病毒性腦炎患者腦脊液博爾納病病毒p40基因片段的檢測

陳　靜　徐　平　劉海軍

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　遵義　563003

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·論著·

病毒性腦炎患者腦脊液博爾納病病毒p40基因片段的檢測

陳靜徐平△劉海軍

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科遵義563003

【摘要】目的探討貴州遵義地區(qū)病毒性腦炎中博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)的感染情況以及BDV與病毒性腦炎的關(guān)系。方法采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ RT-PCR)方法檢測了54例病毒性腦炎患者和45例外科手術(shù)患者(除外神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其他常見病毒感染性疾病)腦脊液(CSF)中BDV p40基因片段，對陽性產(chǎn)物進(jìn)行基因序列測定及分析。結(jié)果病毒性腦炎患者CSF中BDV p40基因片段陽性率為11.1%(6/54)，明顯高于對照組(0)，F(xiàn)isher精確概率檢驗(yàn)，P<0.05；其中2例外周血單核細(xì)胞(PBMC)及CSF BDV p40基因片段均為陽性。PCR擴(kuò)增的目的基因片段陽性產(chǎn)物測序后，與NCBI網(wǎng)站GenBank提供的BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株V核苷酸序列比較同源性為100%，未發(fā)生突變。結(jié)論遵義及周邊地區(qū)部分病毒性腦炎患者中存在BDV感染；感染人體的BDV p40 中段基因片段存在高度的保守性，變異小，BDV p40中段基因片段可能是證實(shí)BDV感染的敏感標(biāo)記物。

【關(guān)鍵詞】Borna病病毒； 核蛋白；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)是有包膜的非節(jié)段性單股負(fù)鏈RNA病毒，具有高度的嗜神經(jīng)性[1]。BDV感染的是宿主十分廣泛，包括馬、羊、兔、貓、狗、牛、猴子、駱駝、羊駝、河馬以及包括人類在內(nèi)的靈長類。確定能被BDV感染并引起典型的博爾納病(Borna disease，BD)的是馬、羊。大量研究表明，BDV感染同神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，但能否引起人類BD仍有爭議[2]。無論是BDV核蛋白(nucleoprotein，p40)基因還是核蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的含量都是最高的，同時(shí)BDV p40基因片段也具有保守性以及變異性小的特點(diǎn)，這也讓BDV p40成為BDV檢測的理想指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ RT-PCR)檢測病毒性腦炎患者腦脊液中的BDV p40基因片段。

1材料與方法

1.1研究對象病例組系遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2013-10—2014-03住院收治的54例神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者，男26例，女28例，平均年齡(38.4±10.7)，全部來自遵義市及周邊地區(qū)，包括遵義縣14例，仁懷市9例，湄潭縣9例，桐梓縣8例，務(wù)川縣7例，道真縣4例，正安縣3例，收集腦脊液5 mL，腦脊液標(biāo)本采自患者發(fā)病后5 d內(nèi)。參照人民衛(wèi)生教育出版社出版的第2版供8年制及7年制《神經(jīng)病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者臨床表現(xiàn)、血常規(guī)檢測、腦脊液常規(guī)生化檢測、腦電圖及影像學(xué)等檢查均至少有2項(xiàng)符合VE的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組系本院非神經(jīng)系統(tǒng)疾病外科手術(shù)患者45例腦脊液，男17例，女28例，平均年齡(33±6)歲，均來自遵義市及周邊地區(qū)。其中遵義市11例，遵義縣9例，桐梓縣7例，赤水市5例，湄潭縣8例，鳳崗縣5例。所有研究對象均除外常見嗜神經(jīng)病毒感染，包括麻疹病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病毒。

1.2主要試劑及儀器BDV p40基因片段引物及探針設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[3]，p40-forward primer 5’-GGTTTAAAACTATGATGGCAGCCTTA-3’，p40-reverse primer 5’-GTGGATTAAACATCTGGAGTAGTGTAGC-3’，p40-probe 5’-FAM-ACCGGCCATCCCATGGTGAGAC-TAMRA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為78 bp。引物及探針均由美國Invitrogen公司合成。PrimeScripTMRT reagent kit、RT-PCR預(yù)混液購自大連TaKaRa公司，Viral RNA/DNA Mini Kit購自美國Invitrogen公司，BDV重組質(zhì)粒由廣州藍(lán)吉生物技術(shù)有限公司合成。PCR儀和熒光定量PCR儀分別是BIO-RAD公司的C1000TM thermal cycler和 C1000TM Touch thermal cycler。所有吸頭、試管、EP管均選用Axygen公司生產(chǎn)的去酶硅化耗材。

1.3方法

1.3.1總RNA提?。悍謩e收集明確診斷為病毒性腦炎患者發(fā)病5 d內(nèi)腦脊液及對照組腦脊液各5 mL，用Viral RNA/DNA Mini Kit提取CSF細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測濃度及OD值(1.8～2.0)及濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2BDV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將BDV重組質(zhì)粒定量并計(jì)算其拷貝數(shù)，梯度稀釋成108、107、106、105、104、103、102拷貝/μL作為陽性模板在C1000TM Touch thermal cycler在進(jìn)行PCR擴(kuò)增，CFX96TM Real-time system分析結(jié)果并得出PCR擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.3FQ RT-PCR檢測BDV p40基因：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL，Oligo dT Prime 1 μL，Random 6 mers 4 μL，Total RNA 6 μL，RNase dH2O 4 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。RT-PCR反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 12.5 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，Taqman Probe 1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 8.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，59 ℃退火延伸30 s。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性、陰性及空白對照，每次實(shí)驗(yàn)每例標(biāo)本做2個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3遍。

1.3.4陽性產(chǎn)物的鑒定和序列分析：將BDV p40基因片段陽性產(chǎn)物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL加樣，以3%瓊脂糖3～4 V/cm電壓電泳45 min，在凝膠成像系統(tǒng)掃描并照相。將BDV p40基因片段陽性標(biāo)本送至大連寶生物技術(shù)有限公司基因測序。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采取Fisher精確概率檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

病例組54例中6例CSF BDV p40基因片段陽性，陽性率11.1%，其中2例PBMC及CSF中BDV p40基因片段均為陽性，對照組均為陰性，陽性率為0。

2.1濃度分別為108、107、106、105、104、103、102拷貝/μL的BDV重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增曲線圖見圖1。以起始拷貝數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)得到擴(kuò)增效率為99.6%，相關(guān)系數(shù)為0.992，截距為42.251，斜率為-3.332的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，說明起始模板濃度與CT值間保持良好的線性關(guān)系，可用于未知樣本中目的基因拷貝數(shù)的計(jì)算。

圖1　梯度稀釋的BDV重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增曲線

2.2陽性患者CSF中BDV基因的表達(dá)水平及擴(kuò)增圖見圖2。

圖2　6例患者BDV p40基因陽性CSF PCR擴(kuò)增曲線

2.3BDVp40基因陽性標(biāo)本CSF中BDV p40的拷貝數(shù)見表1。

表1　BDV p40基因陽性標(biāo)本CSF中BDV p40的拷貝數(shù)

2.4BDV p40基因陽性CSF PCR擴(kuò)增BDV p40基因片段電泳圖見圖3。

圖3不明原因的病毒性腦炎患者腦脊液PCR擴(kuò)增BDV p40基因片段電泳圖M為DNAmarker，1-6為陽性腦脊液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物長度為78 bp，7為陰性腦脊液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.5測序結(jié)果PCR擴(kuò)增的目的基因片段陽性產(chǎn)物測序后，與NCIB網(wǎng)站GenBank提供的BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株V核苷酸序列比較同源性為100%，未發(fā)生突變。PCR擴(kuò)增后目的基因片段序列測定結(jié)果與BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株V核苷酸序列比較：Strain V(核苷酸序號(hào)：U04608.1)

TGTGGATTAAACATCTGGAGTAGTGTAGCAGTCTCACCATGGGATGGCCGGTTTAAGGCTGCCATCATAGTTTTAAACC

VE

TGTGGATTAAACATCTGGAGTAGTGTAGCAGTCTCACCATGGGATGGCCGGTTTAAGGCTGCCATCATAGTTTTAAACC

3討論

近年來，在人類基因組發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性似BDV核蛋白基因序列(endogenous Bornalike N sequences，EBLNs)使得大家對BDV的研究更加有興趣[4]。BDV宿主較為廣泛，越來越多的物種被檢測出BDV感染的證據(jù)，但目前確定能被BDV感染且能致病的是馬和羊，人類是其宿主之一，是否能致病仍有爭議，世界各地都有檢出，我國在重慶、新疆、寧夏、貴州及哈爾濱都有檢出[5]，因此，對BDV流行病學(xué)方面的研究很有必要。

目前對BDV檢測的標(biāo)記物主要有BDV p40和p24的RNA、抗原、特異性抗體及免疫復(fù)合物(CIC)，由于血液較腦脊液的收集更為方便，同時(shí)腦脊液中的有形成分含量少的特點(diǎn)，因此多數(shù)研究都以血液為主，而對腦脊液的研究較少，國內(nèi)僅王振海等[6]、郭振元等[7]對腦脊液中BDV p24的進(jìn)行檢測，尚未見對腦脊液中BDV p40進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)以腦脊液BDV p40為研究對象。BDV檢測主要方法包括PCR、ELSIA、WB及病毒分離，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，至今仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)采用FQ RT-PCR(探針法)對BDV p40基因片段進(jìn)行檢測，特異性和靈敏性都較好，與常用的nRT-PCR相比能夠降低交叉污染的可能性和假陽性的概率，而探針法的特異性也較普通熒光染料法好，且操作簡單。

本次研究采用FQ RT-PCR(探針法)對遵義及周邊地區(qū)54例病毒性腦炎患者腦脊液和45例對照組患者腦脊液進(jìn)行BDV p40基因檢測，病例組陽性率為11.1%(6/54)，拷貝數(shù)如表1所示；對照組陽性率為0；Fisher精確法對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P=0.03。說明遵義及周邊地區(qū)存在BDV感染，病毒性腦炎可能與BDV的感染有關(guān)。6例腦脊液BDV p40陽性患者中2例血液中的BDV p40 陽性，而4例腦脊液BDV p40陽性患者血液中的BDV p40陰性，提示腦脊液和血液中的BDV p40片段的檢測結(jié)果并不完全對等。分析其產(chǎn)生的原因可能有：(1)由博爾納病病毒的特性決定，博爾納病病毒是高度的嗜神經(jīng)病毒，主要寄生于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞內(nèi)，盡管外周血淋巴細(xì)胞、尿液、淚液中也存在，但含量仍較神經(jīng)細(xì)胞中少[8]。(2)可能與博爾納病病毒的傳染病學(xué)特點(diǎn)有關(guān)，博爾納病病毒主要通過嗅神經(jīng)和三叉神經(jīng)直接侵犯并進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)[9]，避開血腦屏障的屏蔽作用，而不是通過神經(jīng)系統(tǒng)以外的途徑感染宿主。(3)宿主因素：由于血腦屏障的作用使得腦脊液和血液中的BDV分布不同。

早在1998年謝鵬等[10]對5例BDV p24基因片段陽性精神分裂癥患者、4例BDV p24基因片段陽性情感障礙患者及3例健康獻(xiàn)血者的血液進(jìn)行BDV p40基因前部片段的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)果均是陰性，提示感染人和感染動(dòng)物的BDV p40前部基因片段同源性較小。但徐平等[11]在2004年采用nest RT-PCR對BDV p24陽性的1例病毒性腦炎、2例精神分裂癥和1例情感障礙病人進(jìn)行BDV p40中部基因片段進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)其中4例BDV p40中部基因片段陽性，提示BDV p40中段基因片段可能是BDV感染的另一可靠指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增的目的基因片段陽性產(chǎn)物測序，與NCBI網(wǎng)站GenBank提供的BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株V核苷酸序列比較同源性為100%，未發(fā)生突變，說明感染動(dòng)物和感染人的BDV p40中部基因差異性小，同源性好；進(jìn)一步證明BDV p40中部基因片段可作為BDV感染的可靠指標(biāo)。

4參考文獻(xiàn)

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(收稿2014-12-22)

Detection of the p40 nucleotide fragment of Borna disease virus from cerebrospinal fluid of patients with viral encephalitis

ChenJing，XuPing，LiuHaijun

DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi563003，China

【Abstract】ObjectiveTo discuss the relationship between Borna disease virus(BDV) and the viral encephalitis and study the infection situation of Brona disease virus(BDV) in patients with viral encephalitis in Zunyi of Guizhou province. Methods The p40 nucleotide middle fragment of BDV in cerebrospinal fluid(CSF) in 54 patients with viral encephalitis and 43 control patients without neverous system disease and were not infected with usual virus but with surgical operations were examined by the reverse transcriptase PCR and fluorescence quantitative PCR(FQ-RT-PCR). Results It was found that the positive was 6/54(11.1%) and it was significantly higher than that of the controls 0/45，in which the Fisher test：P=0.03. 2 of 6 were also positive in peripheral blood mononuclear cell (PBMC). The homologies of gene sequence of aim gene fragment amplified by PCR with the standard virus strains V supplied by NCBI web station of GenBank were 100%，there were no mutations. Conclusion These results suggest that BDV infection really exists in patients with viral encephalitis in Zunyi and the surrounding regions of Zunyi and the infection of BDV may be related to viral encephalitis. The p40 nucleotide middle fragment of BDV is very conservative and rare mutational and it may be a sensitive marker

【Key words】Viral encephalitis； Borna disease virus； Reverse transcriptase polymerase chain reaction

【中圖分類號(hào)】R512.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)03-0001-03

通訊作者：△徐平，博士，E-mail：xuping527@sohu.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31160210)