HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA功能化納米顆粒制備及鑒定

郭永燦， 王友強(qiáng)， 魏 聰， 鄧 沖， 趙 容， 鄒 霞， 涂植光

HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA功能化納米顆粒制備及鑒定

郭永燦1， 王友強(qiáng)1， 魏 聰1， 鄧 沖1， 趙 容1， 鄒 霞1， 涂植光2

目的 制備HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)功能化磁性納米顆粒，為進(jìn)一步建立富集分離和檢測(cè)cccDNA方法奠定基礎(chǔ)。 方法 通過(guò)親和素修飾納米顆粒表面，利用親和素與生物素的親和作用，將親和素修飾的納米顆粒與生物素標(biāo)記的cccDNA特異性探針偶聯(lián)，制備cccDNA功能化納米顆粒，最后用cccDNA探針完全互補(bǔ)的熒光標(biāo)記序列與功能化納米顆粒反應(yīng)，鑒定其特性。 結(jié)果 親和素修飾的納米顆粒能結(jié)合生物素最大量為1 205 ng/mg；通過(guò)與親和素作用，生物素標(biāo)記cccDNA特異性探針固定在磁性納米微粒表面，其最大結(jié)合生物素標(biāo)記探針量為3.2×10-9mol/mg；cccDNA功能化納米顆粒可捕獲與其互補(bǔ)的熒光標(biāo)記寡核苷酸序列，其最大捕獲量為2.0×10-9mol/mg，并能通過(guò)變性釋放出保持生物學(xué)活性游離的熒光標(biāo)記寡核苷酸序列。 結(jié)論 成功構(gòu)建的cccDNA功能化納米微粒能有效捕獲與其互補(bǔ)的序列，其捕獲量能達(dá)到cccDNA的分離提取要求。

*DNA，病毒； DNA，環(huán)狀； 納米粒子

近年來(lái)，納米技術(shù)迅速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域。以納米或微米級(jí)磁性粒子為載體的磁性分離技術(shù)主要利用固定在粒子表面的蛋白質(zhì)或單鏈核苷酸探針的親和作用與靶分子或互補(bǔ)序列結(jié)合，目標(biāo)靶分子因與磁性粒子特異性結(jié)合后在磁場(chǎng)作用下，通過(guò)抗原-抗體或核酸分子雜交、分離、清洗等簡(jiǎn)便、快速操作，從復(fù)雜的生物體系中被分離[1]。本研究擬通過(guò)已制備的磁性納米微粒，經(jīng)親和素修飾，再與生物素標(biāo)記HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)特異性探針偶聯(lián)，制備cccDNA功能化納米顆粒，為富集分離和檢測(cè)cccDNA奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 鏈霉親和素、生物素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶、四甲基聯(lián)苯胺(美國(guó)Sigma公司)；PBST緩沖液(1×PBS，0.05% Tween-20)，STE(NaCl-Tris-EDTA)結(jié)合/清洗緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA， pH 7.4)，雜交緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 8.0)，PBS緩沖液(20 mmol/L Na2PO4/NaH2PO4，pH 7.5)等自配；其他化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于北京索萊寶公司。

1.1.2 儀器 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(ND1000，美國(guó)NanoDrop公司)；熒光分光光度計(jì)(2300EnSpire，芬蘭PerkinElmer公司)；酶標(biāo)儀(SunriseTM，奧地利Tecan公司)。

1.2.1 親和素修飾納米微粒的制備 將已制備的納米顆粒用PBS配制為5 mg/mL的納米懸濁液。取超聲分散懸濁液500 μL，加入1 mg/L親和素液50 μL，室溫振蕩24 h。反應(yīng)畢，加入1 mL的戊二醛封閉反應(yīng)2 h，PBS洗滌3次，磁性分離去上清，最后用1 mL PBS分散親和素修飾磁性納米微粒。取5支離心管，分別取100 μL已修飾磁性納米懸濁液(含親和素約5 μg)，每管加入10，20，40，60及80 ng生物素，反應(yīng)20 min后各管加入經(jīng)稀釋生物素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶50 μL，避光反應(yīng)20 min，加入TMB底物顯色5 min后用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各管溶液在450 nm處OD值。以生物素加入量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)，以95%生物素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶活性被抑制來(lái)計(jì)算親和素修飾磁性納米顆粒能結(jié)合生物素容量。

1.2.2 cccDNA特異性探針設(shè)計(jì)與合成 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找人源HBV完整序列，剔除人工構(gòu)建質(zhì)粒序列，將余下的序列導(dǎo)入序列比對(duì)軟件進(jìn)行比對(duì)，找出順向重復(fù)序列(direct repeat，DR)1和2區(qū)間的同源序列；將同源序列導(dǎo)入Oligo7(version 7.37)軟件，設(shè)計(jì)cccDNA特異性的互補(bǔ)探針序列。將設(shè)計(jì)探針序列在Pubmed上進(jìn)行BLAST比對(duì)后，對(duì)照相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]，驗(yàn)證后選定4條探針，分別是：

probe 1：5′ACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACC3′(26 nt);

probe 2：5′CTTCGCTTCACCTCTGCACGT3′(21 nt);

probe 3：5′TGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAAT

TGGTCTGTT3′(35 nt);

probe 4：5′AGGTTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTT3′(49 nt)

1.1 對(duì)象 選擇2008年6月—2009年10月在上海市靜安區(qū)靜安寺社區(qū)衛(wèi)生中心、曹家渡社區(qū)衛(wèi)生中心、南京西路社區(qū)衛(wèi)生中心的老年住院患者共202例，隨機(jī)分為干預(yù)組和對(duì)照組各101例。

所有序列5′用生物素標(biāo)記，交由生工生物工程(上海)股份公司合成和標(biāo)記。

1.2.3 cccDNA功能化微粒制備 取親和素修飾磁性微?；鞈乙?50 μL(含微粒約250 μg)，平均分為5管，每管加入一定量(5，10，15，20和25 μL)10 μmol/L生物素化標(biāo)記寡核苷酸探針，在37 ℃恒溫?fù)u床中以150 r/min反應(yīng)2 h。完畢后，磁性分離，以清洗緩沖液洗滌3次。測(cè)定偶聯(lián)前后以及清洗后上清液在260 nm處的OD值，確定納米顆粒與生物素化探針?lè)磻?yīng)的最佳比例、偶聯(lián)效率及固定化量。各組探針的偶聯(lián)效率及固定化量符合反應(yīng)要求，用封閉液進(jìn)行封閉，制備cccDNA功能化微粒。

1.2.4 cccDNA功能化微粒鑒定 設(shè)計(jì)與生物素標(biāo)記探針序列完全互補(bǔ)的寡核苷酸序列，同時(shí)設(shè)計(jì)與4條cccDNA序列完全不互補(bǔ)序列為對(duì)照序列(表1)，交由生工生物工程(上海)股份公司合成和標(biāo)記。取50 μL功能化磁性微?；鞈乙?約含微粒50 μg)，將FITC標(biāo)記互補(bǔ)寡核苷酸探針配制為10 μmol/L應(yīng)用液。共分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(FITC標(biāo)記探針?lè)謩e為50,100,150和200 pmol)和1個(gè)對(duì)照組，反應(yīng)體系：FITC標(biāo)記探針5～20 μL，納米微粒懸濁液 10 μL，5 mmol/L NaCl 10 μL，雜交緩沖液補(bǔ)足到100 μL；雜交反應(yīng)管混勻后于62 ℃雜交反應(yīng)30 min。反應(yīng)完畢后，磁性分離，棄上清。再用清洗緩沖液充分洗滌磁微粒3次，分別用熒光顯微鏡觀(guān)察雜交前后上清液熒光信號(hào)變化及用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)加入最適量探針各組在雜交前后熒光信號(hào)強(qiáng)度變化。

表1 與生物素標(biāo)記探針互補(bǔ)的FITC標(biāo)記寡核苷酸序列

2 結(jié) 果

2.1 親和素修飾納米結(jié)合生物素活性檢測(cè) 生物素加入量為40，80及100 ng時(shí)，微粒結(jié)合生物素量已趨于飽和(圖1)。因此，生物素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶95%被抑制點(diǎn)在20～40 ng(箭頭所示)。按文獻(xiàn)方法[4]，計(jì)算出25 μg親和素修飾納米微粒能結(jié)合生物素量為30.12 ng，每mg納米顆粒能結(jié)合生物素量約1 205 ng。

2.2 納米微粒與標(biāo)記探針偶聯(lián)效率檢測(cè) 加入5，10，15和20 μL探針時(shí)上清液OD260值變化不大，但加入25 μL時(shí)，其吸光度值陡然上升，表明加入20 μL探針量已趨于飽和(圖2，紅色箭頭所示)，以此計(jì)算出親和素修飾納米顆粒最大偶聯(lián)探針量約4 000 pmol/mg[4]。納米微粒與生物素標(biāo)記探針偶聯(lián)后，上清液吸光度明顯降低(表2)。按公式計(jì)算各組探針相應(yīng)值：

偶聯(lián)效率=[(OD260偶聯(lián)前-OD260空白)-(OD260偶聯(lián)后-OD260空白)]/(OD260偶聯(lián)前-OD260空白)×100%

探針固定量(mol/mg)=偶聯(lián)效率×加入生物素標(biāo)記探針量(mol/mg)

4組探針偶聯(lián)效率分別為78.5%，84.0%，82.8%，81.8%，計(jì)算出親和素修飾納米微粒表面能固定探針量約3.2×10-9mol/mg(以加入探針量為20 μL計(jì)算)。4組納米微粒固定探針量間均值比較，經(jīng)t檢驗(yàn)顯示其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

組 別探針1(OD260)探針2(OD260)探針3(OD260)探針4(OD260)A1．427±0．080．606±0．071．501±0．112．269±0．13B0．285±0．040．059±0．020．224±0．030．368±0．07C0．022±0．010．038±0．010．034±0．010．046±0．01

A：偶聯(lián)前； B：偶聯(lián)后； C：對(duì)照組.

2.3 cccDNA功能化納米顆粒鑒定 加入標(biāo)記序列量為50 pmol和100 pmol時(shí)，雜交后上清液不能觀(guān)察到明顯熒光信號(hào)(圖3A，3B)；加入量為150 pmol時(shí)，雜交后上清液能觀(guān)察到明顯的熒光信號(hào)(圖3C)，說(shuō)明其探針加入量超過(guò)功能化納米顆粒最大捕獲量。于是將100 pmol作為其最大探針捕獲量，即功能化納米顆粒對(duì)互補(bǔ)探針最大捕獲量大約2.0×10-9mol/mg。熒光分光度計(jì)檢測(cè)功能化納米微粒與其互補(bǔ)FITC標(biāo)記序列雜交后各組上清液熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。從表中可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)各組上清液熒光強(qiáng)度在雜交后明顯下降，根據(jù)公式計(jì)算：

捕獲效率=[(AU雜交前-AU空白)/AU雜交前]×100%

cccDNA功能化微粒對(duì)4組不同互補(bǔ)序列捕獲效率均達(dá)97%以上(對(duì)照組為0.4%，探針1～4分別為97.9%，97.9%，97.7%，97.9%)。經(jīng)t檢驗(yàn)，各組與對(duì)照組比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而cccDNA功能化對(duì)4組不同互補(bǔ)序列捕獲效率差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，將已捕獲FITC互補(bǔ)序列的cccDNA功能化微粒懸濁液進(jìn)行變性后，其上清的熒光強(qiáng)度又明顯上升，根據(jù)公式計(jì)算：

釋放率=[(AU變性后-AU空白)/(AU雜交前-AU雜交后)]×100%

4組微粒釋放互補(bǔ)序列率達(dá)80%(分別為78.1%，84.1%，78.7%，77.8%)。4組間分別進(jìn)行t檢驗(yàn)，其均值差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。通過(guò)各組雜交前后及變性后上清液熒光強(qiáng)度檢測(cè)，表明結(jié)合有特異性cccDNA探針的磁性微粒能富集捕獲與FITC標(biāo)記互補(bǔ)寡核苷酸序列，又能通過(guò)變性有效地釋放出保持的生物學(xué)活性游離的FITC標(biāo)記寡核苷酸序列。

Tab 3 Capability of cccDNA nanoparticles to capture different complementary sequence by FITC-labeled AU

AU：吸光度單位. A:雜交前上清；B:雜交后上清；C:變性后上清.

3 討 論

由于肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA含量低，且易受同源DNA，如松弛環(huán)狀雙鏈DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)、雙鏈線(xiàn)性DNA (double strand linear DNA, dslDNA)、單鏈DNA(single strand DNA, ssDNA)等的干擾。因此，實(shí)現(xiàn)cccDNA特異和富集分離是定量檢測(cè)cccDNA的關(guān)鍵。

納米復(fù)合材料制備與應(yīng)用過(guò)程的難題是納米微粒團(tuán)聚，而解決團(tuán)聚的有效方法是在納米微粒的表面進(jìn)行如SiO2，Au，Ag等修飾。本文主要通過(guò)在SiO2修飾的磁性納米微粒表面連接具有偶聯(lián)特異性的靶向cccDNA探針來(lái)構(gòu)建cccDNA功能化納米微粒，而經(jīng)SiO2修飾之后，納米微粒團(tuán)聚現(xiàn)象大大減少，有效增加了微粒表面結(jié)合親和素的能力。親和素-磁性微粒性能評(píng)價(jià)的參考方法就是親和素-納米微粒結(jié)合游離生物素的容量。用競(jìng)爭(zhēng)抑制法對(duì)親和素-納米微粒結(jié)合生物素最大飽和結(jié)合容量分析表明，1 mg親和素修飾硅化納米顆粒能結(jié)合生物素量約為1 205 ng，與氨基修飾、Au修飾微粒結(jié)合游離生物素量基本一致[4-6]，結(jié)合量比未修飾微粒高6倍左右[5]。此外，根據(jù)rcDNA，ssDNA及dslDNA與cccDNA結(jié)構(gòu)差別，設(shè)計(jì)4條長(zhǎng)度不等的cccDNA特異性的探針序列。經(jīng)親和素和生物素的相互作用，將生物素標(biāo)記探針固定到磁性微粒上，通過(guò)檢測(cè)偶聯(lián)前后磁性分離上清液OD260值變化，了解納米微粒固化探針情況，判斷構(gòu)建cccDNA功能化納米微粒的性能[7-8]。固定cccDNA探針前后，寡核苷酸溶液在260 nm的特征吸收峰有明顯變化且OD260值均明顯降低。通過(guò)計(jì)算，4組不同探針偶聯(lián)效率約為80%，親和素-磁性納米微粒表面能固定的寡核苷酸探針量約為3.2×10-9mol/mg，比Au、氨基修飾微粒略高(2.8×10-9mol/mg)，是未修飾微粒寡核苷酸結(jié)合能力的8倍(26 bp)[5]。將cccDNA功能化磁性微粒表面固定的探針與FITC標(biāo)記互補(bǔ)寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，驗(yàn)證cccDNA功能化微粒捕獲性能[9-11]。結(jié)果顯示，表面固定有探針的磁性微粒與FITC標(biāo)記互補(bǔ)寡核苷酸探針雜交后上清液熒光明顯減弱，與完全不互補(bǔ)的對(duì)照序列具有非常明顯的差別，說(shuō)明cccDNA功能化納米顆粒能特異性捕獲與其互補(bǔ)FITC標(biāo)記寡核苷酸序列。通過(guò)計(jì)算，cccDNA功能微粒的最大捕獲量為2.0×10-9mol/mg，捕獲效率達(dá)97%以上。同時(shí)，cccDNA功能化微粒還能通過(guò)變性有效釋放出保持生物學(xué)活性的游離FITC標(biāo)記寡核苷酸序列。

綜上所述，本研究利用磁性納米微粒的超順磁性以及親和素-生物素特異偶聯(lián)性，成功制備了cccDNA功能化納米微粒，這種新型cccDNA分離的固相載體，價(jià)格低廉且具有較高的游離生物素結(jié)合容量以及較高的寡核苷酸的結(jié)合能力。此外，本研究首次就構(gòu)建cccDNA功能化微粒進(jìn)行研究，但以功能化微粒為載體的新型綜合分離cccDNA技術(shù)尚需更大的樣本以進(jìn)一步證實(shí)。

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(編輯:張慧茹)

Preparation and Identification for Apecific Functionalized Nanoparticles of HBV Covalently Closed Circular DNA

GUO Yongcan1, WANG Youqiang1, WEI Cong1, DENG Chong1, ZHAO Rong1, ZOU Xia1, TU Zhiguang2

1.Clinical Laboratory of Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Southwest Medical University, Luzhou 646000；2.College of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016

Objective To prepare and identify specific nanoparticles of HBV cccDNA, and lay the foundation for enriching, separating, and detecting cccDNA in the future. Methods Initially, the silica-coated nanoparticles were modified by streptavidin. Then oligonucleotides for specific HBV cccDNA capture were designed and labeled by biotin. Moreover, oligonucleotides labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), which were completely complementary to capture probe, were synthesized and captured by functionalized nanoparticles for the characteristic validation. Results Streptavidin-modified nanoparticles could bind biotin, its maximum amount was about 1 215 ng/mg. In addition, streptavidin-modified nanoparticles had a high oligonucleotides binding capacity, its average amount of nucleic acid fixed was about 3 200 pmol/mg. After FITC-labeled sequences were added to the buffer and its hybridization with functionalized nanoparticles was performed, the fluorescence intensity of supernatant was decreased noticeably compared with that of pre-hybridization. Moreover, functionalized nanoparticles could capture up to about 2 000 pmol FITC-labeled sequences. Conclusion Specific functionalized nanoparticles of cccDNA can effectively capture the complementary sequences labeled by FITC, and the capture amount is enough to capture cccDNA in routine samples.

*DNA, viral； DNA, circular； nanoparticles

2016-08-22

瀘州市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-S-49)；西南醫(yī)科大學(xué)校級(jí)課題(2015-YJ028)

1.西南醫(yī)科大學(xué) 附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，瀘州 646000； 2.重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016

郭永燦，男，(1973-)，副主任技師，醫(yī)學(xué)博士. Email：guoyongcan_2004@163.com

R342.3； R373.21； R392.11； R512.62

A

1672-4194(2016)06-0370-05