基因沉默白介素8對(duì)激素非依賴前列腺癌干細(xì)胞的生物特性的影響

孫夢(mèng)奎　張紀(jì)恒　崔　韻　金　杰

作者單位:100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院

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基因沉默白介素8對(duì)激素非依賴前列腺癌干細(xì)胞的生物特性的影響

孫夢(mèng)奎張紀(jì)恒崔韻金杰

作者單位:100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院

【摘要】目的探討小干擾RNA沉默激素非依賴前列腺癌DU145細(xì)胞白介素8基因?qū)δ[瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性及耐藥性的影響。方法用不同劑量的小干擾RNA沉默激素非依賴前列腺癌DU145細(xì)胞IL-8基因，應(yīng)用流式儀檢測(cè)ALDH陽(yáng)性細(xì)胞比例的變化。采用懸浮細(xì)胞成球和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別觀察腫瘤干細(xì)胞自我更新和體外成瘤能力的變化。Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，Western-blot法分析Akt蛋白的變化。結(jié)果DU145細(xì)胞IL-8基因的沉默能降低腫瘤干細(xì)胞的比例，顯著降低腫瘤干細(xì)胞懸浮細(xì)胞成球率和克隆形成率。多西他賽能顯著抑制IL-8基因沉默DU145細(xì)胞的活性。Western-blot顯示Akt的磷酸化被顯著抑制。結(jié)論IL-8基因的沉默能顯著抑制激素非依賴前列腺癌干細(xì)胞的自我更新和體外成瘤能力，增加該群細(xì)胞對(duì)多西他賽的化療敏感性，同時(shí)顯著抑制了Akt的磷酸化，這可能是IL-8基因沉默抑制該群細(xì)胞干細(xì)胞特性的作用機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】IL-8；DU145；腫瘤干細(xì)胞；Akt

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:191～194)

有研究表明IL-8在激素非依賴前列腺癌中高表達(dá)，而在激素敏感前列腺癌和正常前列腺上皮中低表達(dá)[1]。有報(bào)道稱白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)能夠促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，阻斷IL-8能夠很有效的殺傷乳腺癌干細(xì)胞[2-4]。本實(shí)驗(yàn)將通過小干擾RNA沉默前列腺癌細(xì)胞IL-8基因，觀察腫瘤干細(xì)胞比例、干細(xì)胞特性、化療敏感性的變化以及出現(xiàn)該現(xiàn)象的潛在機(jī)制，為激素非依賴前列腺癌的臨床治療提供一定的參考。

1材料與方法

1.1　激素非依賴前列腺癌細(xì)胞系

激素非依賴前列腺癌細(xì)胞株DU145購(gòu)于ATCC(American Type Culture Collection)公司。細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)中，添加青霉素 100 IU/mL、鏈霉素 100 IU/mL。

1.2　試劑與儀器

IL-8 siRNA購(gòu)于蘇州吉瑪公司，ALDEFLUORTM試劑盒購(gòu)于STEMCELL公司，Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技有限公司，CCK-8購(gòu)于日本東仁公司，CD44、Oct4、IL-8、GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司，極低黏附培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)康寧公司，流式儀(FAS Scan，Becton Dickinson，美國(guó))，酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國(guó))。

1.3　主要方法

1.3.1siRNA轉(zhuǎn)染IL-8 siRNA有效序列為：上游:5’-GCCAGAUGCAAUACAAGAUTT-3’下游:5’-AUCCUUGUAUUGCAUCUGGCTT-3’，陰性對(duì)照組(negative control，NC)，序列為：上游:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，使用INTERFERINGTM試劑轉(zhuǎn)染(Polyplus Transfection，法國(guó))，按試劑盒操作說明優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，分別將IL-8 siRNA以20、40和80 nM的終濃度加入DU145細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h以后，細(xì)胞用于其它功能實(shí)驗(yàn)。

1.3.2流式儀鑒定和分選前列腺癌腫瘤干細(xì)胞胰酶消化不同濃度轉(zhuǎn)染后的DU145細(xì)胞，2 000 rpm/min水平離心5 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液重懸，使細(xì)胞濃度達(dá)到106個(gè)/mL。按5 μL/mL的濃度加入Aldefluor的底物與離心管中，對(duì)二乙氨基苯甲醛(DEAB)為陰性對(duì)照組?；旌暇鶆?，37 ℃培養(yǎng)30 min，2 000 rpm/min，離心5 min，棄上清液，Aldefluor緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)與分選。

1.3.3懸浮細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)操作方法如以前文章報(bào)道[5]，即分選后的DU145細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種在極低黏附6孔板，每孔加入4 mL的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基、2% B27(Invitrogen)、20 ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、20 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Peprotech)。10天以后，計(jì)數(shù)大于20個(gè)細(xì)胞的懸浮細(xì)胞球，懸浮細(xì)胞成球率(%)=(懸浮細(xì)胞球數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.4克隆形成實(shí)驗(yàn)分選后的DU145細(xì)胞，以500個(gè)/孔接種于普通6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)在10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)基中。10天后，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色。計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，克隆形成率(%)=(形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.5細(xì)胞活性檢測(cè)用40 nM siRNA和Scramble siRNA轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，24 h后用流式儀分選出ALDH+細(xì)胞，各組分別以5×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，并給予DMSO、1 nM、2 nM、4 nM、8 nM多西他賽處理72 h，然后每孔加入10 μL的CCK-8試劑和100 μL的新鮮培養(yǎng)基混合液。在37 ℃孵育1 h后，于波長(zhǎng)450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(OD)值。細(xì)胞活性(%)=(siIL-8組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.6Western Blot以RIPA裂解細(xì)胞獲得裂解液，等量蛋白采用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h,加入一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗常溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光和曝光顯影。其中一抗效價(jià)是1∶1 000~1∶2 000，選擇對(duì)照為GAPDH。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　DU145細(xì)胞株中腫瘤干細(xì)胞的分選和鑒定

DU145細(xì)胞系中，運(yùn)用流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測(cè)ALDH+的細(xì)胞比例為(3.32±0.42)%(圖1)。

圖1　DU145細(xì)胞株前列腺癌干細(xì)胞的分選

2.2　IL-8 siRNA降低腫瘤干細(xì)胞的比例

IL-8 siRNA能顯著抑制IL-8基因的表達(dá)。20 nM、40 nM、80 nM siRNA處理DU145細(xì)胞后，前列腺癌干細(xì)胞的比例依次降低到(2.43±0.13)%、(1.56±0.12)%、(0.84±0.07)%(圖2)。

圖2　基因沉默IL-8對(duì)DU145細(xì)胞株腫瘤干細(xì)胞比例的影響

2.3　IL-8 siRNA增強(qiáng)前列腺癌干細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性

相比陰性對(duì)照組，多西他賽能顯著抑制基因敲除組的細(xì)胞活性(圖3)。

圖3　基因沉默IL-8影響腫瘤干細(xì)胞對(duì)多西他賽

2.4　IL-8 siRNA抑制了Akt的磷酸化

分選的ALDH+細(xì)胞，用不同濃度的siRNA轉(zhuǎn)染48 h，發(fā)現(xiàn)IL-8 siRNA能抑制Akt蛋白的磷酸化，總Akt蛋白無明顯變化，見圖4。

圖4　基因沉默IL-8抑制腫瘤干細(xì)胞中Akt的磷酸化

2.5　IL-8 siRNA抑制前列腺癌干細(xì)胞的自我更新和體外成瘤能力

IL-8 siRNA能顯著抑制前列腺癌干細(xì)胞的干細(xì)胞特性，20 nM、40 nM和80 nM siRNA處理ALDH+的DU145細(xì)胞后，其懸浮細(xì)胞成球率依次降低為(8.67±0.34)%、(5.39±0.41)%和(4.22±0.22)%(圖5a),其細(xì)胞克隆形成率降低為(10.87±0.57)%、(6.17±1.04)%和(5.19±0.20)%(圖5b)。

圖5　基因沉默IL-8對(duì)前列腺癌干細(xì)胞懸浮成球和克隆形成能力的影響

3討論

激素非依賴期前列腺癌細(xì)胞能分泌IL-8，但是激素依賴期前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞則不分泌。在前列腺癌中，乙醛脫氫酶(ALDH)的活性可以作為鑒定腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。通過流式儀檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)DU145細(xì)胞中包含有一群ALDH+的細(xì)胞。其能高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CD44和Oct4。在無血清低黏附培養(yǎng)環(huán)境下，腫瘤干細(xì)胞和正常干細(xì)胞具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，能形成懸浮細(xì)胞球，而非干細(xì)胞則不能存活。相比ALDH-細(xì)胞，ALDH+細(xì)胞具有很強(qiáng)的懸浮成球能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前報(bào)道一致，驗(yàn)證了ALDH+細(xì)胞具有很強(qiáng)的腫瘤干細(xì)胞特性，可以作為前列腺癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物[6]。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)IL-8蛋白在ALDH+細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于ALDH-群。

為了探究IL-8與激素非依賴前列腺癌干細(xì)胞的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)用小干擾RNA沉默DU145細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)ALDH+細(xì)胞的比例明顯下降。為了更進(jìn)一步的探討IL-8基因敲除對(duì)腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞特性如自我更新和體外成瘤能力的影響，通過懸浮細(xì)胞成球和克隆形成實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)沉默IL-8基因，能顯著抑制ALDH+細(xì)胞的自我更新和成瘤能力。

腫瘤干細(xì)胞能高表腫瘤耐藥相關(guān)基因，因此對(duì)常規(guī)化療藥物并不敏感。通過細(xì)胞活性檢測(cè)，IL-8基因沉默的前列腺癌干細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性顯著增強(qiáng)。

PI3K/Akt信號(hào)通路在維持前列腺癌干細(xì)胞的穩(wěn)定性中起到非常重要的作用[7]，同時(shí)PI3K/Akt也是IL-8參與腫瘤細(xì)胞的生存、血管生成和細(xì)胞遷徙的重要的下游通路[8]。我們發(fā)現(xiàn)，沉默IL-8基因，抑制了Akt的激活。這說明PI3K/Akt信號(hào)通路是IL-8參與維持激素非依賴前列腺癌干細(xì)胞穩(wěn)定性的通路之一。

綜上所述，沉默腫瘤細(xì)胞IL-8基因，能顯著的清除激素非依賴前列腺癌腫瘤干細(xì)胞，明顯抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新和成瘤能力，增加其對(duì)多西他賽的化療敏感性。其機(jī)制可能是通過抑制PI3K/Akt通路。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明IL-8基因沉默能靶向清除激素非依賴前列腺癌干細(xì)胞，增加對(duì)西他賽的化療敏感性，為前列腺癌的臨床治療提供參考。

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(編輯：吳小紅)

Effect of Interleukin-8 Silencing on Androgen-independent Prostate Cancer Stem Cells

SUNMengkui，ZHANGJiheng,CUIYun,etal.PekingUniversityFirstHospital，Beijing,100034

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of IL-8 silencing via small interfering RNA on androgen-independent prostate cancer stem cells and drug sensitive.MethodsDU145 cells transfected with different concentration of IL-8 siRNA were collected.The percentage of ALDH+cells were detected by flow cytometry.The sphere formation rate and cloning efficiency were determined by sphere formation assay and clonogenic assay.The viability of cells was detected by CCK-8 assay.The phosphorylation of Akt was evaluated by Western blot.ResultsThe percentage of ALDH+cells were declined under different concentration of IL-8 siRNA in DU145 cells.Sphere formation rate and cloning efficiency of prostate cancer stem cells were decreased by siRNA.The viability of IL-8 silencing DU145 cells was significantly suppressed compared with control groups and the Akt phosphorylation was activated.ConclusionIL-8 siRNA can eliminate androgen-independent prostate cancer stem cells and suppresses the self-renew and clonogenic capacity of prostate cancer stem cells.IL-8 silencing sensitizes prostate cancer stem cells to docetaxel and inactivates the Akt pathway.

【Key words】IL-8；DU145；Cancer stem cell；Akt

(收稿日期2015-03-19修回日期 2015-12-12)

中圖分類號(hào)：R737.25

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)02-0191-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.005

通訊作者：金杰