青貯玉米優(yōu)良乳酸菌的分離與篩選

席琳喬， 吳書奇， 史卉玲， 劉 慧， 馬春暉

(1. 塔里木大學 動物科學學院/兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300； 2.新疆生產(chǎn)建設兵團 第一師十二團畜牧獸醫(yī)工作站， 新疆 阿拉爾 843300； 3.石河子大學 動物科學技術(shù)學院， 新疆 石河子 832000)

青貯玉米優(yōu)良乳酸菌的分離與篩選

席琳喬1， 吳書奇1， 史卉玲2， 劉 慧1， 馬春暉3*

(1. 塔里木大學 動物科學學院/兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300； 2.新疆生產(chǎn)建設兵團 第一師十二團畜牧獸醫(yī)工作站， 新疆 阿拉爾 843300； 3.石河子大學 動物科學技術(shù)學院， 新疆 石河子 832000)

為改善和提高青貯飼料的品質(zhì)提供優(yōu)良菌種，采用MRS平板分離、生理生化分析和16S rDNA鑒定相結(jié)合的方法對新疆阿克蘇地區(qū)青貯玉米(ZeamaysL.)中乳酸菌的種類、形態(tài)學及生理生化特性進行研究。結(jié)果表明：從青貯玉米分離到10個菌株，其中，2株為地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenniformis)，2株為面包乳桿菌(Lactobacilluscrustorum)，4株為鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)，2株為干酪乳桿菌(L.casei)，均為異型乳酸菌。地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)在pH 3.0～3.5能生長，其他菌不生長或者生長較弱，但在pH 4.0～8.0均能生長；10個菌株均可在6.5%和8.0% NaCl條件下生長；地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)的生長速度快、產(chǎn)酸性能好，可作為制作青貯飼料的優(yōu)良菌株。

青貯玉米； 乳酸菌； 分離； 鑒定； 新疆

青貯飼料發(fā)酵是一個復雜的過程，為提高青貯穩(wěn)定性，越來越多的添加劑被應用于青貯飼料。目前應用最多的添加劑是乳酸菌[1]，乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的厭氧菌或微需氧菌的總稱，是促使秸稈飼料發(fā)酵的主要有益微生物[2]。在飼料青貯發(fā)酵中起作用的乳酸菌約20多種[3]，可以分成同型乳酸菌和異型乳酸菌。越來越多的研究表明，同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌同時作用，更有利于青貯飼料營養(yǎng)成分的保存和有氧條件下的穩(wěn)定[4-5]。也有很多研究表明，同型發(fā)酵乳酸菌能加速青貯飼料的腐敗變質(zhì)[6-7]。劉晗璐[3]從禾本科牧草篩選的一株蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtti)，同時指出腸球菌屬(Enterococcus)糞腸球菌(E.faecalis)較適合做青貯啟動菌株的菌種。王小芬等[8]率先從苜蓿中篩選出對苜蓿發(fā)酵有顯著促進效果的乳酸菌復合系AL2，并從青貯苜蓿中分離出一株戊糖乳桿菌(L.pentosus)。熱娜·米吉提[9]研究發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌CF10所產(chǎn)類細菌素Lactobacillin FC-10在酸性條件下穩(wěn)定且活性高，對革蘭氏陰性菌、酵母菌和真菌有明顯的抑制作用。葛紅蓮等[10]從乳酸桿菌中分離得1種廣譜的微生物化合物，對G+菌、G-菌以及真菌都有抑菌活性。張滿昌[11]研究了快速氨化、微貯玉米秸稈對綿羊瘤胃發(fā)酵及生長性能的影響。

青貯玉米(ZeamaysL.)產(chǎn)量高、機械化程度高，可長期保存和均衡供應，是解決草食動物規(guī)?；曫B(yǎng)所需粗飼料的有效途徑之一[12]，青貯玉米和玉米秸稈的低水分青貯得到廣泛應用，深受農(nóng)牧民喜歡。由于新疆南疆地區(qū)夏季氣溫高，紫外線強，植物表面附著特殊的乳酸菌，加之青貯飼料的含水量高，青貯品質(zhì)差，二次發(fā)酵現(xiàn)象嚴重，導致嚴重浪費[13-14]。因此，分離篩選優(yōu)質(zhì)的乳酸菌對提高青貯品質(zhì)尤為重要。為此，筆者通過對阿克蘇地區(qū)青貯玉米的乳酸菌進行分離、篩選，以期為改善和提高青貯飼料的質(zhì)量提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青貯飼料為采自新疆阿克蘇地區(qū)第一師五團牛場、十團牛場和十二團牛場的青貯玉米。

10×Buffer(sigma公司)，2.5 mmol/L dNTP Mixture (sigma公司)，X-gal，IPTG，蛋白酶K，過硫酸銨，丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，尿素，去離子甲酰胺(sigma公司)；T4連接盒，5 U/μL Taq酶，細菌提取試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒，大腸桿菌(DH5α)來自新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室。細菌基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Bioteke corporation)；瓊脂糖；氨芐青霉素、溶菌酶、蛋白酶K(Takara 公司)；M1200，DL2000 (西安沃爾森公司)；引物8f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492r：5’-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’(華大基因合成)；TIANamp Bacteria DNA Kit(天根生化科技有限公司)。

1.2 乳酸菌的分離與篩選

1) 分離。稱取10 g青貯飼料樣品放入液體MRS培養(yǎng)基，室溫發(fā)酵24 h，吸取1 mL上清液加入到9 mL無菌水中，漩渦震蕩，以此稀釋成10-3、10-4和10-53個梯度，分別吸取3個梯度的菌液50 μL涂布于固體MRS平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48～72 h，挑取單菌落，分離純化3次后保存[15-16]。

2) 測定生長曲線。將OD值為0.5的乳酸菌菌液以6.0%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。每隔2 h測其OD值，波長600 nm，測定時間為12～24 h[17]。

3) pH測定。將OD值為0.5的乳酸菌菌懸液以10%的接種量接種到pH 6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)時間24 h。

4) 生長條件試驗。將OD值為0.5的菌液分別接種于以下處理的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，測定OD值。溫度為5℃、10℃、40℃和45℃；pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、7.0和8.0(26℃)；鹽濃度為6.5%、8.0%(26℃)。

5) 產(chǎn)酸速率測定。每隔2 h測定發(fā)酵液pH，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時間為12 h。

1.3 乳酸菌的鑒定

1.3.1 生化鑒定 對純化后菌株活化24 h，進行革蘭氏染色，觀察菌落的顏色、形態(tài)及大小等。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》進行乳酸菌生理生化特性鑒定[18]。

1.3.2 分子生物學鑒定 PCR擴增乳酸菌16S rDNA基因序列，擴增引物為27 f和1492 r。PCR、電泳、染色。用PCR儀對各個菌株的DNA進行擴增，所使用擴增反應的體系為20 μL，體系如下：5 μL 10×Buffer，1 μL dNTP Mixture，0.50 μL Taq酶，1 μL DNA模板，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，無菌超純水補足至20 μL后進行PCR擴增反應。反應條件：95℃，3 min；94℃，1 min；53℃，1 min；72℃延伸90 s，30個循環(huán)，72℃延伸8 min，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增的PCR產(chǎn)物進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌篩選

從圖1可見，從青貯玉米中篩選出乳酸菌10株，其在24 h內(nèi)均可將MRS液體培養(yǎng)基pH從6.5降至4.2以下，產(chǎn)酸能力較強。其中，Q1和Q2的產(chǎn)酸能力最強，pH降至3.8；M4和Q4的產(chǎn)酸能力最弱，pH降至4.2。各菌株產(chǎn)酸能力的強弱依次為Q1、Q2、Q7、Q9、Q10、Q11、Q4、M2、L、Q4和M4。

圖1 試驗篩選出的10株乳酸菌株的產(chǎn)酸能力

Fig.1 Acid-producing ability of 10 identified lactic acid bacterium strains

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 乳酸菌菌株的生理生化特性 從圖2可見：1) 產(chǎn)酸速率。菌株Q1、Q2、Q4、Q7、Q9、Q10和Q11的產(chǎn)酸能力強。其中，0～6 h時產(chǎn)酸速率較快，6～12 h時產(chǎn)酸速率變化平緩，在12 h之內(nèi)菌株Q1、Q2、Q4、Q7、Q9、Q10和Q11的pH均降至4.2以下，能快速產(chǎn)生酸，降低pH；在0～12 h時菌株M2、M4和L的產(chǎn)酸速率較慢，Q2在4～6 h時產(chǎn)酸速率最快。2)生長曲線。菌株Q1、Q2、Q4、Q7、Q9、Q10和Q11在0～8 h時生長最快，在8～12 h時生長速度較慢；整體上，菌株M4和M2的生長較慢，M4在4～8 h時生長速度較快，M2在4～10 h時生長速度較快。

圖2 試驗篩選出的10株乳酸菌株的產(chǎn)酸速率和生長曲線

Fig.2 Acid-producing rate and growth curve of 10 identified lactic acid bacterium strains

從表可見，所有乳酸菌菌株均為革蘭氏陽性菌，觸酶均為陰性，且不產(chǎn)硫化氫。菌株在5～45℃、pH 4.0～8.0均能生長；菌株Q1在pH 3.0～3.5能生長，其他菌不生長或者生長較弱。試驗篩選出的10株乳酸菌株均可在6.5%和8.0% NaCl條件下生長。

2.2.2 分子生物學鑒定 提取乳酸菌的基因組DNA后，采用細菌通用引物對其16S rDNA序列擴增，片段大小為1 500 bp左右(圖3)。測序獲得的16S rDNA序列通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，菌株Q7、Q9、Q10和Q11與編號AB288235的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)序列同源性達99%；菌株M2、M4與編號HQ259722的干酪乳桿菌(L.casei)序列同源性達98%，菌株Q4和L與編號AM285451的面包乳桿菌(L.crustorum)序列同源性達99%；菌株Q1和Q2與編號JN366760的地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenniformis)序列同源性達99%。

表 試驗篩選出的10株乳酸菌株的生理生化特性

注：+，表示陽性；-，表示陰性反應。

Note: +,positive;-, negative.

注：M為DL2000; 1～10分別為菌株Q1, Q2, Q4, Q7, Q9, Q10, Q11, M2, M4和L。

Note: M, DL2000; 1～10, Q1, Q2, Q4, Q7, Q9, Q10, Q11, M2, M4 and L strain respectively.

圖3 試驗篩選出的10株乳酸菌株的16S rDNA擴增圖譜

Fig.3 16S rDNA amplification of 10 identified lactic acid bacterium strains

3 結(jié)論與討論

阿克蘇地區(qū)青貯玉米中的優(yōu)良乳酸菌主要為地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)、面包乳桿菌(L.crustorum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)和干酪乳桿菌(L.casei)。其中，地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)生長速度快，pH下降能力強，可以作為制作青貯飼料乳酸菌的優(yōu)良菌株。

有關(guān)研究表明，青貯原料中活性乳酸菌至少為1×105cfu/g·個才能保證制作良好的青貯飼料[19]。該試驗分離到菌株Q1和Q2為地衣芽孢桿菌(B.lichenniformis)，與張慧杰等[20]分離的菌株相同，該菌株可以產(chǎn)生纖維素降解酶，有利于青貯發(fā)酵過程中纖維素的降解；菌株Q4和L為面包乳桿菌(L.crustorum)；菌株Q2、Q7、Q9、Q10和Q11為鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)，而在青貯料中篩選出該菌的報道較少。王佳[21]從益生4乳制品中分離出鼠李糖乳桿菌，該菌產(chǎn)生L-型乳酸在青貯飼料生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用；菌株M2和M4為干酪乳桿菌(L.casei)，與劉飛[1]從青貯料中分離到的菌株相同。后期將對該菌株的發(fā)酵條件進行進一步研究。

[1] 劉 飛.青貯飼料中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其應用[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2005.

[2] 張 剛.乳酸細菌—基礎技術(shù)和應用[M].北京：化學工業(yè)出版社，2007.

[3] 劉晗璐.禾本科牧草乳酸菌發(fā)現(xiàn)及發(fā)酵品質(zhì)檢測與動物生產(chǎn)性能影響研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2008.

[4] Haigh P M,Parker J W G. Effect of silage additives and wilting on silage fermentation, digestibility and intake,and on liveweight change of young cattle[J].Grass and Forage Science,1985,40:429-436.

[5] Ranjit N K,Taylor C C,Kung Jr L.Effect of lactobacillus buchneri 40788 on the fermentation,aerobic stability and nutritive value of maize silage[J].Grass and forage sci.，2002,57:73-81.

[6] Filya I，Sucu E，Karabulut A.The effect of Lactobacillus buchneri on the fermentation，aerobic stability and ruminal degradability of maize silage[J].Journal of Applied Microbiology，2006，101：1216-1223.

[7] Kleinschmit D H,Kung L.The effects of lactobacillus buchneri 40788 and pediococcus pentosaceus R1094 on the fermentation of corn silage[J].J.dairy sci.，2006,89:3999-4004.

[8] 王小芬，高麗娟，楊洪巖，等.苜蓿青貯過程中乳酸菌復合系Al2的接種效果及菌群的追蹤[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2007(1)：217-222.

[9] 熱娜·米吉提.新疆飼料乳酸菌分離鑒定及多樣性分析[D].烏魯木齊：新疆大學，2012.

[10] 葛紅蓮，郭翠紅，張軍令.兩株乳酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸性能的研究[J].周口師范學院學報，2009，26(2):89-90.

[11] 張滿昌.快速氨化、微貯玉米秸稈對綿羊瘤胃發(fā)酵及生長性能的影響[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2005.

[12] 林 紅，何晶麗.玉米在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的有效利用[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2014(7)：77-79.

[13] 韓吉雨.青貯發(fā)酵體系中乳酸菌多樣性的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2009.

[14] 花 梅.不同地區(qū)青貯玉米發(fā)酵特性及微生物多樣性[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2013.

[15] 凌代文，東秀珠.乳酸菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999：82-125.

[16] 魏日華，桂 榮，塔 娜.牧草中異型發(fā)酵乳酸菌的分離與鑒定[J].草業(yè)科學，2010(10)：149-153.

[17] 錢存柔，黃儀秀.微生物學實驗指導[M].北京：北京大學出版社，1999.

[18] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[19] 趙子夫.乳酸菌的分離篩選及其對玉米青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2009.

[20] 張慧杰，玉 柱，王 林，等.青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株的篩選[J].草地學報，2011，19(1)：137-141.

[21] 王 佳.鼠李糖乳桿菌與干酪乳桿菌發(fā)酵大豆乳工藝研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2009.

(責任編輯： 王 海)

Solation and Identification of Good Lactic Acid Bacteria from Silage Maize

XI Linqiao1, WU Shuqi1, SHUI Huiling2, LIU Hui1, MA Chunhui3*

(1.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity/TarimKeyLaboratoryofAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300; 2.StationofAnimalHusbandryandVeterinary, 12thRegiment,theFirstDivision,XinjiangProductionandConstructionCorps,Alar,Xinjiang843300; 3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832000,China)

The lactic acid bacteria strains were isolated from silage maize in Akesu Prefecture, Xinjiang by MRS plate method and the isolated strains were identified by determining the physiological-biochemical indexes and 16S rDNA method to discuss species, morphology and physiological-biochemical property of lactic acid bacteria in silage maize and provide good strains for improvement of silage quality. Results: 10 strains are successfully isolated from silage maize and they all are heteromorphosis lactic acid bacteria including 2Bacilluslichenniformisstrains, 2Lactobacilluscrustorumstrains, 4L.rhamnosusstrains and 2L.caseistrains. 2Bacilluslichenniformisstrains can grow at pH 3.0～3.5 and other strains can not grow or grow weakly at pH 3.0～3.5 but 10 strains all can grow at pH 4.0～8.0. 10 strains all can grow under the conditions of 6.5% NaCl and 8.0% NaCl.B.lichenniformisstrains with fast growth rate and good acid-producing performance can be used as good strains in additive for silage by determining its lactic acid bacteria growth curve and acid-producing velocity.

silage maize; lactic acid bacteria; isolation; identification; Xinjiang

2015-04-22； 2016-02-13修回

農(nóng)業(yè)部國家牧草產(chǎn)業(yè)體系綜合試驗站項目(CARS35-44)；兵團畜牧科技重點實驗室開放課題“暴露時間對袋裝玉米青貯產(chǎn)氣消長機理研究”(HS201404)

席琳喬(1978-)，男，副教授，博士，從事飼料資源開發(fā)與利用。E-mail: gsxlq666@163.com

*通訊作者：馬春暉(1966-)，男，教授，博士，從事飼料資源開發(fā)與利用。E-mail: chunhuima@126.com

1001-3601(2016)03-0123-0102-04

S816.53

A