscience/car-technology/)

另一種策略是雙信號(hào)平衡機(jī)制，需要CAR的活化信號(hào)分別在兩個(gè)受體上表達(dá)。如果抗原A和B同時(shí)表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，而不同時(shí)表達(dá)于正常細(xì)胞表面，就可通過(guò)A和B受體的同時(shí)激活使得T細(xì)胞活化，而只有A或B受體的激活不能使T細(xì)胞活化[5]。

除此之外，提高體外改造T細(xì)胞的效率也十分重要。選擇高效、細(xì)胞毒性小、能夠定點(diǎn)整合的基因載體，提高T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染后生存率，以及改造CAR使之能夠在T細(xì)胞中高效表達(dá)并提高CAR本身的穩(wěn)定性，都是CAR-T這一技術(shù)需要改進(jìn)的方面。

(2016年2月19日收稿)

[1] MAUDE S L, FREY N, SHAW P A, et al. Chimeric antigen T cells for sustained remissions in leukemia [J]. The New England Journal of Medicine, 2014, 371(16): 1507-1517.

[2] HEUSER C, HOMBACH A, L?SCH C, et al. T-cell activation by recombinant immunore ceptors: Impact of the intracellular signalling domain on the stability of receptor expression and antigen-speciic activation of grafted T cells [J]. Gene Therapy, 2003, 10(17): 1408-1419.

[3] ZHAO Y, WANG Q J, YANG S, et al. A herceptin-based chimeric antigen receptor with modi fi ed signaling domains leads to enhanced survival of transduced T lymphocytes and antitumor activity [J]. The Journal of Immunology, 2009, 183(9): 5563-5574.

[4] PEGRAM H J, PARK J H, BRENTJENS R J. CD28z CARs and armored CARs [J].The Cancer Journal, 2014, 20(2): 127-133.

[5] MORGAN R A, YANG J C, KITANO M, et al. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizingERBB2 [J]. Molecular Therapy, 2010, 18(4): 843-851.

(編輯：段艷芳)

Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy: A new approach to cancer therapy

CAI Liang, ZHANG Linghua, YANG Zijie，QIU Lizhen
Fudan University, Shanghai 200433, China

10.3969/j.issn.0253-9608.2016.03.011

?通信作者，E-mail: cell@fudan.edu.cn