高壓干燥保存移植心臟機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

張 瑞，黃成鋒，李 瀟，鄭少憶，郭惠明，陳寄梅，莊 建，朱 平

·全科醫(yī)生技能發(fā)展·

高壓干燥保存移植心臟機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

張 瑞，黃成鋒，李 瀟，鄭少憶，郭惠明，陳寄梅，莊 建，朱 平

目的 探索一種全新的器官保存方式——高壓干燥保存，并通過(guò)檢測(cè)炎性因子水平探討該方式優(yōu)于目前常用的浸泡保存方式的可能作用機(jī)制。方法 2014年12月—2015年8月選取SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只，其中4～6周齡供體小鼠36只，6～8周齡受體小鼠24只。供體小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液(HTK液)浸泡保存組、高壓干燥保存組，每組12只。受體小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為HTK液浸泡保存受體組、高壓干燥保存受體組，每組12只。空白對(duì)照組僅取供心，不做移植；HTK液浸泡保存組供心浸泡于HTK液中；高壓干燥保存組供心懸掛并置于高壓氣體罐中(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)。移植后2 h，對(duì)比觀察HTK液浸泡保存受體組、高壓干燥保存受體組供心復(fù)跳率及供心移植物功能評(píng)分。移植后24 h，采用熒光實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)3組供體小鼠心肌細(xì)胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)1β、IL-6、IL-10、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果 高壓干燥保存受體組小鼠供心復(fù)跳率高于HTK液浸泡保存受體組〔83.3%(10/12)與25.0%(3/12)，P=0.012〕。高壓干燥保存受體組小鼠供心移植物功能評(píng)分高于HTK液浸泡保存受體組〔3.5(1.0)分與1.3(0.5)分，Z=-3.447，P<0.01〕。HTK液浸泡保存組和高壓干燥保存組小鼠心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1表達(dá)水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)；HTK液浸泡保存組小鼠心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1表達(dá)水平高于高壓干燥保存組(P<0.05)；高壓干燥保存組小鼠心肌細(xì)胞IL-10表達(dá)水平高于HTK液浸泡保存組(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組、HTK液浸泡保存組、高壓干燥保存組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(1.36±0.30)%、(14.18±4.75)%、(6.61±1.06)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.963，P<0.05)；HTK液浸泡保存組、高壓干燥保存組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)高于空白對(duì)照組(P<0.05)；HTK液浸泡保存組小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)高于高壓干燥保存組(P<0.05)。結(jié)論 氧氣和一氧化碳(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)的高壓干燥環(huán)境通過(guò)抗凋亡和減輕炎性損傷作用，對(duì)供心有保護(hù)作用，促進(jìn)移植后供心功能恢復(fù)，有效延長(zhǎng)供心保存時(shí)間。

器官保存；器官保存液；氧；一氧化碳；心肌再灌注損傷；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素類

張瑞，黃成鋒，李瀟，等.高壓干燥保存移植心臟機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(9)：1107-1112.[www.chinagp.net]

Zhang R,Huang CF,Li X,et al.Experimental research of the mechanism of preservation for cardiac transplantation in dry environment with high air pressure[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1107-1112.

心臟移植是終末期心臟疾病與不可矯治先天性心臟病患者的首選[1-2]，從國(guó)內(nèi)外心臟移植的現(xiàn)狀來(lái)看，供心來(lái)源缺乏制約了心臟移植的進(jìn)展，延長(zhǎng)供心保存時(shí)間有助于解決這一問(wèn)題，但必須是安全有效的供心保存，因?yàn)檫@是心臟移植成功的先決條件[3]。絕大多數(shù)臨床移植中心采用單純低溫浸泡方式保存供心[4]，組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液(histidine-tryptophan-ketoglutarate solution，HTK液)是一種應(yīng)用廣泛的細(xì)胞內(nèi)液型保存液[3，5]，被用于臨床上供心的保存[6]，保存時(shí)間限制在 6 h以內(nèi)[7-8]。Yoshida等[9]日本學(xué)者將大鼠供心保存在高壓干燥環(huán)境中，在保證較高復(fù)跳率的情況下顯著延長(zhǎng)了供心保存時(shí)間。但其研究?jī)H停留在現(xiàn)象觀察階段，未進(jìn)行生物學(xué)方面的檢測(cè)。近年來(lái)對(duì)高壓干燥保存的研究幾近空白。本研究在日本學(xué)者研究[9]的基礎(chǔ)上，比較高壓干燥保存與HTK液浸泡保存16 h移植后供心復(fù)跳率、移植后2 h供心移植物功能評(píng)分、移植后24 h供體小鼠心肌細(xì)胞炎性因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)1β、IL-6、IL-10、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，得出氧氣(O2)和一氧化碳(CO)(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)的高壓干燥混合氣體保存方式在保存16 h時(shí)優(yōu)于HTK液浸泡保存方式，并對(duì)其產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制做一探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 2014年12月—2015年8月選取SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只，雄性。其中供體小鼠36只，體質(zhì)量19～24 g、平均體質(zhì)量(21±2)g，4～6周齡、平均(5.0±0.8)周齡；受體小鼠24只，體質(zhì)量26～33 g、平均體質(zhì)量(29±2)g，6～8周齡、平均(6.9±0.8)周齡。均購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。供體小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，空白對(duì)照組12只，體質(zhì)量19～24 g、平均體質(zhì)量(21±2)g，4～6周齡、平均(4.9±0.8)周齡；HTK液浸泡保存組12只，體質(zhì)量14～24 g、平均體質(zhì)量(21±2)g，4～6周齡、平均(5.0±0.9)周齡；高壓干燥保存組12只，體質(zhì)量19～24 g、平均體質(zhì)量(21±2)g，4～6周齡、平均(5.0±0.9)周齡；3組小鼠體質(zhì)量、周齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.200、0.040，P=0.820、0.961)。受體小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，HTK液浸泡保存受體組12只，體質(zhì)量26～33 g、平均體質(zhì)量(29±2)g，6～8周齡、平均(6.8±0.8)周齡；高壓干燥保存受體組12只，體質(zhì)量26～33 g、平均體質(zhì)量(29±2)g，6～8周齡、平均(6.8±0.9)周齡；兩組小鼠體質(zhì)量、周齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.141、-0.251，P=0.889、0.804)。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

日本學(xué)者首創(chuàng)器官高壓干燥保存方式，本實(shí)驗(yàn)在日本學(xué)者研究的基礎(chǔ)上，以高壓干燥保存方式保存供心，高壓是將供心保存在2 000 hPa(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa)環(huán)境的高壓氣體罐內(nèi)，干燥保存主要是指供心的離水保存，相對(duì)于傳統(tǒng)的器官完全浸入保存液中的保存方法，供心是以非浸泡方式保存的，供心暴露于氣體中，通過(guò)減少水分及氣體環(huán)境抑制來(lái)追求保存效果。目前國(guó)內(nèi)多數(shù)針對(duì)一氧化碳(CO)對(duì)供心保護(hù)作用的研究采用化學(xué)藥物體內(nèi)誘導(dǎo)的方法，常見(jiàn)的是利用二氯甲烷(MC)等誘導(dǎo)劑喂食小鼠，促進(jìn)小鼠體內(nèi)內(nèi)源性CO形成，從而研究CO在心臟移植方面的作用。本研究高壓氣體灌內(nèi)高壓的維持采用的氣體組成選擇的是O2+CO模式，O2和CO維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，CO有抗炎抗細(xì)胞凋亡的作用，外源性CO直接作用于供心，達(dá)到抑制心肌細(xì)胞凋亡和減輕炎性損傷的效果。

1.2 供心切取方式及保存方法 供體小鼠術(shù)前均不禁食、禁水，稱體質(zhì)量后，采用5%水合氯醛(0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉，麻醉成功后將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。手術(shù)區(qū)用1%活力碘消毒備皮。供心切取于16倍雙人雙目手術(shù)顯微鏡下(購(gòu)于蘇州醫(yī)療儀器有限公司)進(jìn)行，供心切取參考文獻(xiàn)[10]?？瞻讓?duì)照組分離后的供心不做處理直接送檢，HTK液浸泡保存組分離后的供心浸泡于15 ml HTK液中，置于4 ℃冰箱保存16 h，高壓干燥保存組分離后的供心置于4 ℃高壓氣體罐內(nèi)(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)保存16 h。高壓氣體罐購(gòu)于日本國(guó)立成育心血管病研究中心，供心的下方放一裝有15 ml純凈水的燒杯，用以維持高壓氣體罐內(nèi)濕度(見(jiàn)圖1)[11]。

注：供心內(nèi)灌滿重碳酸鹽緩沖液(KH液)，懸掛置于高壓氣體罐中，高壓氣體罐中注入高壓氣體(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)，罐內(nèi)放一燒杯使其保持一定濕度，避免過(guò)度干燥導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡

圖1 高壓干燥保存組小鼠供心保存示意圖

Figure 1 Sketch map of mice donor hearts in high pressure dry preservation group

1.3 供心異位移植術(shù) 受體小鼠按上述同樣的方法麻醉并固定備皮消毒，參考文獻(xiàn)[12]行腹部異位心臟移植術(shù)(于16 倍雙人雙目手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行)，將處理后的供心移植于受體小鼠腹部。利用10-0尼龍線分別將供心的升主動(dòng)脈與受體小鼠的腹主動(dòng)脈、供心的肺動(dòng)脈與受體小鼠的下腔靜脈做端側(cè)吻合，吻合期間注意更換供心表面覆蓋的冰紗塊，防止吻合過(guò)程中供心心肌細(xì)胞損傷。吻合完畢后松開(kāi)血管夾恢復(fù)血流，觀察各組供心復(fù)跳率。移植后2 h，記錄各組供心移植物功能評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]：(1)心室收縮強(qiáng)度：無(wú) 0分，弱 1分，強(qiáng) 2分；(2)顏色：暗 0分，偏暗 1分，粉紅 2分；(3)硬度：僵硬 0分，柔軟 1分。各項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加，總分0分提示供心無(wú)功能，5分提示供心功能佳。觀察完畢后縫合皮膚。

1.4 移植術(shù)后處理 術(shù)畢，肌肉注射青霉素50 U/10 g 1次。受體小鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)、保暖。所有受體小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)在SPF級(jí)屏障環(huán)境中，普通顆粒飼料喂養(yǎng)，飼料跟飲水經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒，置于飼養(yǎng)籠籠頂，自由取食，飼養(yǎng)24 h，期間受體小鼠均存活，無(wú)一死亡。24 h后5%水合氯醛(0.1 ml/10 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，1%活力碘消毒頸部，剪開(kāi)受體小鼠頸部切口，完整暴露頸部供心，將供心完整取出。

1.5 檢測(cè)項(xiàng)目

1.5.1 熒光實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和ICAM-1的表達(dá)水平 空白對(duì)照組供心不經(jīng)保存直接送檢，HTK液浸泡保存組和高壓干燥保存組移植術(shù)后24 h，取供心心肌細(xì)胞行RT-PCR。按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取心肌細(xì)胞總RNA，將提取的總RNA用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄步驟嚴(yán)格按TaKaRa PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(D6210A)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系的配制、反應(yīng)參數(shù)等均按TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RT-PCR 的擴(kuò)增曲線和溶解曲線應(yīng)用Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System的操作方法進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件均為：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s的條件下循環(huán)44次；94 ℃保溫1 min后制作熔點(diǎn)曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。RT-PCR法檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1 mRNA和對(duì)應(yīng)β-actin mRNA的Ct值，每個(gè)樣品均做復(fù)孔以減少操作誤差。運(yùn)用Bio-Rad CFX96 Real Time PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software 1.6數(shù)據(jù)分析軟件，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物設(shè)計(jì)

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-1β=白介素1β，IL-6=白介素6，IL-10=白介素10，ICAM-1=細(xì)胞間黏附分子1

1.5.2 心肌組織病理學(xué)檢查 空白對(duì)照組直接取供心心尖部組織10 mm×10 mm×5 mm，HTK液浸泡保存組、高壓干燥保存組于移植后24 h，取供心心尖部組織10 mm×10 mm×5 mm，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，蘇木素-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

1.5.3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè) 取3組供體小鼠的心臟組織(約150 mg)，制作成心肌石蠟切片，TUNEL染色法染色，細(xì)胞核及核膜被染成棕褐色。每組切片放大400倍，隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞核及心肌細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞核/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%)，求平均值。

2 結(jié)果

2.1 供心復(fù)跳率比較HTK液浸泡保存受體組小鼠供心復(fù)跳率為25.0%(3/12),高壓干燥保存受體組小鼠供心復(fù)跳率為83.3%(10/12)。高壓干燥保存受體組小鼠供心復(fù)跳率高于HTK液浸泡保存受體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。

2.2 供心移植物功能評(píng)分比較 移植后2h，HTK液浸泡保存受體組小鼠供心移植物功能評(píng)分為〔1.3(0.5)〕分，高壓干燥保存受體組小鼠供心移植物功能評(píng)分為〔3.5(1.0)〕分。高壓干燥保存受體組小鼠供心移植物功能評(píng)分高于HTK液浸泡保存受體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.447，P<0.01)。

2.3TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1表達(dá)水平比較 3組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中HTK液浸泡保存組和高壓干燥保存組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1表達(dá)水平高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高壓干燥保存組小鼠心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1表達(dá)水平低于HTK液浸泡保存組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高壓干燥保存組心肌細(xì)胞IL-10表達(dá)水平高于HTK液浸泡保存組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

2.4 心肌組織病理學(xué)觀察結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下，空白對(duì)照組心肌細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞核形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，HTK液浸泡保存組和高壓干燥保存組心肌細(xì)胞較空白對(duì)照組有明顯改變，兩組均可見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫變形、排列紊亂以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，與HTK液浸泡保存組相比，高壓干燥保存組病理?yè)p傷較輕(見(jiàn)圖2，本文圖2、3彩圖見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.5 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 光鏡下，空白對(duì)照組心肌細(xì)胞呈均一的淡染，未見(jiàn)異常細(xì)胞核。TUNNEL標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核呈褐色，HTK液浸泡保存組可見(jiàn)大量褐色陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，與高壓干燥保存組相比明顯增加(見(jiàn)圖3)?？瞻讓?duì)照組、HTK液浸泡保存組、高壓干燥保存組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(1.36±0.30)%、(14.18±4.75)%、(6.61±1.06)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.963，P<0.05)；HTK液浸泡保存組、高壓干燥保存組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高壓干燥保存組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)低于HTK液浸泡保存組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：HTK液=組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液

圖2 各組心肌組織病理學(xué)觀察結(jié)果(HE染色)

Figure2Morphologyobservingresultsofcardiacmuscletissueineachgroup

表2 3組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1表達(dá)水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與HTK液浸泡保存組比較，bP<0.05；HTK液=組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液

圖3 各組心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果(TUNNEL染色，×400)

3 討論

目前，臨床上常用單純低溫浸泡保存的方法保存供心[3]，供心的保存時(shí)間一般限制在6 h之內(nèi)[7-8]。自然界中一些生物體通過(guò)減少體內(nèi)水分降低新陳代謝率來(lái)適應(yīng)像干燥或低溫的極端環(huán)境，該現(xiàn)象特征之一是細(xì)胞中部分游離水減少而結(jié)合水保留，從而降低新陳代謝率[9]。日本學(xué)者Yoshida等[9]認(rèn)為，組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)未受損且其內(nèi)結(jié)合水不受影響的情況下，游離水的減少可以降低新陳代謝率從而延長(zhǎng)供心保存時(shí)間，基于此，其進(jìn)行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)將大鼠供心懸掛暴露于高壓(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)環(huán)境中保存24 h，移植后供心復(fù)跳率可達(dá)80%。本研究在日本學(xué)者研究[9]的基礎(chǔ)上，將小鼠供心懸掛于高壓(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)環(huán)境中保存16 h，并與HTK液浸泡保存進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)行生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，得出在保存16 h后，高壓干燥保存組供心復(fù)跳率為83.3%，高于日本學(xué)者[9]的結(jié)果，HTK液浸泡保存組供心復(fù)跳率為25.0%。移植后2 h，高壓干燥保存受體組小鼠供心移植物功能評(píng)分高于HTK液浸泡保存受體組，高壓干燥保存組移植后24 h供心HE染色心肌組織病理改變及TUNNEL染色心肌細(xì)胞凋亡情況均較HTK液浸泡保存組輕，這在一定程度上說(shuō)明，在O2和CO的高壓(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)干燥環(huán)境中保存供心，能夠減少供心在冷缺血過(guò)程中心肌細(xì)胞的壞死，促進(jìn)移植后供心功能的恢復(fù)。心肌缺血再灌注損傷是指心肌血液供應(yīng)阻斷，心肌得到血液再灌注后，心肌細(xì)胞損傷反而加重的現(xiàn)象[13]。心肌缺血再灌注過(guò)程中炎性反應(yīng)是重要的致病機(jī)制之一[14]。炎性因子的釋放和炎性細(xì)胞的聚集是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。TNF-α是創(chuàng)傷后機(jī)體最早產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子之一，對(duì)毛細(xì)血管有直接毒性，可以加重外周白細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌細(xì)胞水腫[15]，TNF-α可激活核因子(NF)-κB，活化的NF-κB反過(guò)來(lái)可進(jìn)一步誘導(dǎo)大量炎性因子的釋放，包括IL-1(IL-1包括IL-1α和IL-1β兩種形式)、IL-6和ICAM-1[14]。IL-1β水平升高可降低心肌收縮力,加重缺血組織炎性反應(yīng)及心肌缺血再灌注損傷。IL-6為白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的重要的炎性遞質(zhì)，是炎性反應(yīng)的樞紐，IL-6的大量產(chǎn)生與心肌損傷程度呈正相關(guān)[16]。ICAM-1通過(guò)CD11/CD18-ICAM-1機(jī)制，使中性粒細(xì)胞滲入缺血區(qū)心肌組織，引發(fā)氧自由基釋放、阻塞微血管和分泌蛋白水解酶擴(kuò)展心肌細(xì)胞損傷[17]。在體內(nèi)同時(shí)存在與促炎反應(yīng)相對(duì)應(yīng)的抗炎反應(yīng)，降低炎性因子水平可減輕心肌缺血再灌注損傷[18]。IL-10主要由Th細(xì)胞產(chǎn)生，為重要內(nèi)源性抗炎因子，具有多功能、多細(xì)胞源性，可抑制TNF-α、IL-1和IL-6的產(chǎn)生[19-20]，從而發(fā)揮抗炎作用,減輕心肌缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)16 h保存的HTK液浸泡保存組和高壓干燥保存組心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、ICAM-1表達(dá)水平均較未經(jīng)保存的空白對(duì)照組明顯升高，高壓干燥保存組TNF-α、IL-1β、IL-6、CAM-1表達(dá)水平較HTK液浸泡保存組降低，IL-10表達(dá)水平較HTK液浸泡保存組升高。有研究指出，細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一[21-22]。Abbate等[23]研究指出，細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)TUNNEL染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組供心未經(jīng)保存不做處理直接送檢，TUNNEL染色未見(jiàn)凋亡細(xì)胞，經(jīng)16 h保存的供心心肌細(xì)胞均可見(jiàn)數(shù)量不等的凋亡細(xì)胞，高壓干燥保存組凋亡細(xì)胞少于HTK液浸泡保存組。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的供心復(fù)跳率結(jié)果和供心移植物功能評(píng)分結(jié)果，高壓干燥保存組供心復(fù)跳率及供心移植物功能評(píng)分均高于HTK液浸泡保存組，炎性指標(biāo)變化情況以及TUNNEL染色檢測(cè)的細(xì)胞凋亡情況與移植后供心功能的恢復(fù)情況一致，這些結(jié)果說(shuō)明，炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，高壓干燥保存可能通過(guò)下調(diào)促炎因子水平、上調(diào)抗炎因子水平，抑制炎性反應(yīng)以及減輕細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，從而減輕供心心肌缺血再灌注損傷。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的高壓干燥保存方式應(yīng)用到CO氣體，近年來(lái)的研究表明，外源性CO存在抗炎、抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡的作用[24]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的炎性因子表達(dá)水平及TUNNEL染色結(jié)果，推測(cè)外源性CO發(fā)揮了重要的細(xì)胞保護(hù)作用。CO可以降低促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平、上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)水平以及抑制中性粒細(xì)胞聚集減輕心肌缺血再灌注損傷[18，25-26]。外源性CO亦可以降低膿毒癥小鼠小腸中ICAM-1的表達(dá)水平[27]。Akamatsu等[28]研究表明，取供心前將供體小鼠放入CO濃度為400 ppm的環(huán)境中，同時(shí)在保存過(guò)程中將供心浸泡在含有1%CO的UW液中，能明顯減少供心的冷缺血再灌注損傷，明顯減少供心心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。目前國(guó)內(nèi)多數(shù)針對(duì)CO對(duì)供心保護(hù)作用的研究采用化學(xué)藥物誘導(dǎo)的方法，常見(jiàn)的有利用二氯甲烷(methylene chloride,MC)等誘導(dǎo)劑喂食小鼠促進(jìn)其體內(nèi)內(nèi)源性CO的生成，從而研究CO在心臟移植方面的作用，與其他研究不同，本實(shí)驗(yàn)將供心直接暴露在富含CO的高壓干燥環(huán)境中，由于離體后的缺血條件，CO直接作用于供心，更有效地發(fā)揮抗炎和抗凋亡的作用。

綜上所述，高壓(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa)干燥保存方式是一種有效的供心保存方法，該方法通過(guò)CO作用于心肌細(xì)胞，發(fā)揮抗炎、抗凋亡的心肌細(xì)胞保護(hù)作用，有效減輕供心心肌缺血再灌注損傷，在保存16 h時(shí)間段，該方式優(yōu)于傳統(tǒng)的HTK液浸泡保存方式，但對(duì)于具體的機(jī)制調(diào)控方面尚不明確，因此擬進(jìn)一步探索CO具體的調(diào)控通道，并嘗試通過(guò)不同的模型對(duì)高壓干燥保存組供心移植后心功能、供心能量代謝以及氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，更全面地反映高壓干燥保存方式的作用及機(jī)制，并逐步擴(kuò)展到大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床研究。

作者貢獻(xiàn)：張瑞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；黃成鋒、李瀟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；鄭少憶、郭惠明、陳寄梅、莊建、朱平進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

[1]Saidi RF，Hejazii Kenari SK.Challenges of organ shortage for transplantation:solutions and opportunities[J].Int J Organ Transplant Med,2014,5(3):87-96.

[2]Thrush PT,Hoffman TM.Pediatric heart transplantation-indications and outcomes in the current era[J].J Thorac Dis,2014,6(8):1080-1096.

[3]Latchana N,Peck JR,Whitson B,et al.Preservation solutions for cardiac and pulmonary donor grafts:a review of the current literature[J].J Thorac Dis,2014,6(8):1143-1149.

[4]莫安勝,林輝.心臟移植供心保存的研究進(jìn)展[J].微創(chuàng)醫(yī)學(xué),2010,5(5):489-492.

[5]Pokorny H,Rasoul-Rockenschaub S,Langer F,et al.Histidine-tryptophan-ketoglutarate solution for organ preservation in human liver transplantation-a prospective multi-centre observation study[J].Transpl Int,2004,17(5):256-260.

[6]Mühlbacher F,Langer F,Mittermayer C.Preservation solutions for transplantation[J].Transplant Proc,1999,31(5):2069-2070.

[7]Jahania MS,Sanchez JA,Narayan P,et al.Heart preservation for transplantation:principles and strategies[J].Ann Thorac Surg,1999,68(5):1983-1987.

[8]Wei J,Chang CY,Chuang YC,et al.Successful heart transplantation after 13 hours of donor heart ischemia with the use of HTK solution:a case report[J].Transplant Proc,2005,37(5):2253-2254.

[9]Yoshida Y,Hatayama N,Seki K.Study on the preservation with CO(PCO=200-2,000 hPa),resuscitation,and heterotopic transplantation of an isolated rat heart[J].Cell Transplant,2009,18(5):535-540.

[10]Cheng F,Gu XD,Xiang JB,et al.A model of cervical heterotopic heart transplantation in mice by modified Cuff technique[J].Journal of Fudan University(Medical Sciences),2008,35(6):919-921.(in Chinese) 程峰,顧曉冬，項(xiàng)建斌，等.改良Cuff技術(shù)建立小鼠頸部異位心臟移植模型[J].復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008,35(6):919-921.

[11]Huang S,Zhao MY,Fu Q,et al.Efficacy of high-pressure mixed gas preservation of mouse hearts for transplantation subjected to cold ischemia and reperfusion injury[J].South China Journal of Cardiovascular Diseases,2015,21(4):549-555.(in Chinese) 黃帥,趙明一，富旗，等.高壓干燥保存對(duì)小鼠供心冷缺血再灌注損傷的影響[J].嶺南心血管病雜志,2015,21(4):549-555.

[12]Huang JJ,Zhao MY,Zheng SY,et al.Effect of carbon monoxide preservation solution on heterotopic transplantation of isolated heart in mice[J].South China Journal of Cardiovascular Diseases,2014,20(3):372-376,382.(in Chinese) 黃晶晶,趙明一，鄭少憶,等.一氧化碳?xì)怏w干燥保存法對(duì)小鼠心臟保存效果的實(shí)驗(yàn)研究[J].嶺南心血管病雜志,2014,20(3):372-376,382.

[13]Zhou T,Chuang CC,Zuo L.Molecular characterization of reactive oxygen species in myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Biomed Res Int,2015,2015:864946.

[14]Steffens S,Montecucco F,Mach F.The inflammatory response as a target to reduce myocardial ischaemia and reperfusion injury[J].Thromb Haemost,2009,102(2):240-247.

[15]Wu LE,Chen J.Tumor necrosis factor-α and cerebral ischemia-reperfusion injury [J].International Journal of Cerebrovascular Diseases,2009,17(1):60-62.(in Chinese) 吳麗娥,陳金.腫瘤壞死因子-α與腦缺血再灌注損傷[J].國(guó)際腦血管病雜志,2009,17(1):60-62.

[16]Moore CM,Desborough JP,Powell H,et al.Effects of extradural anaesthesia on interleukin-6 and acute phase response to surgery[J].Br J Anaesth,1994,72(3):272-279.

[17]Sun B,Fan H,Honda T,et al.Activation of NF kappa B and expression of ICAM-1 in ischemic-reperfused canine myocardium[J].J Mol Cell Cardiol,2001,33(1):109-119.

[18] Ozaki KS,Kimura S,Murase N.Use of carbon monoxide in minimizing ischemia/reperfusion injury in transplantation[J].Transplant Rev(Orlando),2012,26(2):125-139.

[19]Sheeran P,Hall GM.Cytokines in anaesthesia[J].Br J Anaesth,1997,78(2):201-219.

[20]Blackwell TS,Christman JW.Sepsis and cytokines:current status[J].Br J Anaesth,1996,77(1):110-117.

[21] Wang Y,Zhang H,Chai F,et al.The effects of escitalopram on myocardial apoptosis and the expression of Bax and Bcl-2 during myocardial ischemia/reperfusion in a model of rats with depression[J].BMC Psychiatry,2014,14:349.

[22]李春海，桑翠玲，宋樹(shù)英，等.聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀高聚物納米載體介導(dǎo)的組織因子反義寡脫氧核苷酸防治心肌缺血再灌注損傷機(jī)制的初步研究[J].疑難病雜志，2011，10(7)：517.

[23]Abbate A,Bussani R,Biondi-Zoccai GG,et al.Persistent infarct-related artery occlusion is associated with an increased myocardial apoptosis at postmortem examination in humans late after an acute myocardial infarction[J].Circulation,2002,106(9):1051-1054.

[24] Nakao A,Choi AM,Murase N.Protective effect of carbon monoxide in transplantation[J].J Cell Mol Med,2006,10(3):650-671.

[25]Kaizu T,Nakao A,Tsung A,et al.Carbon monoxide inhalation ameliorates cold ischemia/reperfusion injury after rat liver transplantation[J].Surgery,2005,138(2)：229-235.

[26]Otterbein LE,Bach FH,Alam J,et al.Carbon monoxide has anti-inflammatory effects involving the mitogen-activated protein kinase pathway[J].Nat Med,2000,6(4)：422-428.

[27] Wang X,Cao J,Sun BW,et al.Exogenous carbon monoxide attenuates inflammatory responses in the small intestine of septic mice[J].World J Gastroenterol,2012,18(40)：5719-5728.

[28] Akamatsu Y,Haga M,Tyagi S,et al.Heme oxygenase-1-derived carbon monoxide protects hearts from transplant associated ischemia reperfusion injury[J].FASEB J,2004,18(6)：771-772.

(本文編輯：陳素芳)

Experimental Research of the Mechanism of Preservation for Cardiac Transplantation in Dry Environment With High Air Pressure

ZHANGRui，HUANGCheng-feng，LIXiao，etal.SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Objective To investigate a brand new method for organ preservation in dry environment with high air pressure and to explore the possible mechanism of the method being superior to the commonly used method of soaking preservation by the detection of inflammatory factor.Methods From December 2014 to August 2015 a total of 60 SPF C57BL/6 mice were enrolled including 36 donor mice of 4-6 weeks and 24 recipient mice of 6-8 weeks.The donor mice were divided into blank control group,histidine-tryptophan-ketoglutarate salt solution(HTK) soaking preservation group and high pressure dry preservation group with 12 mice each group by random number table method.Recipient mice were divided into HTK solution preservation recipient group and high pressure dry preservation recipient group with 12 mice each group by random number table method.For blank control group,donor heart was taken away but not to be transplantated;the donor hearts of HTK soaking preservation group were soaked in HTK solution;the donor hearts of high pressure dry preservation group were hung in high pressure gas tank(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa).Two hours after transplantation,the donor heart re-beat rate and graft function score of HTK soaking preservation recipient group and high pressure dry preservation recipient group were compared and observed.Twenty-four hours after transplantation,RT-PCR method was used to detect the levels of TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10,ICAM-1 and myocardium cell apoptosis index.Results The donor heart rebeat rate of high pressure dry preservation recipient group was higher than that of HTK soaking preservation recipient group〔83.3%(10/12) vs.25.0%(3/12)，P=0.012〕.The donor heart graft function scores of high pressure dry preservation recepient group was higher than that of HTK soaking preservation recipient group 〔3.5(1.0) vs.1.3(0.5)，Z=-3.447，P<0.01〕.HTK soaking preservation group and high pressure dry preservation group were higher than blank control group in the levels of TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10 and ICAM-1(P<0.05);HTK soaking preservation group was higher than high pressure dry preservation group in the levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and ICAM-1(P<0.05);high pressure dry preservation group was higher than HTK soaking preservation group in the level of IL-10(P<0.05).Myocardium cell apoptosis indexes of blank control group,HTK soaking preservation group and high pressure dry preservation group were(1.36±0.30)%,(14.18±4.75)% and(6.61±1.06)%,with significant differences among them(F=62.963，P<0.05);HTK soaking preservation group and high pressure dry preservation group were higher than blank control group in myocardium cell apoptosis index(P<0.05);HTK soaking preservation group and high pressure dry preservation group were higher than blank control group in myocardium cell apoptosis index(P<0.05);HTK soaking preservation group was higher than high pressure dry preservation group in myocardium cell apoptosis index(P<0.05).Conclusion The high pressure dry environment of oxygen and carbonic oxide(PO2：1 600 hPa+PCO：400 hPa=2 000 hPa) may protect isolated hearts,promote donor heart function recovery after transplantation and prolong preservation time of donor hearts by anti-apoptosis and reducing inflammation injury.

Organ preservation；Organ preservation solutions；Oxygen;Carbon monoxide；Myocardial reperfusion injury；Tumor necrosis factor-alpha；Interleukins

國(guó)家科技部國(guó)際合作項(xiàng)目(2010DFA32660)——一種全新的器官保存方法(心臟干燥保存)的實(shí)驗(yàn)研究；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370230)——PGC-1α與SDF-1/CXCR4軸調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促心肌梗死中血管新生的機(jī)制研究

510515廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學(xué)(張瑞，朱平)；廣東省人民醫(yī)院 廣東省心血管研究所 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院心外科(張瑞，黃成鋒，李瀟，鄭少憶，郭惠明，陳寄梅，莊建，朱平)

朱平，510515廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學(xué)，廣東省人民醫(yī)院 廣東省心血管研究所 廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院心外科；

E-mail:13928819989@163.com

R 617

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.026

2015-10-16；

2015-12-26)