藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性研究

賀　平　朱曉莉　劉　航　李　捷

1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西　咸陽(yáng)　712082；2.陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院，陜西　咸陽(yáng)　712000

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藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性研究

賀平1朱曉莉2劉航1李捷1

1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712082；2.陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院，陜西咸陽(yáng)712000

【摘要】目的:觀察藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用瓊脂平板打孔法研究十五味龍膽花丸對(duì)3種標(biāo)準(zhǔn)菌株(金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922、沙門(mén)菌CMCC50319)及12株臨床菌株的抑菌作用，并檢測(cè)小鼠含藥血清對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。結(jié)果:十五味龍膽花丸對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的體外抑菌作用，但對(duì)革蘭陰性菌抑菌作用較弱。對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度介于6.25～12.5mg/ml。結(jié)論:十五味龍膽花丸對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌有一定的體外抑菌作用。

【關(guān)鍵詞】十五味龍膽花丸；金黃色葡萄球菌；大腸桿菌；抑菌

藏藥生境獨(dú)特，藥理功效強(qiáng)，引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。十五味龍膽花丸系藏醫(yī)經(jīng)典方劑，始載于藏醫(yī)巨著《四部醫(yī)典》，藏文名“幫間久?！?，為棕灰色水丸，氣微香，味甘、辛、苦。主要由白花龍膽、檀香、訶子(去核)、余甘子、石灰華、廣棗、丁香、肉豆蔻、沉香、巴夏嘎、無(wú)莖芥、甘草、毛訶子、木香、寬筋藤等15味藥材組成。具有清熱利肺、止咳化痰、平喘的功效[1]。目前，十五味龍膽花丸的研究主要集中在成分檢測(cè)[2-6]及臨床療效觀察，并用于治療支氣管炎[7]、咳嗽哮喘[8]、咽炎[9]等，尚未見(jiàn)藥理研究的文獻(xiàn)報(bào)道。研究旨在探討十五味龍膽花丸消炎抗菌作用原理，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1藥物與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物十五味龍膽花丸(西藏民族學(xué)院附屬醫(yī)院，每10丸0.3 g)。青霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片(康泰生物有限公司)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為雌性昆明小鼠(NO.61001700000554,SPF級(jí))，體重(20±2)g由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923 (Staphylococcus aureus)、大腸桿菌ATCC25922 (Escherichia coli)、沙門(mén)菌CMCC50319(Salmonella)均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；耐藥性金黃色葡萄球菌5株、銅綠假單胞菌2株、耐藥性肺炎克雷伯菌2株、耐藥性大腸桿菌3株，由咸陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，菌株信息見(jiàn)表1。

表1　供試菌株來(lái)源及耐藥情況

1.3儀器Dade AutoScan-4半自動(dòng)化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)；BHC-1300ⅡA/B2型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán))；Eppendorf 微量移液器； PH140A型干燥/培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；DENVER T-214電子天平；GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱和YXQ-LS-75S立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；ZH-2型渦旋混合器；游標(biāo)卡尺。

2方法

2.1藥物準(zhǔn)備準(zhǔn)確稱(chēng)量藥物，然后在100 ml純水中浸泡30 min，用文火煮沸30 min，冷卻后離心取用上清液，并用少量純水沖洗沉渣兩次，沖洗液離心后取用上清液，將三次上清液合并濃縮至1000 mg/ml，用除菌濾器過(guò)濾后放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2菌液制備將供試菌株在37℃培養(yǎng)18～20 h，取新鮮菌落用無(wú)菌水稀釋成0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木海缓笥闷桨逋坎挤ㄟM(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。

2.3平板打孔法抑菌實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10]用打孔器在M-H瓊脂平板上等距離打6個(gè)的孔(直徑6.5 mm)，然后用無(wú)菌棉簽蘸取0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木壕鶆蛲坎加谄桨?，每個(gè)孔內(nèi)加100 μl藥液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置600、200、60 mg/mL三個(gè)濃度水平，以卡那霉素與青霉素藥敏紙片作為對(duì)照。將平板37℃孵育24 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。每株菌種做三個(gè)平行，并求取抑菌圈平均值。

2.4最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]采用微量肉湯稀釋法測(cè)定敏感菌株MIC。取7支無(wú)菌試管，第一管加1.5 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯，其余各管均加1 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯；取0.5 ml 200mg/ml藥液加入第一管渦旋30 s，混勻后從第一管取1ml至第二管，依次倍比稀釋至第6管，最后從第6管取1 ml棄掉，藥物濃度梯度為50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 mg/ml。用移液器依次向1～7支試管加入50 μL 0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木翰⒒靹颍?管不加藥物做陽(yáng)性對(duì)照，另設(shè)無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基做陰性對(duì)照，將所有試管置于37℃孵育24 h。將試管內(nèi)培養(yǎng)液接種M-H瓊脂培養(yǎng)18～20 h，以無(wú)菌落生長(zhǎng)的試管作為該菌株的最小抑菌濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，并求取MIC平均值。

2.5血清學(xué)抑菌實(shí)驗(yàn)根據(jù)打孔法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。按照藥物使用說(shuō)明書(shū)和計(jì)量換算表確定小鼠給藥中等劑量(0.625mg/ml)。低、中、高劑量組之間均相差3倍。經(jīng)灌胃方式給藥，連續(xù)給藥5天后分離含藥血清，然后進(jìn)行含藥血清抑菌實(shí)驗(yàn)。每株菌種做三個(gè)平行，并求取抑菌圈平均值。

3結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌結(jié)果由表2可知，十五味龍膽花丸對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923有顯著的體外抑菌作用，且抑菌圈直徑與藥物濃度呈正相關(guān)；對(duì)G-菌株無(wú)抑菌作用較弱，600 mg/ml藥物對(duì)大腸桿菌ATCC25922與沙門(mén)菌CMCC50319均未形成抑菌圈。

±s,n=3)

注：“-”表示無(wú)抑菌圈；“±”抑菌圈直徑小于8mm；卡那霉素與青霉素藥敏紙片為質(zhì)控對(duì)照。

3.2臨床菌株抑菌結(jié)果由表3可知，十五味龍膽花丸對(duì)5株耐青霉素的金黃色葡萄球均有顯著抑菌作用，且抑菌圈直徑與藥物濃度呈正相關(guān)，但是對(duì)菌G-臨床菌株抑菌作用較弱，僅在高濃度時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌有抑菌圈形成。

±s,n=3)

注：與青霉素比較，*P<0.001；“-”表示無(wú)抑菌圈；卡那霉素與青霉素藥敏紙片為質(zhì)控對(duì)照。

3.3MIC測(cè)定觀察試管中培養(yǎng)基透明度，同時(shí)轉(zhuǎn)種M-H瓊脂培養(yǎng)基觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，得出敏感菌株的最小抑菌濃度。由表4可知，金黃色葡萄球菌MIC介于6.25～12.5 mg/ml。

3.4血清學(xué)抑菌實(shí)驗(yàn)十五味龍膽花丸對(duì)金黃色葡萄球菌的血清藥理學(xué)抑菌實(shí)驗(yàn)表明，低、中、高劑量給藥組的小鼠含藥血清抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。所用藥物為十五味龍膽花丸藥粉與純水制備的混懸液，在高劑量組(1.875 mg/g-)灌胃時(shí)發(fā)現(xiàn)藥液比較粘稠，小鼠灌胃給藥過(guò)程相對(duì)比較困難，因此未采取提高給藥劑量來(lái)增加藥物血藥濃度的措施。

表4　肉湯稀釋法測(cè)定金黃色葡萄球菌MIC　 (n=3)

注：“-”無(wú)菌落形成；“±”形成少量菌落；“+”形成大量菌落；“++”細(xì)菌生長(zhǎng)形成菌苔。

4討論

十五味龍膽花丸由白花龍膽、檀香、訶子、丁香、巴夏嘎、木香等配伍而成。其君藥為白花龍膽，《晶珠本草》記載龍膽花性味苦寒無(wú)毒，主治各種喉癥，其活性與龍膽苦苷有關(guān)，后者具有清熱瀉火、鎮(zhèn)咳利喉的作用[12]。訶子為獨(dú)特的珍稀藏藥材，具有廣譜抗菌作用。訶子提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌[13]和耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌[14]有顯著的抑菌作用，但對(duì)大腸桿菌較弱。丁香中也是該方劑主要活性成分之一，丁香對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及沙門(mén)菌有明顯的抑菌作用[15]。本研究首次探討了十五味龍膽花丸的體外抑菌作用，發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌有顯著抑菌作用，對(duì)銅綠假單胞菌抑菌及沙門(mén)菌也有一定抑菌作用，對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌則無(wú)抑菌作用，與上述方劑組分的研究報(bào)道基本一致。根據(jù)Dade AutoScan-4細(xì)菌鑒定結(jié)果，本研究中耐藥性金黃色葡萄球菌均為MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus)，該菌已成為全球醫(yī)院感染的主要病原體之一[16]，提示十五味龍膽花丸具有較好的臨床應(yīng)用前景。

藏藥方劑與中草藥方劑的藥物成分比較復(fù)雜，不同成分之間存在擴(kuò)散差異，而且沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)紙片，實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量較難控制。中藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)常用的研究方法[17]主要包括：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、紙片擴(kuò)散法、牛津杯法、打孔法等。牛津杯法、打孔法與紙片擴(kuò)散法原理相似，操作簡(jiǎn)便，而且藥液擴(kuò)散相對(duì)均勻。研究結(jié)果顯示，牛津杯法擴(kuò)散速度較慢，24h后部分牛津杯中仍有尚未擴(kuò)散的藥液，而且形成抑菌圈的效果較差。因此本研究的抑菌實(shí)驗(yàn)均采用平板打孔法。

十五味龍膽花丸方劑的化學(xué)成分極其復(fù)雜，經(jīng)口服以后在體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列變化，含藥血清能更好的反映藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程，特別適合復(fù)方進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)及其作用機(jī)制的研究。所以在平板打孔法抑菌實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用血清藥理學(xué)方法進(jìn)一步研究了小鼠含藥血清對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。低、中、高劑量給藥組抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。由此推測(cè)十五味龍膽花丸體內(nèi)抗感染療效并不完全依賴(lài)血清藥物濃度，可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等途徑實(shí)現(xiàn)抗炎止咳的療效。且有研究表明訶子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，從而有效地增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能[18]；丁香具有抗菌和增強(qiáng)體液免疫的作用[15]。因此有必要進(jìn)一步考察該藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。

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Antibacterial activity of Tibetan Medicine Shiwuweilongdanhua pills in vitro

HE Ping1*ZHU Xiaoli2LIU Hang1LI Jie1

1.Department of Pathogenic Biology,Medical School,Xizang Minzu University,Xianyang 712082,China;

2.The central hospital of Xianyang, Xianyang 712000,China

Abstract:Objective To investigate the antibacterial activity of Tibetan medicine Shiwuweilongdanhua pills in vitro and provide theoretical basis for clinical application. Methods M-H agar-punching method was adopted to research the antibacterial activity of Shiwuweilongdanhua pills on three standard strains (Staphylococcus aureus ATCC25923, Escherichia coli ATCC25922, Salmonella CMCC50319) and 12 clinical isolates; and the antibacterial effect of mice serum on Staphylococcus aureus was detected.Result Shiwuweilongdanhua pills had obvious antibacterial effect on Staphylococcus aureus in vitro, but weak inhibition on Gram-negative bacteria. The minimal inhibitory concentrations to Staphylococcus aureus were between 6.25mg/ml and 12.5mg/ml.Conclusion Shiwuweilongdanhua pills had significant antimicrobial effect on multidrug-resistant Staphylococcus aureus in vitro, which indicated potential prospects in clinical application.

Key words:Shiwuweilongdanhua pills; Staphylococcus aureus; Escherichia Coli; Antibacterial activity

(收稿日期：2015.12.06)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R29

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)01-0003-03

作者簡(jiǎn)介：賀平，醫(yī)學(xué)碩士，從事藏藥抗菌作用研究。 E-mail:hepingyixue@126.com

基金項(xiàng)目：西藏民族大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(14myQ14)。