陸地棉GhRACK1啟動(dòng)子的克隆與缺失分析

楊江濤　龐偉民　王旭靜　呂少溥　唐巧玲　王志興中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

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陸地棉GhRACK1啟動(dòng)子的克隆與缺失分析

楊江濤龐偉民王旭靜*呂少溥唐巧玲王志興*
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

摘要:在基因工程發(fā)展中, 有應(yīng)用前景的纖維特異表達(dá)啟動(dòng)子的缺乏是制約棉花纖維品質(zhì)改良的主要因素之一。本研究利用反向PCR方法克隆到陸地棉纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因GhRACK1的上游啟動(dòng)子GhRACK1-P。GhRACK1-P全長為1987 bp, 含有TATA-box、CAAT-box、MYB2和I-box等順式作用元件和調(diào)控元件。根據(jù)調(diào)控元件的分布對(duì)GhRACK1-P進(jìn)行不同程度的缺失, 獲得了p1、p2、p3和p4缺失體; 構(gòu)建不同缺失體和全長GhRACK1-P的植物表達(dá)載體, 并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草, 獲得不同類型轉(zhuǎn)基因煙草。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明, 全長啟動(dòng)子GhRACK1-P只能驅(qū)動(dòng)gus基因在轉(zhuǎn)基因煙草的幼根及根毛中表達(dá), 其他缺失體驅(qū)動(dòng)gus基因在轉(zhuǎn)基因煙草的花粉、葉片和根中表達(dá), 為組成型表達(dá)啟動(dòng)子。由于根毛與棉花纖維具有相似的發(fā)育機(jī)制, 推測(cè)全長GhRACK1-P可能為纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)啟動(dòng)子。本研究結(jié)果為棉花纖維品質(zhì)改良基因工程提供了新的調(diào)控元件。

關(guān)鍵詞:纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá); GhRACK1啟動(dòng)子; 克隆; 缺失分析

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08010-005)資助。

This study was supported by the National Major Project of Breeding for New Transgenic Organisms (2014ZX08010-005).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: JT_Y1990@163.com

我國既是棉花生產(chǎn)大國, 也是原棉消費(fèi)大國,棉花生產(chǎn)在國民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位。目前我國棉花纖維品質(zhì)中等且單一, 雖然基本上可滿足紡織業(yè)的要求, 但原棉品質(zhì)不如美國和澳大利亞等產(chǎn)棉國, 缺乏國際競(jìng)爭(zhēng)力。因此, 棉花纖維品質(zhì)改良成為當(dāng)前我國棉花育種的主要目標(biāo)之一。

受種質(zhì)資源缺乏、育種周期長、產(chǎn)量性狀與品質(zhì)性狀負(fù)相關(guān)等因素的影響, 利用常規(guī)育種技術(shù)較難培育出纖維品質(zhì)優(yōu)良的棉花新種質(zhì)?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展為培育纖維品質(zhì)優(yōu)良的棉花新品種提供了

新的途徑。經(jīng)過近20年的努力, 目前研究者們已克隆了多個(gè)纖維發(fā)育相關(guān)基因和纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)啟動(dòng)子,并在棉花纖維品質(zhì)改良基因工程中得到應(yīng)用, 取得了可喜的進(jìn)展[1-5], 但目前仍缺乏有真正應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)良基因和調(diào)控元件。

RACK1蛋白(receptor for activated C kinase 1,活化態(tài)C激酶1受體)普遍存在于動(dòng)植物中, 是一種高度保守的WD40重復(fù)蛋白, 在細(xì)胞骨架、蛋白運(yùn)輸、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及分生組織形成等生命活動(dòng)中扮演重要角色[6]。自1993年首次從煙草愈傷組織中克隆了對(duì)生長素2,4-D響應(yīng)的RACK1基因以來[7], 目前已從擬南芥、水稻、煙草、苜蓿、油菜等多種植物中克隆到了RACK1基因[7-11]。本實(shí)驗(yàn)室通過葉片和纖維差減雜交得到了RACK1基因的EST序列, 并通過RACE技術(shù)克隆得到了GhRACK1基因的全長序列, RT-PCR表明此基因在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 熒光定量PCR分析表明此基因在纖維伸長期的表達(dá)量大約是葉片中的20倍左右, 上述結(jié)果均表明GhRACK1在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[12]。

鑒于GhRACK1在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 本研究通過反向PCR方法克隆GhRACK1基因的5′上游啟動(dòng)子GhRACK1-P, 根據(jù)GhRACK1-P上調(diào)控元件的分布進(jìn)行不同程度的缺失, 利用GhRACK1-P缺失體驅(qū)動(dòng)gus基因在煙草中表達(dá), 分析不同GhRACK1-P缺失體轉(zhuǎn)基因煙草中GUS的組織表達(dá)模式, 以期獲得棉纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子, 為棉花纖維品質(zhì)改良基因工程提供新的調(diào)控元件。

表1　反向PCR擴(kuò)增所需引物和模板Table 1　Primer and template for inverse-PCR amplification

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

煙草品種NC89、陸地棉蘇棉12、大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達(dá)載體pCamBIA 2300由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶、Taq酶和T4連接酶購自TaKaRa或NEB試劑公司。其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2反向PCR克隆GhRACK1基因的啟動(dòng)子GhRACK1-P

利用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化,北京)提取蘇棉12的基因組DNA。分別經(jīng)Bgl II和Msc I單酶切后自連環(huán)化。同時(shí)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)所需引物和模板詳見表1。PCR條件94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 72～63℃ 30 s, 72℃, 3 min, 每循環(huán)降低1℃, 依次進(jìn)行10個(gè)循環(huán); 94℃ 30 s, 66℃ 30 s, 72℃ 3 min, 30個(gè)循環(huán); 72℃10 min。最終PCR產(chǎn)物與T-載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 挑選陽性克隆并測(cè)序鑒定。

1.3GhRACK1-P缺失體的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)GhRACK1-P序列設(shè)計(jì)引物R-1、F-600、F-1036、F-1260、F-1620和F-1987。為構(gòu)建載體方便, 在R-1的3′端添加了Xba I酶切位點(diǎn), 在F-1987、F-600、F-1036、F-1260和F-1620的3′端添加了Pst I酶切位點(diǎn)。以GhRACK1-P質(zhì)粒為模板, 以R-1/F-1987、R-1/F-600、R-1/F-1036、R-1/F-1260和R-1/F-1620為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)條件為94℃

5 min; 94℃ 45 s, 62℃或55℃ 30 s, 72℃ 1～2 min, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min (表2)。獲得的PCR產(chǎn)物與T-載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌, 挑選陽性克隆并測(cè)序鑒定, 正確的陽性克隆分別被命名為GhRACK1-P、p1、p2、p3和p4。

Hind III和EcoR I雙酶切pBI121和pCamBIA 2300, 分別回收3 kb和9 kb左右的DNA條帶, 連接后形成中間載體pCamBIA230035S。Pst I和Xba I雙酶切pCamBIA230035S、p1、p2、p3、p4和GhRACK1-P, 分別回收大片段和相應(yīng)的小片段, 連接后形成植物表達(dá)載體PGhrack-1、PGhrack-2、PGhrack-3、PGhrack-4和PGhrack-5。

1.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草

利用熱擊法將表達(dá)載體PGhrack-1、PGhrack-2、PGhrack-3、PGhrack-4和PGhrack-5轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌LBA4404在含有250 mg L–1鏈霉素、250 mg L–1利福平和100 mg L–1卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中被活化。收集菌體并用液體MS基本培養(yǎng)基重懸稀釋至OD600為0.1～0.2。將繼代培養(yǎng)15 d左右的煙草組培苗葉片切成2 mm左右的長條, 于農(nóng)桿菌液中侵染10 min。然后放在含有2 mg L–16-BA和0.5 mg L–1NAA的MS培養(yǎng)基上, 25℃暗培養(yǎng)3～4 d。將外植體轉(zhuǎn)移到含有NAA 0.5 mg L–1、6-BA 2 mg L–1、Kan 100 mg L–1和Carb 500 mg L–1的MS固體培養(yǎng)基上分化培養(yǎng), 3～4周后即有再生芽的出現(xiàn)。待再生芽長到1 cm左右時(shí), 將其移到含有Kan 100 mgL–1和Carb 500 mg L–1的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.5轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)

根據(jù)GhRACK1-P缺失體序列設(shè)計(jì)系列引物。提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA, 利用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)條件為94℃ 5 min; 95℃ 1 min, 50～54℃ 30 s, 72℃ 1 min, 32個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min,具體見表3。

表2　GhRACK1-P缺失體的克隆所需引物和反應(yīng)條件Table 2　Primer and PCR progress for cloning of GhRACK1-P truncations

表3　轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測(cè)所需引物Table 3　Primers for PCR detection of transgenic tobacco

1.6GUS組織化學(xué)染色

參考Jefferson等[13]的方法, 將植物組織浸入適量X-Gluc溶液中, 密封, 37℃避光過夜, FAA固定15 min, 然后依次用75%、85%、95%和100%酒精脫色,觀察是否有藍(lán)色出現(xiàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1GhRACK1-P的克隆及序列分析

第一次反向PCR獲得了514 bp的上游序列, 第二次反向PCR獲得了1473 bp的上游序列。將兩次反向PCR所得序列拼接后獲得了GhRACK1基因的5′端上游序列1987 bp。

利用http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH. html在線軟件預(yù)測(cè)GhRACK1基因上游的1987 bp中可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)它可能位于–71 bp, 序列為TCATTCT, 此序列符合PyPyANT/APyPy的保守序列結(jié)構(gòu)。PlantCare分析其上面調(diào)控元件的分布,發(fā)現(xiàn)此序列上除了含有TATA-box、CAAT-box等順式作用元件外, 還含有3個(gè)與根特異表達(dá)有關(guān)的RootmotifTAPOX1、1個(gè)與表皮毛發(fā)育有關(guān)的MYB2、以及TBOX、LIBOX、IBOXCORE等組織特異性調(diào)控元件(圖1)。

圖1　GhRACK1-P的序列及其部分調(diào)控元件Fig. 1　Sequence of GhRACK1-P and its partial regulation elements

2.2啟動(dòng)子缺失及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)GhRACK1-P序列上與表皮毛、根、纖維特異表達(dá)相關(guān)作用因子的分布, 對(duì)GhRACK1-P進(jìn)行了不同程度的缺失, 利用PCR方法克隆得到了p1、p2、p3、p4 四個(gè)缺失體。相對(duì)于全長啟動(dòng)子GhRACK1-P來說, p4缺失體上主要缺失了與表皮毛發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元件MYB2, p3缺失體上主要缺失了表皮毛發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元件MYB2、組織特異性啟動(dòng)元件OSE1、種皮特異性啟動(dòng)元件PROLAMIBOX, p2缺失體上主要缺失了表皮毛發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元件MYB2、根特異表達(dá)調(diào)控元件RootmotifTAPOX1、組織特異性啟動(dòng)元件OSE1、種皮特異性啟動(dòng)元件PROLAMIBOX、纖維特異相關(guān)的啟動(dòng)子元件L1BOX、參與棉花纖維發(fā)育與乙烯合成途徑的IBOXCORE等, p1缺失體上缺失了所有的與根和纖維特異表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件, 主要含有TATA-box、CAAT-box等啟動(dòng)子必需的調(diào)控元件(圖2)。

以pCAMBIA2300為基礎(chǔ)載體, 以gus為報(bào)告基因, 分別構(gòu)建了全長啟動(dòng)子GhRACK1-P和4個(gè)啟動(dòng)子缺失體的植物表達(dá)載體。在構(gòu)建的系列植物表達(dá)載體中, 報(bào)告基因gus基因由GhRACK1啟動(dòng)子的不同缺失體驅(qū)動(dòng), 由nos終止子終止表達(dá); 篩選標(biāo)記基因?yàn)閚pt II, 由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá), 35S polyA終止表達(dá)。構(gòu)建的植物表達(dá)載體經(jīng)多酶切鑒定和測(cè)序證明是正確的(圖3)。

圖2　GhRACK1-P的缺失示意圖Fig. 2　Schematic diagram of deletion of GhRACK1-P

圖3　植物表達(dá)載體基因表達(dá)盒示意圖Fig. 3　Schematic diagram of plant expression vector35S P: CaMV 35S promoter; npt II: Neomycin phosphotransferase gene; 35S polyA: CaMV 35S 3’-UTR polyA; PGhrack promoter: different truncation of GhRACK1-P; gus: Beta glucuronidase gene; Nos T: Nos terminor.

2.3不同缺失體轉(zhuǎn)基因煙草的獲得和PCR檢測(cè)

將含不同啟動(dòng)子缺失體的植物表達(dá)載體通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404, 并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草NC89中, 獲得了分別含有啟動(dòng)子缺失體p1、p2、p3、p4和全長啟動(dòng)子GhRACK1-P的轉(zhuǎn)基因煙草。

提取轉(zhuǎn)基因煙草DNA進(jìn)行PCR檢測(cè), 結(jié)果不同類型的轉(zhuǎn)基因煙草中均擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的條帶,含有啟動(dòng)子缺失體p1、p2、p3和p4和全長啟動(dòng)子GhRACK1-P的轉(zhuǎn)基因煙草中擴(kuò)增的目的條帶大小分別約為330、790、486、521、971和450 bp (圖4)。經(jīng)PCR檢測(cè)后, 分別獲得了40、28、32、34和41株含有啟動(dòng)子缺失體p1、p2、p3、p4和全長啟動(dòng)子GhRACK1-P的轉(zhuǎn)基因煙草。

2.4不同缺失體的時(shí)空表達(dá)模式分析

分別取不同類型轉(zhuǎn)基因煙草的根、葉和花粉經(jīng)GUS組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn), 含有啟動(dòng)子缺失體p1、p2、p3和p4的轉(zhuǎn)基因煙草的根、葉和花粉中均有GUS的表達(dá), 而全長啟動(dòng)子GhRACK1-P的轉(zhuǎn)基因煙草只能在幼根及根毛中檢測(cè)到GUS表達(dá)。說明只有全長啟動(dòng)子GhRACK1-P為幼根及根毛特異表達(dá), 其他缺失體均為組成型表達(dá)(圖5)。相對(duì)于啟動(dòng)子缺失體而言, 全長啟動(dòng)子序列主要增加了MYB2元件和ROOTMOTIFTAPOX1等與表皮毛和根特異表達(dá)有關(guān)的調(diào)控元件, 據(jù)此推測(cè), 全長啟動(dòng)子上的這些元件與其組織特異表達(dá)密切相關(guān), 可能是其在根毛和幼根中表達(dá)所必需的。

圖4　轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)Fig. 4　PCR detection of transgenic tobaccoA, B, C, D, E分別為含有啟動(dòng)子缺失體p1、p2、p3、p4和全長啟動(dòng)子GhRACK1-P的轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè); M: 2k marker; 1～15: 轉(zhuǎn)基因煙草; 16: NC89; 17: 質(zhì)粒DNA。A, B, C, D, E represent PCR detection of transgenic tobacco containing p1, p2, p3, p4, and GhRACK1-P, respectively. M: 2k marker; 1–15: transgenic tobacco plants; 16: NC89; 17: Plasmid DNA.

3　討論

為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的定時(shí)、定位表達(dá), 降低植物體內(nèi)代謝負(fù)擔(dān)和減輕對(duì)作物本身的不利影響, 組織特異性啟動(dòng)子越來越受到研究者的關(guān)注。組織特異性啟動(dòng)子除了具有核心啟動(dòng)子區(qū)外,還具有調(diào)控基因在組織中特異表達(dá)的調(diào)控元件, 這些組織特異表達(dá)調(diào)控元件在啟動(dòng)子中的分布位置、數(shù)目和種類決定其組織表達(dá)特性。目前, 已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與組織特異和誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件, 如RHEs為根毛特異表達(dá)的調(diào)控元件[14-15]; CANNTG、ACGT和GATA等順式作用元件為決定組織特異表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)[16]。

5′端缺失法是研究啟動(dòng)子表達(dá)特性和調(diào)控元件功能最常用的方法之一, 利用限制性內(nèi)切酶、核酸外切酶、PCR等方法從啟動(dòng)子5′端上游對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行不同程度的缺失, 通過檢測(cè)缺失體驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)情況來推斷啟動(dòng)子不同缺失片段的結(jié)構(gòu)和功能[17]。

利用PlantCare在線軟件分析了本研究獲得的GhRACK1-P啟動(dòng)子上面調(diào)控元件的分布, 發(fā)現(xiàn)除含有TATA-box、CAAT-box等順式作用元件外, 含有與根特異表達(dá)有關(guān)的RootmotifTAPOX1和與表皮毛發(fā)育有關(guān)的MYB2等組織特異性調(diào)控元件。含不同啟動(dòng)子缺失體轉(zhuǎn)基因煙草的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明, 缺失體p1、p2、p3和p4均驅(qū)動(dòng)gus基因在葉片、幼根和花粉中表達(dá), 不具有組織特異性, 說明–644 ～ –640 bp和–1257 ～ –1253 bp處的Rootmotif-TAPOX1不是GhRACK1-P啟動(dòng)子組織特異表達(dá)所必需的; 缺失啟動(dòng)子上–1920 ～ –1916 bp處的RootmotifTAPOX1和–1846 ～ –1841 bp處的MYB2

元件后, GhRACK1-P啟動(dòng)子的幼根及表皮毛特異表達(dá)的特性也隨之消失, 推測(cè)–1920 ～ –1916 bp處的RootmotifTAPOX1和–1846 ～ –1841 bp處的MYB2元件是幼根及表皮毛特異表達(dá)必需的。

棉纖維是從胚珠外珠被上的單個(gè)表皮細(xì)胞分化和發(fā)育而來的, 與煙草和擬南芥的表皮毛具有相似的發(fā)育機(jī)制[18-19]。鑒于棉花遺傳轉(zhuǎn)化周期比較長,轉(zhuǎn)化效率低, 研究者們經(jīng)常利用模式植物來分析纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因啟動(dòng)子的表達(dá)模式, 如纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因GhRDL1啟動(dòng)子在棉纖維中為優(yōu)勢(shì)表達(dá), 在模式植物擬南芥中表現(xiàn)出表皮毛特異表達(dá)的模式[20];編碼脂轉(zhuǎn)移蛋白的基因Fsltp4在棉纖維發(fā)育中高表達(dá), 其啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草中表現(xiàn)出表皮毛特異表達(dá)的特性[21]。本研究利用GhRACK1-P分別驅(qū)動(dòng)gus 和gfp基因在轉(zhuǎn)基因煙草中穩(wěn)定和瞬時(shí)表達(dá), 前者結(jié)果說明GhRACK1-P驅(qū)動(dòng)gus基因只在轉(zhuǎn)基因煙草的幼根及根毛中表達(dá), 后者結(jié)果證明GhRACK1-P驅(qū)動(dòng)gfp基因只在煙草葉片的表皮毛表達(dá)(未發(fā)表數(shù)據(jù)), 據(jù)此初步推測(cè)GhRACK1-P為纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)啟動(dòng)子, 但其組織表達(dá)特性仍需在轉(zhuǎn)基因棉花中進(jìn)一步研究。

圖5　不同類型轉(zhuǎn)基因煙草的GUS組織化學(xué)染色分析Fig. 5　Histochemical GUS assay of transgenic tobaccop1, p2, p3, p4, GhRACK1-P, 35S和NC89依次代表含啟動(dòng)子缺失體p1、p2、p3和p4, 全長啟動(dòng)子GhRACK1-P, CaMV 35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草NC89的花粉、葉片和根染色情況。p1: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with p1; p2: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with p2; p3: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with p3; p4: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with p4; GhRACK1-P: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with GhRACK1-P; 35S: pollen, leaf and root of transgenic tobacco with CaMV 35S promoter; NC89: no transgenic tobacco NC89.

4　結(jié)論

克隆了陸地棉纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因GhRACK1的啟動(dòng)子GhRACK1-P。只有全長GhRACK1-P在轉(zhuǎn)基因煙草幼根及根毛中特異表達(dá), 初步推測(cè)GhRACK1-P為纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)啟動(dòng)子。

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151218.0915.020.html

Cloning and Deletion Analysis of GhRACK1 Promoter from Gossypium hirsutum

YANG Jiang-Tao, PANG Wei-Min, WANG Xu-Jing*, Lü Shao-Pu, TANG Qiao-Ling, and WANG Zhi-Xing*
Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Abstract:The absence of fiber specific promoter with future prospect is one of the main factors to restrict the development of genetic engineering in cotton fiber improvement. A 1987 bp length promoter sequence of Gossypium hirsutum GhRACK1 gene, which encodes receptor for activated C kinase 1 and precedantly expresses in fiber, was cloned by combination of inverse PCR and touchdown PCR method. Sequence analysis showed there were lots of promoter regulation elements such as cis acting factor and the tissue specific regulation elements. The full-length GhRACK1-P and truncations from –600 to –1 bp, –1036 to –1 bp, –1260 to –1 bp and –1620 to –1 bp were obtained by PCR method. Each of the truncations was fused with gus gene and inserted into plant expression vectors pCamBIA2300. All constructs were transformed into Nicotiana tabacum var. NC89 through Agrobacterium-mediated transformation method. GUS histochemical assay showed that the full-length GhRACK1-P promoter was expressed in root and exhibited a tissue-specific expression manner. All of the truncations were expressed in root, leaf and pollen and exhibited a constitutive expression manner. Because there is the similar developmental mechanism between cotton fiber and tobacco young root or trichome, the results indicate that GhRACK1- P may be a fiber specific expression promoter.

Keywords:Preferential expression in fiber; GhRACK1 promoter; Clone; Deletion analysis

收稿日期Received(): 2015-05-29; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-18.

通訊作者*(Corresponding authors): 王旭靜, E-mail: wangxujing@caas.cn, Tel: 010-82106124; 王志興, E-mail: wangcotton@126.com, Tel: 010-82106102

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00368