IL-10拮抗Pg-LPS所致高脂血癥兔枯否氏細胞炎癥反應(yīng)的實驗研究

李艷芬, 許雯靜, 吳春芳, 游曉慶, 駱 凱, 閆福華

IL-10拮抗Pg-LPS所致高脂血癥兔枯否氏細胞炎癥反應(yīng)的實驗研究

李艷芬1, 許雯靜2, 吳春芳1, 游曉慶1, 駱 凱1, 閆福華3

目的 探討白細胞介素-10(IL-10)對牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Pg-LPS)引起的高脂血癥兔肝臟枯否氏細胞(KC)炎癥反應(yīng)的影響。 方法 健康新西蘭兔12只隨機分為2組，分別喂予基礎(chǔ)飼料和高脂飼料。喂養(yǎng)6周后建立高脂血癥模型。分離、收集KC，將正常和高脂組KC隨機分為：對照組、Pg-LPS組(1 μg/mLPg-LPS刺激)、IL-10+Pg-LPS組(0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mLPg-LPS刺激)。刺激24 h后，采用Griess法檢測NO，Western-blot法檢測NF-κB p65及IκB-α，DCFH-DA熒光檢測細胞內(nèi)ROS的表達。 結(jié)果 對照組中高脂KC的NF-κB p65蛋白及NO，ROS水平均高于正常KC。Pg-LPS作用后，正常及高脂KC的炎癥物質(zhì)表達量升高，且高脂血癥與Pg-LPS呈協(xié)同作用。IL-10的干預(yù)處理使NO，ROS，NF- κB p65表達下降，IκB-α表達升高，對Pg-LPS所引起的炎癥反應(yīng)起抑制作用，對高脂KC的抑制作用更加明顯。 結(jié)論 高脂血癥可使KC處于相對激活狀態(tài)。在牙周致病菌Pg-LPS作用下，高脂血癥和Pg-LPS具有協(xié)同作用，IL-10可抑制Pg-LPS所致KC的炎性反應(yīng)，且對高脂狀態(tài)下KC的干預(yù)作用更佳。

*卟啉單胞菌, 牙髓； 脂多糖類； 白細胞介素10； 高脂血癥； 炎癥

高脂血癥(hyperlipemia, HL)又稱為血脂異常，是一種全身性疾病。在HL狀態(tài)下，過多的脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)皮，激活全身的單核/巨噬細胞系統(tǒng)，并吞噬脂質(zhì)形成大量泡沫細胞，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化和脂肪肝等病理性改變[1]。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一種無過量飲酒、以肝實質(zhì)細胞脂肪變及脂肪儲積為特征的臨床病理綜合征，其發(fā)病率隨著肥胖、HL群體的迅速增長而明顯增高?？莘袷霞毎?Kuffer cell，KC)是肝內(nèi)固有的巨噬細胞，占全身單核/巨噬細胞總量的80%～90%，是NASH發(fā)生發(fā)展中重要的免疫細胞[2]。KC受誘導(dǎo)激活后可大量釋放炎癥因子，在脂肪肝到NASH的發(fā)展中起重要作用，也是誘發(fā)進展性肝纖維化的關(guān)鍵因素[3]。研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者高水平的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可激活巨噬細胞的聚集，通過低密度脂蛋白形成泡沫細胞[4]。該結(jié)果提示牙周炎、HL、單核/巨噬細胞三者之間可能存在一定聯(lián)系。白細胞介素-10(interleutin-10，IL-10)是一種免疫調(diào)節(jié)因子，具有潛在的抗炎和免疫抑制功能[5]。本研究擬通過檢測牙齦卟啉單胞菌脂多糖(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS)作用下KC中一氧化氮(nitric oxide, NO)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、核因子-κp p65(nuclear factor-κp p65, NF-κp p65)和IκB-α的表達變化以及IL-10對其調(diào)控作用，以期為研究牙周病和肝臟疾病間的相關(guān)性提供新的細胞學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 健康新西蘭兔12只[中科院上海研究所動物中心，合格證號：SCXK(滬)2007-0007],(2.5±0.5)kg，雌雄不限,喂養(yǎng)于中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科。

1.2 試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；Ⅰ型膠原酶(美國Gibco公司)；Pg-LPS(美國Invitrogen公司)；DCFH-DA(美國Sigma公司)；IL-10(美國Pepro tech公司)；NO檢測試劑盒(武漢碧云天生物技術(shù)公司)；兔抗兔NF-κB p65一抗(美國Abcam公司)；兔抗兔IκB-α一抗(武漢博士德生物公司)；冷凍高速離心機(德國Heraeus公司)；熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 HL新西蘭兔模型的建立 新西蘭兔12只分籠飼養(yǎng)于20 ℃、70%濕度環(huán)境。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組。對照組予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂組參照文獻[6]喂以高脂飼料，配方：基礎(chǔ)飼料+1%膽固醇+5%豬油+15%鮮蛋黃，每日喂養(yǎng)量控制為每只150～200 g，連續(xù)喂養(yǎng)6周。滿6周后抽取耳緣靜脈血，檢測總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)。

1.3.2 細胞的收集、純化、培養(yǎng) 參照文獻[7]的方法，禁食12 h后，戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉下，分離結(jié)扎肝門靜脈和下腔靜脈遠心端，在下腔靜脈近心端插管，引流肝內(nèi)血液。在肝門靜脈入肝處灌注4 ℃預(yù)冷的含肝素鈉的D-Hank’s液，至肝內(nèi)血液流出為土黃色，切下約4 g肝臟，剪碎至1 mm3大小，加入消化液(含0.005%DNase I、 0.1% Ⅰ型膠原酶的D-Hank’s液)，37 ℃水浴震蕩消化30 min，200目細胞篩過濾2次，4 ℃、2 200 r/min離心10 min，棄上清，無血清RPMI 1640洗滌細胞沉淀2次后，重懸，加入含70%和30%梯度的percoll液，4 ℃、2 000 r/min離心25 min，吸取中間的云霧層，即為KC，加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，接種，2 h后洗去非貼壁細胞，以巨噬細胞特異性抗體Macrophagemarker(MAC387)行免疫細胞化學(xué)鑒定，臺盼藍染色檢測細胞存活率，存活率>95%可用。

1.3.3 實驗分組及細胞處理 按不同檢測方法的要求，將6只健康和6只高脂兔KC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度進行接種，接種24 h后更換含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h使其同步化。

實驗分3組：對照組、1 μg/mLPg-LPS組、0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mLPg-LPS組。參照文獻[8-9]，對照組僅加入10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液；IL-10組先加入IL-10，使其終濃度為0.1 μg/mL，2 h后IL-10+Pg-LPS組和Pg-LPS組再分別加入Pg-LPS，使其終濃度為1 μg/mL。

1.3.4 采用Griess法檢測NO 調(diào)整細胞密度為1×106mL-1，接種于6孔板，每孔1 mL。24 h后加藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，經(jīng)0.02%EDTA+0.25%胰酶消化，收集細胞，離心后吸取50 μL上清于96孔細胞培養(yǎng)板中，BCA法進行蛋白定量，按Griess試劑盒說明書用酶標(biāo)儀于波長540 nm測定吸光度，同時繪制標(biāo)準曲線并計算得出個組產(chǎn)生的NO量。結(jié)果以NO濃度/蛋白含量比值表示。

1.3.5 DCFH-DA熒光檢測細胞內(nèi)ROS含量 調(diào)整細胞密度為2×105mL-1，接種于12孔板，每孔1 mL。24 h后，加藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，經(jīng)0.02%EDTA+0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞濃度為2×105mL-1，加入500 μL終濃度為10 μmol/L DCFH-DA，充分混勻，在37 ℃條件下避光反應(yīng)30 min。PBS緩沖液洗滌細胞3次，1 mL PBS重懸，熒光分光光度計檢測熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.3.6 Western-blot法檢測NF-κB p65及IκB-α表達水平 調(diào)整細胞密度為1×106mL-1，接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿，每皿3 mL。24 h后加藥處理并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS緩沖液洗滌細胞1次，用細胞刮子收集細胞，PBS緩沖液洗滌細胞2次。采用胞核/胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取KC的胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白，并分裝于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。用BCA法蛋白定量并配平各上清液濃度。取配平后的各上清液80 μL，100 ℃、10 min變性后，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm孔徑PVDF膜，5%脫脂奶粉、37 ℃封閉1 h后，分別加入1∶200的NF-κB p65一抗、1∶200的IκB-α一抗、1∶300的鼠抗兔GAPDH一抗和1∶300的兔抗兔β-actin一抗，4 ℃孵育過夜后用1∶5 000辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗及辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，37 ℃輕搖1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，膠片曝光。通過Quantity One 4.6.2進行灰度值定量，以各組KC中NF-κB p65/GAPDH、IκB-α/β-actin掃描灰度值計算各組細胞中NF-κB p65及IκB-α的相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 血脂檢測結(jié)果 第6周時，高脂組的TC，TG，HDL-C及LDL-C均明顯高于對照組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。參照HL的診斷標(biāo)準[10]，表明在第6周時，新西蘭兔HL動物模型已成功建立(表1)。

2.2 KC細胞鑒定 免疫細胞化學(xué)染色顯示KC中MAC387呈陽性表達(圖1)。

表1 血脂水平比較

n=6. TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白；LDL-C：低密度脂蛋白. 與對照組比較，△:P<0.05.

2.3 不同處理方式對KC分泌NO的影響 按照Griess試劑盒的說明書繪制標(biāo)準曲線，計算各不同處理組相對NO含量。對照組中高脂KC的NO分泌量顯著高于正常KC的分泌量(P<0.05)。加入Pg-LPS刺激后，高脂及正常KC的NO分泌量均顯著上升(P<0.05)，且高脂KC的NO分泌量高于正常KC，提示高脂和Pg-LPS呈現(xiàn)疊加作用。IL-10對Pg-LPS引起正常KC和高脂KC的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，NO分泌量均降至接近正常對照組水平，顯著低于對照組中高脂KC的分泌量(P<0.05，圖2)。

2.4 不同處理方式對KC中ROS含量的影響 DCFH-DA染色后，熒光酶標(biāo)儀檢測結(jié)果表明，Pg-LPS的刺激可使KC中ROS的含量顯著上升(P<0.05)。IL-10作用后ROS含量均顯著下降(P<0.05)。對照組中高脂KC的ROS表達較正常KC顯著升高(P<0.05)。在Pg-LPS刺激后，ROS升高尤為明顯，高于同組中正常KC的表達量(P<0.05，圖3)。

2.5 不同處理方式對KC中NF-κB p65及IκB-α表達水平的影響 Western-blot法檢測結(jié)果表明，Pg-LPS刺激下正常KC中NF-κB p65及IκB-α表達水平與對照組中正常KC比較無統(tǒng)計學(xué)差別；IL-10干預(yù)后，與對照組中正常KC比較，NF-κB p65表達水平顯著下降(P<0.05)，IκB-α表達水平顯著上升(P<0.05)。對照組中高脂KC的NF-κB p65表達水平比正常KC的表達顯著上升(P<0.05)，加入Pg-LPS后高脂KC中NF-κB p65的表達水平顯著高于對照組中高脂KC的表達，也高于Pg-LPS作用后正常KC的表達(P<0.05)；加入IL-10后，炎癥被明顯抑制，降至對照組正常KC水平(P<0.05)。對照組中高脂KC的IκB-α表達水平與正常KC比較無統(tǒng)計學(xué)差別，Pg-LPS刺激后高脂KC的IκB-α表達水平顯著下降(P<0.05)；IL-10干預(yù)后，高脂及正常KC的IκB-α表達水平與對照組比較均顯著上升，且高脂KC的表達水平顯著低于正常KC(P<0.05，圖4，5)。

3 討 論

HL是指脂質(zhì)代謝或轉(zhuǎn)運異常伴血脂水平過高，可直接引起一些嚴重危害人體健康的疾病。研究顯示，HL狀態(tài)下，血液中IL-6,IL-8等炎癥因子的水平升高，與動脈粥樣硬化等多種全身性疾病密切相關(guān)[11]。相關(guān)機制可能是：HL時，為清除過多的脂質(zhì)，全身單核/巨噬細胞大量增生，功能紊亂，導(dǎo)致對LPS敏感性上調(diào)，炎癥因子表達增加[12]?；罨蟮木奘杉毎煞置诙喾N生物活性物質(zhì)，如ROS,NO,IL-1等。其中NO和ROS具有多種生物學(xué)功能[13]，是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，還具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌等活性。研究發(fā)現(xiàn)，NO與炎癥損傷的多個致病環(huán)節(jié)密切相關(guān)[14]。巨噬細胞在受到免疫或炎癥刺激可合成誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)產(chǎn)生大量NO，并與超氧陰離子等氧自由基反應(yīng)，增加了其對組織細胞的細胞毒性效應(yīng)[15]。高水平的ROS能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，進而導(dǎo)致生化與生理損傷[16]。NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，在許多腫瘤性疾病和炎癥中，NF-κB表達增強，從而調(diào)節(jié)許多與免疫功能和炎癥有關(guān)的基因[17]。NF-κB主要由P50和P65兩亞基組成，在細胞靜息狀態(tài)時與抑制因子IκB結(jié)合，形成NF-κB/IκB復(fù)合體，使NF-κB以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中，一旦被胞外刺激信號刺激后，IκB激酶激活，IκB蛋白磷酸化并被蛋白酶降解，NF-κB與IκB解離，活化的NF-κB轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)控基因表達[18]。IκB的降解程度可決定NF-κB的活化水平，IκB的含量與NF-κB的活化水平成反比。研究發(fā)現(xiàn)，ROS可通過細胞信號系統(tǒng)調(diào)控，活化NF-κB p65-P50異源二聚體，從而激活NF-κB[19]。何姜等研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65蛋白表達的增加會導(dǎo)致iNOS表達增加，從而引起細胞NO水平升高[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組中高脂KC的NF-κB p65蛋白及NO,ROS水平均高于正常KC，提示HL新西蘭兔KC處于一種相對激活狀態(tài)，與之前研究結(jié)果相符。

Pg-LPS可通過與單核/巨噬細胞表面的受體結(jié)合，使宿主免疫體系激活，引起全身的炎癥反應(yīng)。研究表明，LPS通過Toll受體、MD2及CD14等膜表面受體與KC結(jié)合[21]，誘導(dǎo)NF-κB及AP-1等磷酸化和核移位[22]，KC激活后釋放氧化亞氮、超氧負離子等活性氮的中間產(chǎn)物，活性脂質(zhì)、細胞因子等免疫反應(yīng)所必需的介質(zhì)，而這些介質(zhì)的過多釋放將導(dǎo)致細胞的壞死和組織的損傷[23]。本研究觀察到，在Pg-LPS刺激下，不僅正常KC的ROS,NO表達量與對照組中正常KC顯著升高，高脂KC的ROS,NO,NF-κB p65表達量與對照組中高脂KC比較，也顯著升高。同時，IκB-α的表達量卻顯著下降，且上述結(jié)果與Pg-LPS刺激下正常KC比較，差別也有統(tǒng)計學(xué)意義。Pg-LPS+高脂KC組表達量變化與對照組、Pg-LPS+正常KC組比較，差別也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明牙周致病菌Pg-LPS對KC有誘導(dǎo)活化作用，使其分泌的炎癥介質(zhì)增加。HL和Pg-LPS對KC的誘導(dǎo)活化作用具有協(xié)同作用，提示患有牙周炎的HL患者罹患NASH的風(fēng)險可能要大于單純的牙周炎患者和HL患者。

IL-10具有抗炎和免疫抑制作用，在巨噬細胞和T細胞介導(dǎo)的急性肝損傷中具有顯著的肝臟保護作用[24]。夏陽等研究表明，IL-10可以抑制由TNF-α誘導(dǎo)的肝星狀細胞激活，在肝臟早期炎癥和肝纖維化進程中起保護作用[25]。本實驗結(jié)果表明，0.1 μg/mL IL-10對Pg-LPS所引起的正常和HL新西蘭兔KC的炎癥反應(yīng)都起到抑制作用，并且對HL新西蘭兔炎癥介質(zhì)下調(diào)的幅度明顯大于正常新西蘭兔，提示外源性的IL-10對KC活化后誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起抑制作用，有利于保護肝臟的正常組織、細胞和功能，且可能對HL患者的肝臟保護效果更顯著。

綜上所述，Pg-LPS能有效地誘導(dǎo)KC活化，從而引起一系列炎癥介質(zhì)、生物活性物質(zhì)等的表達和釋放，對肝的正常組織細胞產(chǎn)生損害，特別是HL的患者，加大其罹患NASH的風(fēng)險。IL-10能有效地降低Pg-LPS所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，且對HL個體的炎癥抑制作用更加明顯。研究結(jié)果可能為深入探討牙周病與肝臟疾病的關(guān)系和防治方法提供新的細胞學(xué)證據(jù)。

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(編輯:張慧茹)

Experimental Study of IL-10 anta Ponizing Inflammatory Reaction of Kuffer Cell Induced byPg-LPS in Hyperlipidemia Rabbit

LI Yanfen1, XU Wenjing2,WU Chunfang1, YOU Xiaoqing1, LUO Kai1,YAN Fuhua3

1.Department of Periodontology,School and Hospital of Stomatology, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, China;2.Department of Stomatology, People’s Hospital of Fujian Province, Fuzhou 350004, China;3. Nanjing Stomatological Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008, China

Objective To explore the effect of interleukin-10 on inflammatory reaction of Kuffer cell following thePg-LPS stimulation in hyperlipidemia rabbit. Methods 12 New Zealand rabbits were randomly divided into two groups and were fed with normal or high fat diet. The hyperlipidemia model was established 6 weeks later. We isolated and cultured the Kuffer cells (KC). Both normal and hyperlipidemia group were divided into 3 groups: control,Pg-LPS at 1 μg/mL, andPg-LPS at 0.1 μg/mL IL-10+1 μg/mL. After the treatment for 24 h, NO levels were detected by Griess assay. NF-κB p65 and IκB-α fragment were inspected by Western blot. ROS levels were determined by fluorescence enzyme-labelled meter with DCFH-DA as fluorescent probe. Results The levels of NF-κB p65,NO and ROS were higher in hyperlipidemia control group than in normal control group. After being stimulated byPg-LPS, the expression of inflammatory substances was increased indicating a synergistic effect between hyperlipidemia andPg-LPS. Under the IL-10 treatment the expression of NO,ROS,NF-κB p65 were decreased, while the expression of IκB-α was increased. IL-10 inhibited the inflammatory reaction induced byPg-LPS, and the inhibition was more significant in the KC of hyperlipidemia rabbit. Conclusion The KC of hyperlipidemia rabbit is in a relatively activated condition, after being stimulated byPg-LPS, hyperlipidemia andPg-LPS present a synergistic effect. IL-10 can inhibit the inflammatory reaction of KC after thePg-LPS stimulation, and the effect is better for the KC with hyperlipidemia.

porphyromonas endodontalis； lipopolysaccharides； interleukin-10； hyperlipidemias； inflammation

2016-08-22

國家自然科學(xué)基金(30973326)；福建省自然科學(xué)基金(2013J01306)；福建省教育廳科研基金(JA11123)

1.福建醫(yī)科大學(xué) 附屬口腔醫(yī)院牙周科，福州 350002; 2.福建省人民醫(yī)院 口腔科，福州 350004; 3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬口腔醫(yī)院，南京 210008

李艷芬(1979-),女,副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士

閆福華. Email: fhyan2005@126.com

R332； R378.84； R392.12； R977

A

1672-4194(2016)06-0359-06