神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離鑒定及其生物學(xué)特性初探

李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

·實(shí)驗(yàn)研究·

神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離鑒定及其生物學(xué)特性初探

李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

目的探討神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離鑒定及其生物學(xué)特性。方法采取流式細(xì)胞儀分選神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中的側(cè)群細(xì)胞作為觀察組,非側(cè)群細(xì)胞作為對照組,經(jīng)3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)法對細(xì)胞生長曲線進(jìn)行繪制,對細(xì)胞克隆形成能力、球囊形成能力、細(xì)胞成瘤能力以及細(xì)胞CD133的表達(dá)進(jìn)行檢測分析。結(jié)果神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞所占比例為(4.32±1.41)%；側(cè)群細(xì)胞生長速度較非側(cè)群細(xì)胞快(P＜0.05)；在無血清條件下培養(yǎng),側(cè)群細(xì)胞具有形成球囊的特性,非側(cè)群細(xì)胞無此特性；側(cè)群細(xì)胞克隆形成率高于非側(cè)群細(xì)胞(P＜0.05)；側(cè)群細(xì)胞CD133表達(dá)水平高于非側(cè)群細(xì)胞(P＜0.05)。結(jié)論在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在有典型的側(cè)群細(xì)胞,且側(cè)群細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD133呈現(xiàn)為高表達(dá),可以在側(cè)群細(xì)胞中分選富集神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞,值得關(guān)注。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；干細(xì)胞樣細(xì)胞；側(cè)群細(xì)胞；干細(xì)胞標(biāo)志蛋白

本次研究中,出于對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離鑒定及其生物學(xué)特性進(jìn)行分析探討,采取流式細(xì)胞儀分選神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中的側(cè)群細(xì)胞和非側(cè)群細(xì)胞進(jìn)行了觀察分析,結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 所需試劑包括有鏈霉素、青霉素、Hoechst 33342、MTT、 胎牛血清、干細(xì)胞培養(yǎng)基、PRMI 1640培養(yǎng)基、FITC-CD133 抗體。

1.2 細(xì)胞系 取神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞,在37℃、 濃度為15%的二氧化碳條件下,在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml鏈霉素、PRMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

腫瘤的球囊培養(yǎng)采取干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基,按照說明書進(jìn)行操作,每3天加1次表皮細(xì)胞生長因子(EGF),劑量為20 ng/ml,堿性成纖維生長因子(b FGF)劑量為20 ng/ml,1×B27。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇BALB/c-nu裸鼠20只,鼠齡為5～6周,體重20～25 g,在沒有特殊病原體的條件下進(jìn)行飼養(yǎng),分選側(cè)群與非側(cè)群細(xì)胞,分別取103、104、105、106四組,每組中包括有5只裸鼠,在裸鼠皮下接種,1個(gè)月后將裸鼠處死,并對成瘤率進(jìn)行計(jì)算。

1.4 流式細(xì)胞儀分選側(cè)群細(xì)胞 選擇對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞,將其制備成單細(xì)胞懸液,并將細(xì)胞濃度調(diào)整至106/ml,而后加入Hoechst 33342,最終濃度為5mg/L,另外選取1ml細(xì)胞,加入維拉帕米,最終濃度為50mg/L,反應(yīng)30min后,繼續(xù)加入Hoechst 33342 作為對照。在37℃條件下,避光染色9min,染色過程中不斷搖晃,將細(xì)胞搖勻,避免發(fā)生沉淀。而后經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行側(cè)群細(xì)胞分選［1,2］。

而后經(jīng)MTT 法繪制細(xì)胞生長曲線,平板克隆法對細(xì)胞克隆形成能力進(jìn)行檢測,無血清懸浮培養(yǎng)對細(xì)胞的球囊形成能力進(jìn)行觀察,裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞的成瘤能力進(jìn)行檢測,流式細(xì)胞儀對細(xì)胞CD133的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 側(cè)群細(xì)胞分選 神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞所占比例為(4.32±1.41)%,而加入維拉帕米進(jìn)行抑制后,側(cè)群細(xì)胞所占比例在降至(0.05±0.02)%。

2.2 側(cè)群細(xì)胞與非側(cè)群細(xì)胞增殖速度 側(cè)群細(xì)胞與非側(cè)群細(xì)胞在2、4 d的生長速度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),在6、8、10 d時(shí),側(cè)群細(xì)胞生長速度增加,較非側(cè)群細(xì)胞快(P＜0.05)。見圖1。

圖1 側(cè)群細(xì)胞與非側(cè)群細(xì)胞增殖速度比較

2.3 側(cè)群細(xì)胞與非側(cè)群細(xì)胞球囊性生長以及克隆形成能力比較 在無血清條件下,側(cè)群細(xì)胞存在明顯的球囊形成特性,非側(cè)群細(xì)胞無此特性。常規(guī)條件下培養(yǎng),側(cè)群細(xì)胞克隆形成率為(32.08±6.1)%,非側(cè)群細(xì)胞的克隆形成率為(9.56±3.11)%,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 側(cè)群細(xì)胞與非側(cè)群細(xì)胞CD133表達(dá)情況 側(cè)群細(xì)胞CD133表達(dá)水平為(61.87±4.98)%,非側(cè)群細(xì)胞的CD133表達(dá)水平為(1.02±0.76)%,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有明顯的浸潤特征,中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的一種惡性腫瘤,手術(shù)治療無法徹底根除,即便是結(jié)合化療、放療,依舊存在腫瘤復(fù)發(fā)的可能性。曾有調(diào)查顯示［3］,神經(jīng)膠質(zhì)瘤在腦腫瘤中所占比例為40.00%～60.00%,為神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的一種的腫瘤,近幾年關(guān)于腫瘤治療的技術(shù)不斷改進(jìn),然而,對膠質(zhì)瘤治療的預(yù)后無明顯改善。目前關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究不斷深入,并獲得較好的成效。

本次研究中,采取流式細(xì)胞儀分選神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中的側(cè)群細(xì)胞和非側(cè)群細(xì)胞,并對其進(jìn)行了觀察分析,細(xì)胞生長曲線進(jìn)行繪制,對細(xì)胞克隆形成能力、球囊形成能力、細(xì)胞成瘤能力以及細(xì)胞CD133的表達(dá)進(jìn)行檢測,側(cè)群細(xì)胞生長速度較非側(cè)群細(xì)胞快(P＜0.05)；在無血清條件下培養(yǎng),側(cè)群細(xì)胞具有形成球囊的特性,非側(cè)群細(xì)胞無此特性；側(cè)群細(xì)胞克隆形成率高于非側(cè)群細(xì)胞(P＜0.05)；側(cè)群細(xì)胞CD133表達(dá)率高于非側(cè)群細(xì)胞(P＜0.05)。

總之,在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在有典型的側(cè)群細(xì)胞,且側(cè)群細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD133呈現(xiàn)為高表達(dá),可以在側(cè)群細(xì)胞中分選富集神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞,值得關(guān)注。

［1］陳宏頡,王守森,鄭兆聰,等.RNAi 抑制 STAT3 對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長抑制作用.中華神經(jīng)外科雜志,2011,27(9):964-968.

［2］仇波,張東勇,陶鈞,等.一種簡化改良的腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)方法.中國神經(jīng)腫瘤雜志,2011,9(1):7-11.

［3］Chen HJ,Wang SS,Zheng ZC,et al.The inhibition studyof STAT3 siRNA on glioblastoma stem cells.Chinese Journalof Neurosurgery,2011,27(9):964-968.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.09.215

2015-12-29］

450000 河南省鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)外科