HBx通過Wnt/β-catenin通路促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖

鄭碧云， 方雪芬， 陳治新， 高雯宇， 李 丹， 王小眾

HBx通過Wnt/β-catenin通路促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖

鄭碧云， 方雪芬， 陳治新， 高雯宇， 李 丹， 王小眾

目的 探討Wnt/β-catenin通路在穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)的HepG2肝癌細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制。 方法 驗證前期構(gòu)建的HepG2/HBx細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白。CCK-8法檢測HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細(xì)胞增殖情況，RT-PCR及Western-blot法分別檢測上述3種細(xì)胞中β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平；最后檢測β-catenin選擇性抑制劑XAV939(20 μmol/L)對各組細(xì)胞增殖水平的影響。 結(jié)果 前期構(gòu)建的HepG2/HBx 細(xì)胞株能穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白。細(xì)胞增殖實驗表明，HepG2/HBx組細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于對照組(P<0.05)。RT-PCR及Western-blot檢測結(jié)果顯示，HepG2/HBx組細(xì)胞中β-catenin的 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)，而HepG2/mock及HepG2組細(xì)胞之間則無明顯差別。XAV939能夠抑制各組細(xì)胞的增殖能力，HepG2/HBx組細(xì)胞在加入20 μmol/L XAV939作用后的增殖速度較加入相同濃度DMSO的HepG2/HBx組細(xì)胞下降(P<0.05)。XAV939對HepG2/HBx組細(xì)胞增殖的抑制強(qiáng)于對照組。 結(jié)論 HBx蛋白可以上調(diào)肝細(xì)胞β-catenin表達(dá)，激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。選擇性β-catenin抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)該作用。

病毒蛋白質(zhì)類； 乙型肝炎病毒x蛋白； 細(xì)胞增殖； 反式激活因子類； 原癌基因

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是全球主要的人類病原體之一，它的慢性感染將導(dǎo)致一系列肝臟疾病的發(fā)生，包括肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌。在HBV編碼的蛋白質(zhì)中，HBx蛋白被稱為“病毒癌蛋白”，它能促進(jìn)細(xì)胞增殖，與宿主因素之間相互作用促進(jìn)了HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展[1-3]。近年來，越來越多的研究關(guān)注到Wnt/β-catenin信號通路。它在細(xì)胞增殖、分化、癌變中同樣起著重要角色，與肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。因此，Wnt/β-catenin信號通路可能在HBV感染慢性化以及肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起作用。本研究以前期構(gòu)建好的穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的HepG2/HBx肝癌細(xì)胞為研究對象，觀察其增殖情況以及細(xì)胞β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平，然后加入β-catenin選擇性抑制劑XAV939，觀察其對肝癌細(xì)胞增殖的影響，初步探討Wnt/β-catenin在穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白的HepG2/HBx肝癌細(xì)胞增殖中的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 HepG2/HBx細(xì)胞(轉(zhuǎn)染重組HBx慢病毒載體的HepG2肝癌細(xì)胞)、HepG2/mock細(xì)胞(轉(zhuǎn)染慢病毒空載體的HepG2肝癌細(xì)胞)、HepG2細(xì)胞均由本實驗室前期構(gòu)建與凍存[5]。

1.1.2 試劑 小鼠抗人Flag 單克隆抗體(美國Abmart公司)；小鼠抗人β-catenin一抗、小鼠抗人β-actin 單克隆抗體、兔抗小鼠二抗、蛋白印跡實驗的ECL顯色試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；XAV939(美國Selleck Chemicals公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本DOJINDO公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒(美國Thermo公司)；100 bp DNA Ladder(加拿大Fermentas公司)；BCA蛋白定量試劑盒、哺乳動物細(xì)胞總蛋白抽提試劑(碧云天生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器 PCR儀(AB2720型，美國AB公司)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-5型，北京六一儀器廠)；蛋白電泳及轉(zhuǎn)印設(shè)備(美國Bio-Rad公司);倒置相差熒光顯微鏡(TE2000-U，日本尼康公司);凝膠成像儀Tanon-2500(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 驗證前期凍存的HepG2/HBx細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HBx基因

1.2.1.1 倒置熒光顯微鏡觀察HepG2/HBx細(xì)胞株GFP蛋白表達(dá)情況 重組慢病毒載體攜帶GFP基因，能表達(dá)GFP蛋白，在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光。將HepG2/HBx細(xì)胞、HepG2/mock細(xì)胞、HepG2細(xì)胞從液氮罐中取出復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待長至80%左右，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞GFP表達(dá)情況。

1.2.1.2 RT-PCR法鑒定HepG2/HBx細(xì)胞株的HBx mRNA表達(dá)情況 培養(yǎng)HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁長至80%融合后收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總RNA，合成cDNA，PCR擴(kuò)增所需HBx基因片段(產(chǎn)物大小465 bp)：

上游引物：5′ATG CAA GCT TAT GGC TGC TAG GCT GTA CTG 3′

下游引物：5′TGC GAA TTC TTA GGC AGA GTG AAA AAG TTG 3′

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min→94 ℃變性45 s→61 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取 8 μL RT-PCR產(chǎn)物與2 μL的5×Loading Buffer混合均勻，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，恒壓100 V電泳30 min，在紫外燈下觀察結(jié)果并照相。

1.2.1.3 Western-blot 法鑒定HepG2/HBx細(xì)胞株的HBx蛋白表達(dá)情況 培養(yǎng)HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁長至80%融合后收集細(xì)胞，分別加入1 mmol/L PMSF的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白。經(jīng)過BCA蛋白定量、變性、12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印至NC膜、脫脂奶粉封閉后，分別與小鼠抗人flag一抗(1∶1 000)及鼠抗人β-actin 單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗滌后再分別與山羊抗小鼠二抗(1∶2 000)、兔抗小鼠二抗(1∶2 500)作用l h，經(jīng)ECL底物化學(xué)發(fā)光顯影，掃描為圖片，經(jīng)Image J軟件測量膠片中條帶灰度值。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)期生長的HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化，配成單個細(xì)胞懸液，按每孔100 μL、3×103細(xì)胞接種于96孔板，并設(shè)6個復(fù)孔，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)1,2及3 d后，取出96孔板，棄去原有培養(yǎng)液，用PBS洗滌后，加入CCK-8試劑與培養(yǎng)基的混合液，比例為CCK-8∶培養(yǎng)基=10 μL∶100 μL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后，在波長450 nm下檢測每孔的吸光值(OD)。根據(jù)吸光值繪制生長曲線，比較各組細(xì)胞生長速度變化。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR法檢測細(xì)胞β-catenin mRNA表達(dá) 培養(yǎng)HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁長至80%融合后收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞RNA，合成cDNA，PCR擴(kuò)增所需β-catenin基因片段(產(chǎn)物大小533 bp)：

上游引物：5′AAA TGG TTG CCT TGC TCA AC 3′

下游引物：5′TCA GCA CTC TGC TTG TGG TC 3′

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min→94 ℃變性45 s→58 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取8 μL RT-PCR 產(chǎn)物與2 μL的5×Loading Buffer混合均勻，加在12 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 g/L Goodview)上進(jìn)行電泳，恒壓100 V電泳20 min，在紫外燈下觀察結(jié)果并照相。

1.2.4 Western-blot法檢測細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá) 培養(yǎng)HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁長至80%融合后收集細(xì)胞，分別加入1 mmol/L PMSF的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集蛋白。經(jīng)過BCA蛋白定量、變性、12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)印至NC膜、脫脂奶粉封閉后，分別與小鼠抗人β-catenin單克隆抗體(1∶1 000)及小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)在4 ℃條件下孵育過夜，再與兔抗小鼠二抗(1∶2 500)作用1 h。經(jīng)ECL底物化學(xué)發(fā)光顯影，掃描為圖片，經(jīng)Image J軟件測量膠片中條帶灰度值。

1.2.5 XAV939對細(xì)胞增殖的影響 HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2細(xì)胞培養(yǎng)法同上，待細(xì)胞貼壁后，吸出原培養(yǎng)基，3組細(xì)胞分別加入含20 μmol/L XAV939的培養(yǎng)基100 μL培養(yǎng)24 h，另外以相同體積含DMSO(最終濃度<0.3%)但不含XAV939的培養(yǎng)基設(shè)為對照組培養(yǎng)24 h。經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化，用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖(方法同上述)。實驗重復(fù)3次。利用OD值計算細(xì)胞增殖抑制率：

抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 RT-PCR凝膠電泳以及Western-blot圖片采用Image J圖像分析軟件進(jìn)行掃描分析，獲得灰度值數(shù)據(jù)，經(jīng)過內(nèi)參照β-actin條帶灰度進(jìn)行校正，校正灰度值以mean±SD表示。利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，采用單因素ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗，P<0.05為差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 前期凍存的HepG2/HBx細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)HBX基因 倒置熒光顯微鏡下可見新復(fù)蘇的HepG2/HBx細(xì)胞株能產(chǎn)生綠色熒光(圖1A)，僅有HepG2/HBx細(xì)胞有HBX基因mRNA表達(dá)(大小約465 bp)與HBx蛋白表達(dá)(大小約17 kD)，而感染空載病毒的HepG2/mock細(xì)胞與對照組HepG2細(xì)胞不表達(dá)HBX基因mRNA與HBx蛋白(圖1Ba,b)。由此可見，本實驗室前期凍存的HepG2/HBx細(xì)胞株依然能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)HBX基因。

2.2 HBx蛋白促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖 CCK-8檢測3組細(xì)胞增殖能力情況。在第1，2及3天HepG2/HBx細(xì)胞組的增殖速度較HepG2/mock組與HepG2組升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)，這與前期在穩(wěn)定表達(dá)HBx的正常肝細(xì)胞HL7702中的研究結(jié)果一致[6]。

2.3 HBx蛋白上調(diào)HepG2細(xì)胞β-catenin mRNA與蛋白表達(dá)水平 HepG2/HBx,HepG2/mock及HepG2 3組細(xì)胞β-catenin mRNA/β-actin mRNA的相對灰度比值分別為(2.846 6±0.284 2)，(1.784 8±0.285 4)及(1.070 3±0.657 8)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，HepG2/HBx組中β-catenin mRNA較HepG2/mock組及HepG2組升高(圖3)，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Western-blot提示，各組細(xì)胞均有β-catenin蛋白表達(dá)(圖3Ba)。經(jīng)灰度值掃描對比分析顯示，HepG2/HBx，HepG2/mock及HepG2 3組細(xì)胞β-catenin/β-actin蛋白的相對灰度比值分別為(0.739 5±0.026 4),(0.536 1±0.033 5),(0.552 7±0.042 5)。統(tǒng)計學(xué)分析提示，HepG2/HBx組中β-catenin蛋白水平較HepG2/mock組及HepG2組升高(圖3Bb)，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 加入β-catenin抑制劑XAV939后HepG2/HBx細(xì)胞增殖活性 經(jīng)20 μmol/L XAV939的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，6組細(xì)胞增殖能力情況如圖4所示。統(tǒng)計學(xué)分析提示，XAV939能夠抑制各組細(xì)胞的增殖，HepG2/HBx組細(xì)胞在加入20 μmol/L XAV939的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后繼續(xù)培養(yǎng)1，2及3 d 的增殖速度較未加藥的HepG2/HBx組下降，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。XAV939對HepG2/HBx組細(xì)胞的增殖抑制作用高于HepG2/mock及HepG2組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

Tab 1 Detection of the proliferation inhibition rate of HepG2/HBx, HepG2/mock and HepG2 cells treated with XAV939

分 組t/d123HepG2/HBx0．3086±0．0212△0．3537±0．0274△0．4108±0．0129△HepG2/mock0．1923±0．01990．2235±0．02220．2887±0．0336HepG20．1887±0．01360．2029±0．03200．2960±0．0632

n=6. 與HepG2/mock及HepG2組比較，△:P<0.05.

3 討 論

目前全球肝細(xì)胞癌的年發(fā)病數(shù)為75萬，是僅次于肺癌的癌癥致死原因。其中HBV感染者占大約二分之一。HBx蛋白是一種多功能蛋白，它能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA修復(fù)等，促進(jìn)了HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展[1-2,7]，然而其具體作用機(jī)制尚未完全明確，可能涉及多個關(guān)鍵分子與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白通過與Akt相互作用，促進(jìn)了細(xì)胞增殖并導(dǎo)致其往致瘤性轉(zhuǎn)化[8]；還有學(xué)者指出，HBx蛋白能夠依賴胞內(nèi)鈣信號調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)、亦能調(diào)控LASP-1蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖[9-10]。而本研究通過CCK-8實驗也發(fā)現(xiàn)，HBx蛋白可促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖，支持以上的觀點。

Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了多種生理過程、胚胎發(fā)育和癌癥的發(fā)生，它的異?；罨ㄟ^促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)血管生成因子如MMP-2，VEGF-A的水平導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移[11]。Wnt與受體復(fù)合物結(jié)合后被激活，抑制下游蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括AXIN，GSK-3與APC蛋白，從而激活β-catenin。Shen等研究發(fā)現(xiàn)，在肝祖細(xì)胞中，HBx蛋白能上調(diào)β-catenin的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞中，β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平都上調(diào)了，這說明了Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HepG2/HBx細(xì)胞中激活了，β-catenin是Wnt信號通路的一個關(guān)鍵組成部分，其易位至細(xì)胞核將發(fā)起下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，比如c-myc基因和cyclinD1的轉(zhuǎn)錄[13]，由此可見，β-catenin是否易位至細(xì)胞核并發(fā)起下游靶基因的轉(zhuǎn)錄是后續(xù)研究的方向。而為進(jìn)一步探討β-catenin的表達(dá)上調(diào)與HBx蛋白促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖的關(guān)系，本研究加入了β-catenin選擇性抑制劑XAV939進(jìn)行干預(yù)后再檢測細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果提示，XAV939干預(yù)后細(xì)胞增殖受到抑制，尤其是在高表達(dá)HBx蛋白的HepG2/HBx組，增殖抑制率更加明顯，這預(yù)示著HepG2/HBx組細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)上調(diào)與HBx蛋白促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖的作用密切相關(guān)。

XAV939是端錨聚合酶1(TNKS1)以及端錨聚合酶2(TNKS2)蛋白的抑制劑，它通過穩(wěn)定AXIN的水平下調(diào)β-catenin的表達(dá)與活性，因此端錨聚合酶被認(rèn)定為抗腫瘤分子治療的候選目標(biāo)之一[14]，而學(xué)者們也對XAV939抗癌作用展開了研究，發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌、乳腺癌中都發(fā)揮了抗癌效應(yīng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入XAV939后，HepG2/HBx細(xì)胞的增殖速率下降了。基于Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中起到的重要作用，筆者推測端錨聚合酶抑制劑將對HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌的治療有潛在的臨床應(yīng)用前景，而這有待進(jìn)一步更深入的研究證實。

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(編輯:張慧茹)

Hepatitis B Virus x Protein (HBx) Enhanced the Proliferation of HepG2 Cells Through Wnt/β-catenin Pathway

ZHENG Biyun, FANG Xuefen, CHEN Zhixin, GAO Wenyu, LI Dan, WANG Xiaozhong

Department of Gastroenterology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

Objective To observe the effect of Wnt/β-catenin pathway on the proliferation of HepG2 cells expressing hepatitis B virus x protein (HBx) stably. Methods We verified that HepG2/HBx cell lines constructed previously in our lab could stably express HBx protein. Then, cell-counting Kit-8 (CCK-8) assay was used to detect the proliferation of HepG2/HBx, HepG2/mock and HepG2 cells. RT-PCR and Western-bolt were used to examine the level of β-catenin mRNA and protein expression in cells of the three cell groups. Finally, the level of cell proliferation was measured respectively aftertreated with 20 μmol/L β-catenin selective inhibitor XAV939 for 24 h. Results HepG2/HBx cell lines constructed previously in our lab could stably expressing HBx protein. CCK-8 assay displayed that the proliferation rate of HepG2/HBx was higher than that of HepG2/mock and HepG2 cells．The level of β-catenin mRNA and protein expression was greater in HepG2/HBx cells compared with that of HepG2/mock and HepG2 cells(P<0.05)． β-catenin selective inhibitor XAV939 suppressed cell growth of the three groups. HepG2/HBx cells with XAV939 showed lower proliferation rate than that with DMSO. The proliferation inhibition rate of HepG2/HBx cells was significantly higher than that of other two groups at three time points(P<0.05)． Conclusion The results indicate that HBx up-regulates β-catenin expression to activate wnt/β-catenin pathway and then promotes HepG2 cells proliferation.

viral proteins； hepatitis B virus； cell proliferation； trans-activators； proto-oncogene

2016-06-12

國家自然科學(xué)基金青年項目(81300321)；福建省財政專項經(jīng)費(閩財指[2015]1297號)；福建省自然科學(xué)基金青年項目(2016J05189)；福建省衛(wèi)計委中青年骨干重點項目(2014-ZQN-ZD-9)；福建省臨床醫(yī)學(xué)重點專科資助項目(閩衛(wèi)科教[2012]149號)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院消化科，福州 350001

鄭碧云(1986-)，女，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士

王小眾．Email：drwangxz@163.com

R341； R345； R394.2； R730.2； R735.7； R977.3； R977.6

A

1672-4194(2016)06-0354-06