犬牙周膜細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞組織再生能力比較的實驗研究

黃永玲， 駱 凱， 李艷芬， 閆福華

犬牙周膜細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞組織再生能力比較的實驗研究

黃永玲1， 駱 凱1， 李艷芬1， 閆福華2

目的 比較犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)和牙周膜細(xì)胞(PDLC)體內(nèi)成骨及成韌帶樣組織的能力，為牙周組織工程種子細(xì)胞的選擇提供實驗依據(jù)。 方法 將體外培養(yǎng)Beagle犬BMSC及PDLC與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)膜復(fù)合后植入裸鼠皮下，以單純ADM為對照組，分別于術(shù)后4周和8周進(jìn)行標(biāo)本組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色分析，比較骨保護(hù)素(OPG)和膠原Ⅻ的表達(dá)。 結(jié)果 復(fù)合物植入4周和8周組織學(xué)觀察顯示，BMSC形成骨樣組織多于PDLC，而形成韌帶樣組織少于PDLC。免疫組織化學(xué)染色顯示，BMSC組的OPG表達(dá)量高于PDLC組，但膠原Ⅻ的表達(dá)量低于PDLC組。 結(jié)論 BMSC體內(nèi)成骨能力高于PDLC組，但成韌帶樣組織能力低于PDLC組。

骨髓細(xì)胞； 牙周膜； 引導(dǎo)組織再生，牙周； 真皮； 細(xì)胞外基質(zhì)

種子細(xì)胞是牙周組織工程學(xué)中最重要的環(huán)節(jié)，可與支架材料復(fù)合形成具有一定功能的組織，克服人造骨粉等自身無再生能力等特點，現(xiàn)已成為組織工程研究中的熱點。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell, BMSC)和牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cell, PDLC)是目前牙周組織工程中應(yīng)用最多的種子細(xì)胞。二者在特定的環(huán)境和刺激因子作用下均有利于牙周組織的再生[1-2]。本課題組前期研究比較了二者在牙周組織再生中的潛能，實驗表明，PDLC體外成骨能力低于BMSC，但具有較高的成韌帶潛力[3]。本研究在原有研究的基礎(chǔ)上，比較了PDLC和BMSC體內(nèi)成骨及成韌帶的能力，為篩選出較好的牙周種子細(xì)胞提供實驗依據(jù)，也有助于深入探討牙周再生治療的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性裸鼠12只，6周齡，體質(zhì)量16～18 g[許可證號：SCXK(滬)2007-0005，上海斯萊克實驗動物有限公司]。雄性Beagle犬6只，體質(zhì)量10～15 kg[許可證號：SCXK(川)2007-15，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所]。

1.1.2 試劑 DMEM液(美國Sigma公司)；胰酶(美國Gibco公司)；EDTA(汕頭西隴化工)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix, ADM)(北京桀亞萊福生物技術(shù)有限公司)；兔抗人骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)多克隆抗體，兔抗人膠原Ⅻ多克隆抗體(美國Santa公司)；羊抗兔超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.1.3 儀器 石蠟組織切片機(jī)(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(廣州光學(xué)儀器廠)；倒置相差熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSC和PDLC分離培養(yǎng) (1)參照文獻(xiàn)[4]的全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSC。全麻下從6只Beagle犬的股骨近端抽取骨髓15 mL，將其注入含20 mL無血清培養(yǎng)基的離心管中，1 000 r/min×5 min，離心2次，置入無菌培養(yǎng)皿中,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d半量換液，5 d全量換液。以后常規(guī)每3天換液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況及形態(tài)。細(xì)胞生長融合后，用2.5 g/L的胰酶+1 g/L的EDTA消化傳代。(2)參照文獻(xiàn)[5]的改良組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)PDLC。全麻下微創(chuàng)拔出Beagle犬前磨牙和磨牙，無菌條件下使用含雙抗的(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)生理鹽水反復(fù)沖洗，刮取根中1/3牙周膜，切成1 mm2左右，置入另一含無菌生理鹽水的平皿中，平鋪于用DMEM液預(yù)濕的6孔培養(yǎng)板底，每孔3～4塊，覆蓋25 mm×20 mm蓋玻片，各孔緩慢加入3 mL含10% FBS的DMEM液，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4 d后初次換液，以后常規(guī)每3天換液。待細(xì)胞生長融合后，用2.5 g/L的胰酶+1 g/L的EDTA消化傳代。

1.2.2 ADM膜與BMSC和PDLC復(fù)合物的體外構(gòu)建 將1 cm×1 cm的ADM膜平均剪成4塊，將真皮面朝上，浸泡0.5 h后，置入24孔板內(nèi)，將細(xì)胞密度為1×107L-1的BMSC及PDLC接種在ADM膜上，每片接種30 μL，在培養(yǎng)箱中孵育2 h后取出，加入800 μL 10% DMEM液，再孵育48 h[6]。

1.2.3 ADM膜與細(xì)胞復(fù)合物裸鼠皮下移植 裸鼠共12只，所有手術(shù)均于SPF級實驗室超凈臺內(nèi)完成。裸鼠麻醉后消毒，在其背部前后作2個切口，分離皮下，將PDLC+ADM、BMSC+ADM以及單純ADM(真皮面朝下)植入裸鼠皮下。

1.2.4 組織學(xué)染色及免疫組織化學(xué)檢測 復(fù)合物植入裸鼠皮下4，8周時，隨機(jī)處死6只裸鼠，收集標(biāo)本，4%的多聚甲醛固定，大體觀察標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)H-E染色。參照文獻(xiàn)[7-8]的方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測樣本中OPG和膠原Ⅻ的表達(dá)。使用Image Pro Plus 6.0軟件，以累積光密度(integrated optical density, IOD)/面積(area)為平均光密度值，并進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，平均光密度值采用t檢驗進(jìn)行比較分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 H-E染色比較 復(fù)合物植入4周時，單純ADM組可見裸鼠細(xì)胞植入ADM內(nèi)部，借助其原有的膠原支架，開始“自體化”；BMSC組可見ADM內(nèi)形成大量的類骨質(zhì)；PDLC組可見ADM原有的膠原被新形成的結(jié)締組織包裹、替代，形成類骨質(zhì)(圖1)。8周時，單純ADM組可見裸鼠細(xì)胞大面積植入ADM內(nèi)，部分ADM出現(xiàn)完全“自體化”，未見明顯新生類骨質(zhì)及膠原組織；BMSC組較4周時形成更多的類骨質(zhì)；PDLC組生成大面積新生膠原組織，并逐漸替代了原有的纖維結(jié)構(gòu)，與4周時無明顯差別(圖1)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果

2.2.1 各組膠原Ⅻ的表達(dá)情況 復(fù)合物植入4周時，膠原Ⅻ在PDLC組和BMSC組中表達(dá)均明顯，但PDLC組染色較深，表達(dá)量較多(圖2)。8周時，PDLC組膠原Ⅻ表達(dá)量仍最多(圖2)。在4周和8周時，膠原Ⅻ在單純ADM組中表達(dá)量均極少。使用獨立樣本成組t檢驗測其平均光密度值(HIS值：H=14，S及I值為0～255)，顯示PDLC組明顯高于BMSC組(P<0.05，圖3)。

2.2.2 各組OPG的表達(dá)情況 復(fù)合物植入4周時，PDLC組和BMSC組中OPG均有表達(dá)，但相比PDLC組，BMSC組表達(dá)量相對較多(圖4)。8周時， BMSC組中OPG表達(dá)量有所增加，而OPG在PDLC組中的表達(dá)量并無顯著變化(圖4)。在4周和8周時，OPG在單純ADM組中表達(dá)量仍極少。使用獨立樣本成組t檢驗測其平均光密度值(HIS值：H=12，S及I值為0～255)，顯示BMSC組OPG表達(dá)量較高(P<0.05，圖5)。

3 討 論

PDLC和BMSC是現(xiàn)今組織工程中應(yīng)用較為廣泛的種子細(xì)胞，均具有多向分化潛能，可促進(jìn)牙周組織再生[9-15]。但哪種細(xì)胞更適合作為牙周組織工程中的種子細(xì)胞尚需進(jìn)一步研究明確。Tsumanuma等利用PDLC、BMSC構(gòu)建細(xì)胞膜片植入牙周缺損后，發(fā)現(xiàn)二者均可促進(jìn)牙周組織再生，PDLC組形成量較多，但二者差別無統(tǒng)計學(xué)意義[16]。Sun等比較PDLC及BMSC構(gòu)建的細(xì)胞膜片與自體牙根體外構(gòu)建牙生物性種植體，研究結(jié)果顯示，PDLC組新生的牙周組織樣結(jié)構(gòu)多于BMSC組，BMSC組種植體根面多為骨性結(jié)合[17]。

本課題組前期體外實驗結(jié)果表明，BMSC體外成骨能力較PDLC強(qiáng)，但形成韌帶樣組織能力低于PDLC[3]。但是，細(xì)胞體內(nèi)可能發(fā)生的生物學(xué)反應(yīng)并不能全靠體外實驗反映出來，二者促進(jìn)牙周組織再生的能力究竟有何區(qū)別，尚有待進(jìn)一步研究證實。因此，本實驗將二者分別與ADM復(fù)合后植入裸鼠體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)實驗，觀察二者成骨及成韌帶能力。

本次實驗選用H-E染色及OPG免疫組織化學(xué)染色的方法來研究BMSC和PDLC體內(nèi)形成骨組織的能力。OPG為腫瘤壞死因子受體超家族成員，是由成骨細(xì)胞分泌表達(dá)形成的二聚體，是一種分泌型糖蛋白，可使破骨細(xì)胞失去活性從而抑制活化破骨細(xì)胞，在生理性和病理性骨吸收中均發(fā)揮著重要作用[3,18]。H-E染色及OPG免疫組織化學(xué)染色結(jié)果均表明，BMSC形成骨組織的能力要高于PDLC，這與已有的研究報道一致[3,17,19]。因此，與PDLC相比，BMSC在骨組織再生中，功能更強(qiáng)大。

牙周組織再生中，除了牙槽骨外，牙周韌帶的再生也是其重要組成。膠原Ⅻ屬于三聚體纖維相關(guān)膠原，主要位于膠原纖維的表層，螺旋結(jié)構(gòu)，但不太規(guī)則，起著維持三維膠原纖維結(jié)構(gòu)的作用[20]。Reichenberger和Karimbux等的研究均顯示，膠原Ⅻ是成熟的牙周膜形成的標(biāo)記之一[21-22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDLC組膠原Ⅻ表達(dá)量高于BMSC組，表明PDLC的成韌帶能力高于BMSC組，這與Tsumanuma及Sun等的研究結(jié)果一致[16-17]。

以上結(jié)果分析表明，PDLC及BMSC均能在一定程度上實現(xiàn)牙周組織再生，但BMSC在骨組織再生中更顯其功能，PDLC在成韌帶能力方面優(yōu)于BMSC。如果將2種細(xì)胞聯(lián)合用于牙周組織中，將有望最大可能地實現(xiàn)牙周組織的再生。

[1] Han J, Menicanin D, Gronthos S,etal. Stem cells, tissue engineering and periodontal regeneration [J].AustDentJ, 2014, 59(Suppl 1):117-130.

[2] Li C, Li B, Dong Z,etal. Lipopolysaccharide differentially affects the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells through Toll-like receptor 4 mediated nuclear factor κB pathway[J].StemCellResTher, 2014,5(3):67.

[3] 林敏魁, 黃永玲, 鐘 泉, 等. 比格犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞和牙周韌帶成纖維細(xì)胞體外再生組織能力的比較[J]. 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2011,45(4):242-245.

[4] 黃 謙, 吳 濤, 梁 杰, 等. 全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離hBMSCs的比較研究[J]. 中國修復(fù)重建外科雜志, 2009(11):1360-1364.

[5] 唐焜琪, 閆福華. Ad5-hOPG-EGFP轉(zhuǎn)染對比格(Beagle)犬牙周膜細(xì)胞生物學(xué)活性的影響[J]. 全科口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2015,2(8):104-105.

[6] 黃永玲, 閆福華, 鐘 泉, 等. 脫細(xì)胞真皮基質(zhì)作為Beagle犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植載體的實驗研究[J]. 組織工程與重建外科雜志, 2011,7(4):181-185.

[7] 徐 輝, 周新文, 張振庭, 等. 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子復(fù)合無機(jī)骨促進(jìn)骨再生的實驗研究[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究, 2013,29(1):5-8.

[8] 陳仲偉, 徐冬貴, 朱李軍, 等. HGF/C-Met在舌部鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)及其臨床意義[J]. 口腔醫(yī)學(xué)研究, 2013,29(1):76-81.

[9] Ninomiya T, Hiraga T, Hosoya A,etal. Enhanced bone-forming activity of side population cells in the periodontal ligament [J].CellTransplant, 2014,23(6):691-701.

[10] Li R, Li X, Zhou M,etal. Quantitative determination of matrix Gla protein (MGP) and BMP-2 during the osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells [J].ArchOralBiol, 2012,57(10):1408-1417.

[11] Nagayasu-Tanaka T, Anzai J, Takaki S,etal. Action mechanism of fibroblast growth factor-2 (FGF-2) in the promotion of periodontal regeneration in Beagle dogs[J].PLoSOne, 2015,10(6): e0131870.

[12] Tian Y, Bai D, Guo W,etal. Comparison of human dental follicle cells and human periodontal ligament cells for dentin tissue regeneration[J].RegenMed, 2015,10(4):461-479.

[13] Cai X, Yang F, Yan X,etal. Influence of bone marrow-derived mesenchymal stem cells pre-implantation differentiation approach on periodontal regenerationinvivo[J].JClinPeriodontol, 2015,42(4):380-389.

[14] Kawai T, Katagiri W, Osugi M,etal. Secretomes from bone marrow-derived mesenchymal stromal cells enhance periodontal tissue regeneration [J].Cytotherapy, 2015,17(4):369-381.

[15] Zhou L L, Liu H W, Wen X X,etal. Involvement of bone marrow stem cells in periodontal wound healing[J].ChinJDentRes, 2014,17(2):105-110.

[16] Tsumanuma Y, Iwata T, Washio K,etal. Comparison of different tissue-derived stem cell sheets for periodontal regeneration in a canine 1-wall defect model[J].Biomaterials, 2011,32(25):5819-5825.

[17] Sun C, Liu H. Periodontal tissue in a bio-implant by periodontal ligament cells sheet and bone marrow stromal cells sheet [J].ChineseJournalofStomatology, 2014, 49(2):84-88.

[18] Yu X J, Xiao C J, Du Y M,etal. Effect of hypoxia on the expression of RANKL/OPG in human periodontal ligament cellsinvitro[J].IntJClinExpPathol, 2015,8(10):12929-12935.

[19] Belibasakis G N, Meier A, Guggenheim B,etal. Oral biofilm challenge regulates the RANKL-OPG system in periodontal ligament and dental pulp cells [J].MicrobPathog, 2011,50(1):6-11.

[20] Grzesik W J, Kuzentsov S A, Uzawa K,etal. Normal human cementum-derived cells: isolation, clonal expansion, andinvitroandinvivocharacterization [J].JBoneMinerRes, 1998,13(10):1547-1554.

[21] Reichenberger E, Baur S, Sukotjo C,etal. Collagen Ⅻ mutation disrupts matrix structure of periodontal ligament ank skin [J].JDentRes, 2000,79(12):1962-1968.

[22] Karimbux N Y, Rosenblum N D, Nishimura I. Site-specific expression of CollagenⅠand Ⅻ mRNA in the rat periodontal ligament at two developmental stages [J].JDentRes, 2000,71(7):1355-1362.

(編輯：何佳鳳)

Comparison of Tissues Regenerative Capability between Bone Marrow Stromal Cell and Periodontal Ligament Cell on Dogs

HUANG Yongling1, LUO Kai1, LI Yanfen1, YAN Fuhua2

1. Department of Periodontology, School and Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China;2. Nanjing Stomatological Hospital, Medical School of Nanjing University , Nanjing 210008, China

Objective To compare the ability of periodontal tissue regeneration between periodontal ligament cells (PDLC) and bone marrow stromal cells (BMSC), and therefore to provide experimental foundation for periodontal tissue regeneration. Methods The BMSC+ADM complex and the PDLC+ADM complex were implanted subcutaneously in nude mice. The ADM monomer was also implanted as the control group. Formed tissues specimens were harvested for histological analysis and immunohistochemistry at 4 and 8 weeks after implantation. Results After 4 weeks and 8 weeks, the result of histological analysis demonstrated that more formation of bone was observed in BMSC+ADM groups. Immunohistochemical data showed that the level of OPG in BMSC+ADM groups was higher than the one of the PDLC+ADM groups, but the expression of Collagen Ⅻ was lower than the one of the PDLC+ADM groups. Conclusions The osteogenic capacity of BMSC is higher than PDLC, but the ability of periodontal ligament formation of BMSC is lower than PDLCinvivo.

bone marrow cells; periodontal ligament; guided tissue regeneration, periodontal; dermis; extracellular matrix

R322.41； R329； R336； R781

A

1672-4194(2016)06-0365-05

2016-05-26

福建省衛(wèi)生計生委青年科研課題(2015-1-65)；江蘇省“六大人才高峰”高層次人才培養(yǎng)項目(2013-SWYY-006)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(2015-ZQN-ZD-28)

1.福建醫(yī)科大學(xué) 附屬口腔醫(yī)院牙周科，福州 350002； 2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬口腔醫(yī)院，南京 210008

黃永玲(1983-)，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士

閆福華. Email: yanfh@nju.edu.cn