Apelin對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠腎臟纖維化的影響研究

王麗妍，刁宗禮，張啟東，張 育，劉文虎

·論著·

Apelin對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠腎臟纖維化的影響研究

王麗妍，刁宗禮，張啟東，張 育，劉文虎

目的 探討生物活性肽Apelin對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)小鼠腎臟纖維化的影響及相關(guān)機(jī)制，分析在腎臟纖維化時(shí)血清和腎臟局部Apelin/APJ系統(tǒng)的代償性變化。方法 2014年1月選取7周齡雄性C57Bl/6j小鼠共60只,構(gòu)建UUO的小鼠模型，并設(shè)立假手術(shù)組(Sham)作為對(duì)照。術(shù)后每天給小鼠腹腔注射Apelin-13(0.1 μmol/kg)或等量0.9%氯化鈉溶液(vehicle)。根據(jù)小鼠手術(shù)方式和術(shù)后用藥情況分為4組(15只/組)：Sham+vehicle組、Sham+Apelin組、UUO+vehicle組、UUO+Apelin組。術(shù)后2周將小鼠處死，取手術(shù)側(cè)腎臟進(jìn)行檢測(cè)。采用Masson染色觀察腎臟纖維化程度；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)腎臟細(xì)胞外基質(zhì)膠原〔纖維連接蛋白(Fibronectin)、Ⅰ型膠原(Collagen I)、Ⅲ型膠原(Collagen Ⅲ)〕表達(dá)水平以及腎臟Apelin、APJ表達(dá)水平；采用Western blotting法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)水平以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/Smads信號(hào)通路的主要信號(hào)分子(TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2)表達(dá)水平；采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清Apelin表達(dá)水平。結(jié)果 4組小鼠腎臟纖維化程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟纖維化程度均高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟纖維化程度低于UUO+vehicle組(P<0.05)。4組小鼠腎臟Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平低于UUO+vehicle組(P<0.05)。4組小鼠腎臟E-cadherin、α-SMA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟E-cadherin表達(dá)水平低于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，α-SMA表達(dá)水平高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟E-cadherin表達(dá)水平高于UUO+vehicle組，α-SMA表達(dá)水平低于UUO+vehicle組(P<0.05)。4組小鼠腎臟TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟TGF-β1 、TGF-βR1、p-Smad2表達(dá)水平均高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟TGF-β1 、TGF-βR1、p-Smad2表達(dá)水平均低于UUO+vehicle組(P<0.05)。4組小鼠腎臟Apelin表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4組小鼠腎臟APJ、血清Apelin表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟APJ表達(dá)水平高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，血清Apelin表達(dá)水平低于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟APJ表達(dá)水平低于UUO+vehicle組，血清Apelin表達(dá)水平高于UUO+vehicle組(P<0.05)。結(jié)論 Apelin通過(guò)干擾經(jīng)典的TGF-β/Smads信號(hào)通路抑制UUO小鼠腎臟的腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而減輕腎臟纖維化。在腎臟纖維化時(shí)，小鼠血清Apelin表達(dá)水平降低，腎臟APJ表達(dá)水平升高，可能對(duì)慢性腎臟病的進(jìn)展起到一定的代償作用。

纖維化；腎疾病；腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化；小鼠；Apelin

王麗妍，刁宗禮，張啟東，等.Apelin對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠腎臟纖維化的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(9)：1042-1048.[www.chinagp.net]

Wang LY，Diao ZL，Zhang QD，et al.Effects of Apelin on renal fibrosis in unilateral ureteral obstruction mice[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1042-1048.

腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)是腎臟纖維化和慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展的重要機(jī)制，也是各國(guó)學(xué)者研究的焦點(diǎn)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)被認(rèn)為是觸發(fā)EMT的主要細(xì)胞因子，其能活化Smads、RhoA/ROCK、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/蛋白激酶B (PKB)、β-catnnin等多條信號(hào)通路，其中與腎臟纖維化關(guān)系最為密切的是Smads信號(hào)通路[1]。

Apelin是一種新發(fā)現(xiàn)的生物活性肽，其受體APJ屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族。Apelin/APJ系統(tǒng)在腎臟的各個(gè)部位均有分布，參與調(diào)節(jié)腎臟的正常生理功能[2]。在腎病綜合征、糖尿病腎病、高血壓腎損害等疾病狀態(tài)下，其相關(guān)分子表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變，但變化趨勢(shì)不盡相同，可能在一定程度上參與疾病的進(jìn)展[3]。目前，已有研究證實(shí)Apelin和多種器官纖維化之間存在密切聯(lián)系[4]，但其在腎臟纖維化中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)致腎臟纖維化的小鼠模型，探討外源性給予Apelin能否抑制經(jīng)典的TGF-β/Smads信號(hào)通路，從而抑制EMT和腎臟纖維化，并明確在腎臟纖維化時(shí)，自身Apelin/APJ系統(tǒng)的代償性變化，為Apelin/APJ系統(tǒng)成為CKD治療的新靶點(diǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 2014年1月選取7周齡雄性c57Bl/6j小鼠60只，體質(zhì)量為(20±2)g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±1)℃,相對(duì)濕度(55±5)%的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食水。

1.2 分組及處理方法 小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。UUO組于左側(cè)腎臟近腎門處結(jié)扎輸尿管，再于輸尿管遠(yuǎn)離腎門處做二次結(jié)扎。假手術(shù)(Sham)組小鼠行左側(cè)輸尿管分離術(shù)而不結(jié)扎，然后關(guān)閉腹腔。術(shù)后每天給小鼠腹腔注射Apelin-13(0.1 μmol/kg)或等量0.9%氯化鈉溶液(vehicle)。最終根據(jù)小鼠手術(shù)方式和術(shù)后用藥情況分為4組，15只/組。Sham+vehicle組：小鼠行左側(cè)輸尿管分離術(shù)，術(shù)后每天給予vehicle腹腔注射；Sham+Apelin組：小鼠行左側(cè)輸尿管分離術(shù)，術(shù)后每天給予Apelin-13(0.1 μmol/kg)腹腔注射；UUO+vehicle組：小鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，術(shù)后每天給予vehicle腹腔注射；UUO+Apelin組：小鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，術(shù)后每天給予Apelin-13(0.1 μmol/kg)腹腔注射。術(shù)后2周將小鼠處死，取手術(shù)側(cè)腎臟，將其橫切成3 mm厚的組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于制作石蠟切片；其余腎臟一半裝入凍存管保存于液氮中，用于提取總RNA；另一半裝入另一凍存管中保存于-80 ℃冰箱，用于提取組織蛋白。

1.3 Masson染色觀察腎臟纖維化程度 腎臟組織經(jīng)固定、常規(guī)脫水、包埋后，切成3 μm厚的切片。將切片脫蠟至水，用5%硫代硫酸鈉作用5 min，再用Weiger氏鐵蘇木素染色5～10 min，然后用1%鹽酸乙醇溶液分化，麗春紅酸性品紅液染色5～10 min。隨后用1%磷鉬酸水溶液處理約5 min，用苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，再用1%冰醋酸溶液處理1 min，95%乙醇溶液脫水多次。最后用無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，于光鏡下觀察，并用圖像分析軟件對(duì)腎臟纖維化程度進(jìn)行半定量檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)腎臟基質(zhì)膠原和Apelin/APJ系統(tǒng)相關(guān)分子表達(dá)情況 將腎臟在液氮內(nèi)研磨，采用Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))提取總RNA，按說(shuō)明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司，加拿大)，按說(shuō)明書進(jìn)行。小鼠目的mRNA序列由GenBank獲得，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(見表1)。RT-PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μl，前引物、后引物各1 μl (10 pmol/μl)，Power SYBR green PCR Master Mix反應(yīng)液(Roche公司，瑞士)10 μl，加入去離子水至反應(yīng)總體積為20 μl。在ABI Prism 7300 RT-PCR儀(Applied Biosystems公司，美國(guó))上設(shè)置程序，反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，以GAPDH作為對(duì)照，觀察溶解曲線。計(jì)算出目的基因的2-ΔΔCt值，最終以各實(shí)驗(yàn)組占Sham+vehicle組的百分比表示腎臟基質(zhì)膠原〔纖維連接蛋白(Fibronectin)、Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)和Ⅲ型膠原(Collagen Ⅲ)〕表達(dá)水平和Apelin、APJ表達(dá)水平。

表1 RT-PCR引物序列

注：Fibronectin=纖維連接蛋白，Collagen Ⅰ=Ⅰ型膠原，Collagen Ⅲ=Ⅲ型膠原

1.5 Western blotting法檢測(cè)腎臟EMT標(biāo)志物及TGF-β/Smads信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)情況 將腎臟置于冰上研磨，加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的組織細(xì)胞裂解液搖勻，冰浴30 min；在4 ℃ 12 000 r/min下離心30 min(離心半徑為10 cm)，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白表達(dá)水平；加上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min使蛋白變性，取100 μg蛋白行12%聚丙烯酰胺凝膠電脈(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，美國(guó))上，用5%胎牛血清清蛋白(BSA)-PBST封閉1 h。分別用兔抗小鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗小鼠上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶500)、兔抗小鼠TGF-βRI多克隆抗體(1∶500)(Abcam公司，英國(guó))，兔抗小鼠p-Smad2多克隆抗體(1∶250)、兔抗小鼠Smad2多克隆抗體(1∶500)(Cell Signaling公司，美國(guó))，羊抗小鼠β-actin單克隆抗體(1∶2 000)(Santa Cruz公司，美國(guó))，于4 ℃孵育過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000)(Santa Cruz公司，美國(guó))于室溫下孵育1 h。洗膜后，用ECL法顯色并曝光成像。以β-actin作為內(nèi)參，以各實(shí)驗(yàn)組占Sham+vehicle組的百分比表示目的蛋白(腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA，TGF-β/Smads信號(hào)通路相關(guān)分子TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2)的表達(dá)水平。

1.6 ELISA法檢測(cè)小鼠血清Apelin表達(dá)水平 采用摘眼球取血法，將血液置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管內(nèi)，加入0.6 U/ml的抑肽酶，于1 500 r/min下離心10 min(離心半徑為13.5 cm)，收集上清液。用Apelin ELISA試劑盒(Phoenix公司，德國(guó))檢測(cè)小鼠血清Apelin表達(dá)水平，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以ng/ml表示小鼠血清Apelin表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Apelin對(duì)小鼠腎臟纖維化的影響 Masson染色顯示，Sham+vehicle組和Sham+Apelin組腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常；UUO+vehicle組結(jié)扎側(cè)腎臟的腎小管萎縮，腎間質(zhì)纖維化程度明顯；UUO+Apelin組腎臟纖維化程度有所減輕(見圖1)。4組小鼠腎臟纖維化程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟纖維化程度均高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟纖維化程度低于UUO+vehicle組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sham+vehicle組和Sham+Apelin組小鼠腎臟纖維化程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.2 Apelin對(duì)小鼠腎臟基質(zhì)膠原表達(dá)的影響 4組小鼠腎臟Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平低于UUO+vehicle組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sham+vehicle組和Sham+Apelin組小鼠腎臟Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

2.3 Apelin對(duì)小鼠EMT的影響 4組小鼠腎臟E-cadherin、α-SMA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟E-cadherin表達(dá)水平低于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，α-SMA表達(dá)水平高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟E-cadherin表達(dá)水平高于UUO+vehicle，α-SMA表達(dá)水平低于UUO+vehicle組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sham+vehicle組和Sham+Apelin組小鼠腎臟E-cadherin、α-SMA表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖2、表4)。

表2 4組小鼠腎臟纖維化程度比較±s，%)

注：Sham=假手術(shù)，vehicle=0.9%氯化鈉溶液，UUO=單側(cè)輸尿管結(jié)扎；與Sham+vehicle組比較，aP<0.05；與Sham+Apelin組比較，bP<0.05；與UUO+vehicle組比較，cP<0.05

Table 3 Comparison of renal matrix collagen expression of mice among the four groups

組別只數(shù)FibronectinCollagenⅠCollagenⅢSham+vehicle組15100010001000Sham+Apelin組151096±1821174±2791059±145UUO+vehicle組153074±175ab8111±410ab6090±317abUUO+Apelin組152061±224abc4887±348abc3252±268abcF值99360376060358200P值<0001<0001<0001

注：與Sham+vehicle組比較，bP<0.05；與Sham+Apelin組比較，bP<0.05；與UUO+vehicle組比較，cP<0.05

注：Sham=假手術(shù)，vehicle=0.9%氯化鈉溶液，UUO=單側(cè)輸尿管結(jié)扎

圖1 光鏡下各組小鼠腎臟纖維化程度(Masson染色，×40)

Figure 1 Degree of renal fibrosis of mice in each group observed by light microscope

注：E-cadherin=上皮細(xì)胞鈣黏蛋白，α-SMA=α平滑肌肌動(dòng)蛋白

圖2 Western blotting法檢測(cè)腎臟EMT標(biāo)志物表達(dá)水平電泳圖

Figure 2 Electrophoretogram of the expression of renal EMT markers detected by Western blotting method

Table 4 Comparison of the expression of renal EMT markers of mice among the four groups

組別只數(shù)E-cadherinα-SMASham+vehicle組1510001000Sham+Apelin組151088±871164±179UUO+vehicle組15623±84ab3657±214abUUO+Apelin組15825±40abc1877±207abcF值30980146900P值<0001<0001

注：與Sham+vehicle組比較，aP<0.05；與Sham+Apelin組比較，bP<0.05；與UUO+vehicle組比較，cP<0.05；E-cadherin=上皮細(xì)胞鈣黏蛋白，α-SMA=α平滑肌肌動(dòng)蛋白

2.4 Apelin對(duì)小鼠腎臟TGF-β/Smads信號(hào)通路的影響 4組小鼠腎臟TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表達(dá)水平均高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表達(dá)水平均低于UUO+vehicle組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Sham+vehicle組和Sham+Apelin組小鼠腎臟TGF-β1、TGF-βR1、p-Smad2表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3、表5)。

2.5 Apelin對(duì)小鼠腎臟Apelin/APJ系統(tǒng)及血清Apelin表達(dá)水平的影響 4組小鼠腎臟Apelin表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4組小鼠腎臟APJ、血清Apelin表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UUO+vehicle組和UUO+Apelin組小鼠腎臟APJ表達(dá)水平高于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，血清Apelin表達(dá)水平低于Sham+vehicle組和Sham+Apelin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；UUO+Apelin組小鼠腎臟APJ表達(dá)水平低于UUO+vehicle組，血清Apelin表達(dá)水平高于UUO+vehicle，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表6)。

注：TGF-β=轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

圖3 Western blotting法檢測(cè)腎臟TGF-β/Smads信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)水平電泳圖

Figure 3 Electrophoretogram of TGF-β/Smads signal path molecules expression detected by Western blotting method

Table 5 Comparison of renal TGF-β/Smads signaling pathway molecules expression of mice among the four groups

組別只數(shù)TGF?β1TGF?βR1p-Smad2Sham+vehicle組15100010001000Sham+Apelin組151144±75986±871062±132UUO+vehicle組153918±224ab4690±161ab2430±243abUUO+Apelin組152104±140abc2597±292abc1487±176abcF值28789033275048790P值<0001<0001<0001

注：TGF-β=轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；與Sham+vehicle組比較，aP<0.05；與Sham+Apelin組比較，bP<0.05；與UUO+vehicle組比較，cP<0.05

Table 6 Comparison of the expression of renal Apelin/APJ system related molecules and serum Apelin of mice among the four groups

組別只數(shù)腎臟Apelin(%)腎臟APJ(%)血清Apelin(ng/ml)Sham+vehicle組1510001000069±013Sham+Apelin組15950±2471769±1318071±011UUO+vehicle組15715±18319580±3387ab028±010abUUO+Apelin組15828±16010727±3137abc049±007abcF值16403975011540P值0260<0001<0001

注：與Sham+vehicle組比較，aP<0.05；與Sham+Apelin組比較，bP<0.05；與UUO+vehicle組比較，cP<0.05

3 討論

作為一種新近發(fā)現(xiàn)的多肽，Apelin及其受體APJ具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與調(diào)節(jié)多種器官的生理功能，同時(shí)也和疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。目前，大量研究表明Apelin能促進(jìn)肝臟纖維化的發(fā)生[4]。有學(xué)者在膽管閉鎖致肝臟纖維化患者的肝臟局部觀察到了Apelin/APJ系統(tǒng)的異?；罨褹pelin的表達(dá)水平與肝臟纖維化的程度呈正相關(guān)[3]。體外實(shí)驗(yàn)表明，Apelin能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，并能激活炎性反應(yīng)，促進(jìn)血管的形成[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)肝臟纖維化的大鼠注射APJ受體拮抗劑，可以減輕肝臟纖維化程度[5]。然而與上述效應(yīng)相反，在心血管系統(tǒng)中Apelin被視為是抗纖維化的細(xì)胞因子，如有研究顯示，對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠注射Pyr-Apelin13可以減少促纖維化細(xì)胞因子〔內(nèi)皮素1(ET-1)、血管緊張緊Ⅱ(Ang Ⅱ)〕的分泌，改善右心功能[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Apelin可以在一定程度上抑制AngⅡ誘導(dǎo)的纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)的表達(dá)，從而改善心肌纖維化[7]。也有研究顯示，Apelin能抑制TGF-β介導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程[8]。因此，Apelin對(duì)器官纖維化具有雙向調(diào)節(jié)作用，在不同組織器官中其作用機(jī)制也不相同。然而關(guān)于Apelin和腎臟纖維化之間的關(guān)系目前尚無(wú)明確報(bào)道。

在本研究中，筆者建立了UUO致腎臟纖維化的小鼠模型，該模型是研究非免疫性腎間質(zhì)損傷的成熟動(dòng)物模型。建模2周后觀察到UUO小鼠結(jié)扎側(cè)腎臟出現(xiàn)明顯的腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化和基質(zhì)膠原的沉積，而每日腹腔注射Apelin能顯著減輕上述表現(xiàn)，提示Apelin在整體水平具有一定的抗腎臟纖維化作用。通過(guò)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，UUO小鼠的腎臟有明顯的EMT改變，而腹腔注射Apelin能顯著減輕這一過(guò)程。隨后，又對(duì)引起EMT的經(jīng)典信號(hào)通路(TGF-β/Smads信號(hào)通路)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示UUO小鼠結(jié)扎側(cè)腎臟的TGF-β1和TGF-βR1以及活化型Smad即p-Smad2的表達(dá)水平均高于Sham組，提示TGF-β/Smads信號(hào)通路被激活，這與以往的研究結(jié)果一致[9]。而外源性給予Apelin可以顯著下調(diào)上述相關(guān)分子的表達(dá)水平。該結(jié)果從整體水平證實(shí)了Apelin對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路的抑制作用。但對(duì)于Apelin/APJ系統(tǒng)活化后如何與TGF-β/Smads信號(hào)通路發(fā)生關(guān)聯(lián)本研究并未涉及，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以明確。

通過(guò)對(duì)小鼠血清和腎臟局部Apelin/APJ系統(tǒng)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，UUO小鼠血清Apelin表達(dá)水平低于Sham組，而腎臟APJ的表達(dá)水平卻顯著升高。推測(cè)腎臟APJ表達(dá)水平的上調(diào)可能是對(duì)血清Apelin表達(dá)水平降低的一種代償性反應(yīng)。對(duì)維持性血液透析患者的研究提示，尿毒癥毒素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致Apelin合成減少，可能是引起透析患者血清Apelin表達(dá)水平低于正常人的原因[10]。這也可以部分解釋UUO小鼠血清Apelin表達(dá)水平降低的原因。既往已有關(guān)于腎臟疾病時(shí)Apelin/APJ系統(tǒng)相關(guān)分子表達(dá)水平變化的報(bào)道[11-12]。在腎病綜合征大鼠體內(nèi)，檢測(cè)到腎臟和血漿Apelin表達(dá)水平升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其尿蛋白水平與腎臟Apelin表達(dá)水平呈正相關(guān)[11]。對(duì)于腎性高血壓大鼠，觀察到其血漿Apelin表達(dá)水平是降低的，且腎臟APJ的表達(dá)水平有所減少[12]。針對(duì)1型糖尿病小鼠的研究顯示，其腎臟APJ的表達(dá)水平降低，外源性給予Apelin可以使腎臟 APJ的表達(dá)水平有所恢復(fù)[13]。盡管上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果并不完全一致，但仍提示Apelin/APJ系統(tǒng)參與腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展。在心血管領(lǐng)域也有關(guān)于Apelin/APJ系統(tǒng)代償性變化的報(bào)道。對(duì)心力衰竭患者及相關(guān)動(dòng)物模型的研究顯示，在心力衰竭早期血清Apelin表達(dá)水平代償性升高，這是由于Apelin具有較強(qiáng)的正性肌力作用，可以暫時(shí)緩解心功能降低所引起的臨床癥狀，但到了心力衰竭晚期血清Apelin表達(dá)水平則低于正常[6]。由此推測(cè)，在腎臟纖維化的早期Apelin/APJ系統(tǒng)可能也起到一定的代償作用，但該作用是有限的，隨著疾病的進(jìn)展，Apelin和APJ的表達(dá)水平受到多種因素的影響，其變化趨勢(shì)也不盡相同。由于人體是十分復(fù)雜的有機(jī)體，特別是在CKD狀態(tài)下，影響Apelin/APJ系統(tǒng)相關(guān)因子表達(dá)水平和其功能的因素眾多，因此僅憑單一的動(dòng)物模型無(wú)法完全了解其與疾病發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系，尚需大樣本量的臨床研究來(lái)進(jìn)一步觀察。

綜上所述，本研究證實(shí)了Apelin可以通過(guò)直接抑制經(jīng)典的TGF-β/Smads信號(hào)通路而抑制EMT，進(jìn)而起到減輕腎臟纖維化的作用。在腎臟纖維化時(shí)，血清Apelin表達(dá)水平降低，腎臟APJ表達(dá)水平升高，可能對(duì)CKD的進(jìn)展起到一定的代償作用。

作者貢獻(xiàn)：王麗妍負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文；刁宗禮、張啟東、張育進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；劉文虎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并對(duì)文章負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：李婷婷)

Effects of Apelin on Renal Fibrosis in Unilateral Ureteral Obstruction Mice

WANGLi-yan,DIAOZong-li,ZHANGQi-dong,etal.DepartmentofNephrology,AffiliatedBeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China

Objective To investigate the effect of biological active peptide Apelin and its mechanism and analyze the compensatory change of partial Apelin/APJ system of serum and kidney in the process of renal fibrosis in unilateral ureteral obstruction(UUO) mice.Methods In January 2014,a total of 60 seven-week-old male C57Bl/6j mice were selected.We established mice models of UUO and made Sham operated mice as controls.After surgery,intraperitoneal injection of Apelin-13(0.1 μmol/kg) or the same amount of 0.9% sodium chloride solution(vehicle) was administrated on mice everyday.The mice were divided into four experimental groups (15 mice/group) according to operation mode and postoperative drug administration:Sham+vehicle group,Sham+Apelin group,UUO+vehicle group and UUO+Apelin group.Two weeks after surgery,mice were killed and the operative kidneys were taken for various tests.Masson′s trichrome staining was performed to evaluate the extent of renal fibrosis.RT-PCR analysis was performed to evaluate the expression of kidney extracellular matrix collagens,including Fibronectin,Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ,as well as the expression of Apelin and APJ in kidneys.Western blotting method was performed to determine the expression of E-cadherin and α-SMA,as well as the expression of TGF-β/Smads signaling molecules TGF-β1,TGF-βR1,and p-Smad2.ELISA method was performed to determine the expression of Apelin in serum.Results The 4 groups were significantly different in the degree of renal fibrosis (P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were higher than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group in the degree of renal fibrosis(P<0.05);UUO+Apelin group was lower than UUO+vehicle group in the degree of renal fibrosis(P<0.05).The 4 groups were significantly different in the expression of Fibronectin,CollagenⅠand Collagen Ⅲ(P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were higher than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group in the expression of Fibronectin,CollagenⅠ and Collagen Ⅲ in kidney(P<0.05);UUO+Apelin group was lower than UUO+vehicle group in the expression of Fibronectin,CollagenⅠ and Collagen Ⅲ(P<0.05).The 4 groups were significantly different in the expression of E-cadherin and α-SMA in kidney(P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were lower in the expression of E-cadherin and higher in the expression of α-SMA than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group (P<0.05);UUO+Apelin group was higher in the expression of E-cadherin and lower in the expression of α-SMA than UUO+vehicle group (P<0.05).The 4 groups were significantly different in the expression of TGF-β1,TGF-βR1 and p-Smad2 (P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were higher than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group in the expression of TGF-β1 、TGF-βR1、p-Smad2 (P<0.05);UUO+Apelin group was lower than UUO+vehicle group in the expression of TGF-β1,TGF-βR1,p-Smad2 (P<0.05).The 4 groups were significantly different in the expression of Apelin in kidney (P>0.05);the 4 groups were significantly different in the expression of APJ in kidney and Apelin in serum (P<0.05).UUO+vehicle group and UUO+Apelin group were higher in the expression of APJ in kidney and lower in the expression of Apelin in serum than Sham+vehicle group and Sham+Apelin group (P<0.05);UUO+Apelin group was lower in the expression of APJ in kidney and higher in the expression of Apelin in serum than UUO+vehicle group(P<0.05).Conclusion Apelin is able to inhibit epithelial-mesenchymal transdifferentitation in UUO mice by interfering TGF-β/Smads signal pathway,thus alleviating renal fibrosis.During the process of renal fibrosis,the expression of serum Apelin decreases and the expression of kidney APJ increases in mice,which may have certain compensatory effect on the development of chronic kidney diseases.

Fibrosis；Kidney diseases；Epithelial-mesenchymal transdifferentiation；Mice；Apelin

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81570660，81300607)；北京市自然科學(xué)基金課題(7132091)

100050北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腎內(nèi)科

劉文虎，100050北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腎內(nèi)科；E-mail:liuwh0211@126.com

R 692

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.012

2015-08-29；

2015-12-26)