響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖

呂雯姣，余兆碩，唐柳歡，嵇宏杰，彭彰文，吳竹青

（吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首416000）

響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖

呂雯姣，余兆碩，唐柳歡，嵇宏杰，彭彰文，*吳竹青

（吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首416000）

以荸薺為原料，采用超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖，探討超聲波輔助條件下提取時(shí)間、提取溫度、α-淀粉酶添加量和料液比對(duì)荸薺多糖提取效果的影響；應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，依據(jù)響應(yīng)面分析確定最優(yōu)的提取工藝條件。結(jié)果表明，荸薺多糖最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度56℃，提取時(shí)間47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，在此條件下荸薺多糖得率11.95%。

荸薺多糖；超聲波輔助；水酶法；工藝條件

荸薺（Eleocharis dulcis） 屬單子葉莎草科，主要生長(zhǎng)于廣西、湖南等地的低洼地區(qū)。荸薺的藥理作用眾多，具有清熱解毒、涼血生津、利尿通便、化濕祛痰、消食除脹的功效。據(jù)研究報(bào)道，在荸薺中所含生物類(lèi)多糖具有促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育、加快體內(nèi)三大物質(zhì)（糖、脂肪、蛋白質(zhì)）代謝、維持生理功能的需要、調(diào)節(jié)酸堿平衡等功能。

目前，用于荸薺多糖的提取分離方法主要有水提法、乙醇-水溶劑提取法、微波提取法和超聲波提取法。近年來(lái)，超聲波輔助水酶提取法由于提取溫度低、操作簡(jiǎn)便、微量提取效率高、不破壞提取物結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，已被廣泛用于天然植物有效成分的提取中[1]。

荸薺多糖的提取工藝受諸多因素影響，各因素間也存在著交互作用。因此，為了得出最優(yōu)工藝條件，采用超聲波輔助水酶法通過(guò)單因素和響應(yīng)面法分析優(yōu)化試驗(yàn)。對(duì)超聲波提取溫度和提取時(shí)間、料液比、酶添加量進(jìn)行研究，獲得響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖的優(yōu)化工藝[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

荸薺，購(gòu)于吉首市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；α-淀粉酶（2 000 U/g）；葡萄糖、無(wú)水氯化鈣、苯酚、濃硫酸、正丁醇、三氯甲烷、95%乙醇，均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)儀器

722型分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-501A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鄭州特爾儀器有限公司產(chǎn)品；101-2AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；超聲波提取器；HH-S型恒溫水浴，江蘇金華市醫(yī)療儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；FDS-series型真空冷凍干燥機(jī)，SIMInternational Group產(chǎn)品；LXJ-IIB型飛鴿牌離心機(jī)，上海愛(ài)奉機(jī)電設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 荸薺多糖提取工藝流程

1.3.1 材料預(yù)處理

取200 g新鮮荸薺，洗凈、去皮，切成2～3 mm厚的薄片，于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中65℃充分烘干，并用研缽粉碎。

1.3.2 工藝流程

荸薺→烘干粉碎、制液→超聲波水提→α-淀粉酶去淀粉→高溫滅活酶→離心→取上清液（粗提液）→Sevage法脫蛋白→萃取→取上清液→醇析→離心→取下層沉淀→真空冷凍干燥→粗荸薺多糖[3]。

1.4 荸薺多糖得率計(jì)算

荸薺多糖得率：

式中：Y——荸薺多糖質(zhì)量；

m——荸薺多糖質(zhì)量；

w——荸薺粉末質(zhì)量。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 單因素試驗(yàn)

研究料液比、α-淀粉酶添加量、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)荸薺多糖得率的影響，首先做單因素試驗(yàn)考察以上條件對(duì)荸薺多糖得率的影響，然后采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳工藝條件，作為荸薺多糖提取指標(biāo)。在不同料液比（1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶18，1∶20），不同提取溫度（50，55，60，65，70℃），不同提取時(shí)間（25，30，35，40，45，50 min）和不同α-淀粉酶添加量（3.6×103U，4.0×103U，4.4× 103U，4.8×103U，5.2×103U）等條件下，考察各個(gè)因素對(duì)荸薺多糖得率的影響[4-5]。

1.5.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以料液比、α-淀粉酶添加量、提取時(shí)間和提取溫度為考察因素，以荸薺多糖得率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化[6]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Design-Expert軟件（Version 7.1 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸和方差分析，模型及因素的顯著性均通過(guò)F值考察（p＜0.05），所有試驗(yàn)均需做3個(gè)重復(fù)[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 荸薺多糖提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)荸薺多糖得率的影響

提取溫度對(duì)荸薺多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，提取溫度為55℃時(shí)荸薺多糖得率最大。因?yàn)樘崛囟鹊陀?5℃時(shí)，分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)小，物料的空化作用不夠完全，從而降低了得率；提取溫度高于55℃后，由于物料略有糊化，可能使得荸薺多糖得率降低，故選擇提取溫度為55℃。

圖1 提取溫度對(duì)荸薺多糖得率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)荸薺多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)荸薺多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)荸薺多糖得率的影響

由圖2可知，起初荸薺多糖得率隨提取時(shí)間的增加而增大，當(dāng)超聲處理時(shí)間為45 min時(shí)達(dá)到最大值，之后隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)得率逐漸下降。由于超聲波作用在開(kāi)始的時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞膜的破碎作用比較大，細(xì)胞溶出物多，得率不斷升高；當(dāng)溶解度達(dá)到飽和時(shí)，有效成分不再被溶解，故提取時(shí)間選擇45 min。

2.1.3 料液比對(duì)荸薺多糖得率的影響

料液比對(duì)荸薺多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)荸薺多糖得率的影響

由圖3可知，料液比由1∶10變化到1∶12時(shí)荸薺多糖得率逐漸增加，但料液比達(dá)到1∶16時(shí)得率下降，1∶14時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)榱弦罕?∶16時(shí)，溶液的黏度較大，影響分子擴(kuò)散速率，使得體系分散不均勻，可能導(dǎo)致局部pH值過(guò)高，酶失去活性。

2.1.4 α-淀粉酶酶添加量對(duì)荸薺多糖得率的影響

α-淀粉酶添加量對(duì)荸薺多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，α-淀粉酶添加量為4.0×103U時(shí)荸薺多糖的得率增加迅速，其原因?yàn)榧尤朊钢苿┖螅梢杂行Ы到庵参锛?xì)胞壁的纖維素骨架，崩潰植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)有效成分釋出，從而提高了多糖得率；隨著α-淀粉酶添加量的進(jìn)一步增加，酶解效果反而下降，其原因可能是酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，使提取的荸薺多糖分子與α-淀粉酶形成了復(fù)合體系，使酶的活力受到了抑制。因此，確定α-淀粉酶添加量為4.0×103U。

圖4 α-淀粉酶添加量對(duì)荸薺多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定提取溫度50～60℃，提取時(shí)間40～50 min，料液比1∶12～1∶16，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法來(lái)優(yōu)化提取條件[8-10]。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

通過(guò)分析，可以得到荸薺多糖提取條件與荸薺多糖得率之間的二次多項(xiàng)式模型：

式中：Y——荸薺多糖得率的預(yù)測(cè)值；

X1——提取溫度的編碼值；

X2——提取時(shí)間的編碼值；

X3——料液比的編碼值；

X4——α-淀粉酶添加量的編碼值。

F檢驗(yàn)反映的是回歸模型的有效性，包括失擬性檢驗(yàn)和回歸方程顯著性檢驗(yàn)。方差分析結(jié)果（表3）顯示，方程復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.969 0，說(shuō)明該模型極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)在0.05水平上不顯著；R2adj=0.932 9，說(shuō)明建立的模型能夠解釋93.29%響應(yīng)值的變化，能很好地描述超聲波輔助水酶法提取荸薺多糖得率隨提取條件的變化規(guī)律。因此，該模型具有可行性。

由表3可知，因素X1，X2，X3，X4，X1X3，X2X4，X12，X22，X32，X42對(duì)荸薺多糖得率的影響極顯著（p＜0.01），X1X4，X3X4對(duì)荸薺多糖得率的影響較顯著（p＜0.05），X2X3，X1X2對(duì)荸薺多糖得率的影響不顯著（p＞0.05）。為了便于對(duì)模型進(jìn)行分析討論，不顯著的項(xiàng)沒(méi)有去掉。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

2.3 二因素間的交互作用分析

由方程（1）所作的響應(yīng)面及等高線(xiàn)見(jiàn)圖5～圖8，各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過(guò)該組圖直觀(guān)反映出來(lái)。等高線(xiàn)的形狀反映了交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示兩兩交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。

2.3.1 提取溫度和料液比的交互作用分析

提取溫度與料液比響應(yīng)面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度與料液比響應(yīng)面和等高線(xiàn)

由圖5可知，提取溫度和料液比的交互作用達(dá)極顯著水平，將提取時(shí)間和α-淀粉酶添加量固定在零水平，可以得到提取溫度和料液比對(duì)荸薺多糖得率影響的方程：

另可看出，隨著提取溫度和料液比的增加，荸薺多糖得率增加。但是，提取溫度過(guò)高、料液比過(guò)大都不利于荸薺多糖的析出。所以，提取溫度56℃，料液比1∶12～1∶14時(shí)，荸薺多糖得率最高。

2.3.2 提取溫度和酶添加量的交互作用分析

提取溫度與α-淀粉酶添加量響應(yīng)面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖6。

由圖6可知，提取溫度和酶添加量的交互作用達(dá)顯著水平，將提取時(shí)間和料液比固定在零水平，可以得到提取溫度和α-淀粉酶添加量對(duì)荸薺多糖得率影響的方程：

圖6 提取溫度與酶添加量響應(yīng)面和等高線(xiàn)

另可看出，隨著提取溫度和酶添加量的增加，荸薺多糖得率增加。但是，提取溫度過(guò)高，α-淀粉酶添加量過(guò)大都不利于荸薺多糖的析出。所以，提取溫度56℃，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U時(shí)，荸薺多糖得率最高。

2.3.3 提取時(shí)間和酶添加量的交互作用分析

提取時(shí)間與酶添加量響應(yīng)面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖7。

圖7 提取時(shí)間與α-淀粉酶添加量響應(yīng)面和等高線(xiàn)

由圖7可知，提取時(shí)間和α-淀粉酶添加量的交互作用達(dá)極顯著水平，將提取溫度和料液比固定在零水平，可以得到提取時(shí)間和α-淀粉酶添加量對(duì)荸薺多糖得率影響的方程：

隨著提取時(shí)間和α-淀粉酶添加量的增加，荸薺多糖得率增加。但是，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，α-淀粉酶添加量過(guò)大都不利于多糖的析出。所以，提取時(shí)間46～47 min，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U時(shí)，荸薺多糖得率最高。

2.3.4 料液比和酶添加量的交互作用分析

料液比與α-淀粉酶添加量響應(yīng)面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖8。

圖8 料液比與α-淀粉酶添加量響應(yīng)面和等高線(xiàn)

由圖8可知，料液比和α-淀粉酶添加量的交互作用達(dá)顯著水平，將提取溫度和提取時(shí)間固定在零水平，可以得到料液比和α-淀粉酶添加量對(duì)荸薺多糖得率影響的方程：

另可看出，隨著料液比和酶添加量的增加，荸薺多糖得率增加。但是，料液比過(guò)大，α-淀粉酶添加量過(guò)大都不利于荸薺多糖的析出。所以提取時(shí)間46～47 min，α-淀粉酶添加量4.0×103～4.8×103U時(shí)，荸薺多糖得率最高。

2.4 模型的優(yōu)化和驗(yàn)證

通過(guò)分析可以得到最佳的提取條件為提取溫度56.37℃，提取時(shí)間47.38 min，料液比1∶13.66，酶添加量4.4×103U，荸薺多糖得率可達(dá)12.35%。根據(jù)實(shí)際情況，選擇提取溫度56℃，提取時(shí)間47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，測(cè)定荸薺多糖得率為11.95%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該模型可以較好地預(yù)測(cè)超聲波輔助水酶法提取條件與荸薺多糖得率之間的關(guān)系，同時(shí)也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化荸薺多糖提取工藝參數(shù)的可行性。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了提取溫度和提取時(shí)間、料液比、酶添加量對(duì)荸薺多糖得率的影響，將提取溫度考查范圍定為50～60℃、提取時(shí)間考查范圍定為40～50 min、料液比考查范圍定為1∶12～1∶14、α-淀粉酶添加量的考查范圍定為4.0×103～4.8× 103U，通過(guò)響應(yīng)面法分析，建立了超聲輔助水酶法提取荸薺多糖得率數(shù)學(xué)模型回歸方程的決定系數(shù)0.969 0，方程顯著，擬合良好，可以進(jìn)行實(shí)際預(yù)測(cè)。應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化出其最佳超聲提取條件為提取溫度56℃，提取時(shí)間47 min，料液比1∶14，α-淀粉酶添加量4.4×103U，最高得率為11.95%，為地區(qū)工業(yè)化利用豐富的荸薺資源、提取多糖提供了生產(chǎn)數(shù)據(jù)。同時(shí)，采用超聲法輔助水酶法從荸薺中提取多糖成分的方法提取速度快，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，具有一定的地區(qū)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

[1]景榮琴，熊清平，景怡.響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚多糖的超聲波輔助提取工藝條件 [J].天然產(chǎn)物與開(kāi)發(fā)，2014（4）：570-574.

[2]吉仙枝.超聲波協(xié)同α-淀粉酶提取野生山藥多糖工藝研究 [J].三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，14（1）：140-144.

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[10]Shi Yun-lai，Chen Chao.Optimal design of butterflyshaped linear ultrasonic motor using finite element method and response surface methodology[J].Journal of Central South University，2013，20：393-404.◇

Optimization of Eleocharis Dulcis Polysaccharides Extraction with Ultrasonic Assistant Aqueous Enzymatic by Response Surface Methodology

LV Wenjiao，YU Zhaoshuo，TANG Liuhuan，JI Hongjie，PENG Zhangwen，*WU Zhuqing
（Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416000，China）

The effects of ultrasonic-assisted time and temperature，enzyme dosage and ratio of material to liquid on the extraction rate of Eleocharis dulcis polysaccharides are studied with the polysaccharides extracted by the ultrasonic wave-assisted aqueous enzymatic methed.Box-Behnken design with 4 factors and 3 levels test is applied in this experiment，while the optimal process conditions are obtained by regression analysis of response surface methodology.The results show that the optimal extraction conditions are as follows：ultrasonic temperature 56℃，ultrasonic time 47 min，material-water ratio 1∶14，enzyme dosage 4.4×103U.In this optimal process condition，the yield of eleocharis dulcis polysaccharides is 11.95%.

Eleocharis dulcis polysaccharides；ultrasonic assistant；aqueous enzymatic method；technological parameter

TS255.36

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.12.001

1671-9646（2016）12a-0001-05

2016-09-08

吉首大學(xué)2014年大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2014ZXCX09）。

呂雯姣（1994— ），女，在讀本科，研究方向?yàn)橹参镔Y源研究與利用。

*通訊作者：吳竹青（1964— ），女，本科，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹参镔Y源研究與利用。