氨基甾體Z1對(duì)MEG-01白血病細(xì)胞的抑制增殖及誘導(dǎo)分化作用

周　陽(yáng)　張　君　李　震　何　群

?

·基礎(chǔ)研究·

氨基甾體Z1對(duì)MEG-01白血病細(xì)胞的抑制增殖及誘導(dǎo)分化作用

周陽(yáng)張君李震何群

【摘要】目的觀察氨基甾體Z1對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病MEG-01細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用。方法采用液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)觀察氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞的抑制增殖作用；采用Wright染色、AS-D NAE染色、細(xì)胞膜CD41表面標(biāo)記物檢測(cè)氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。結(jié)果10-8～10-4mol/L的氨基甾體Z1連續(xù)作用后，細(xì)胞和集落計(jì)數(shù)明顯減少，處理組MTT值顯著降低，且呈濃度依賴；Wright染色顯示處理組細(xì)胞有分化表現(xiàn)，AS-D NAE染色A值升高(P<0.01)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處理組細(xì)胞膜上CD41表面標(biāo)記表達(dá)陽(yáng)性率為76%。結(jié)論氨基甾體Z1能顯著抑制MEG-01細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其向巨核細(xì)胞系分化，提示該藥或可成為慢性粒細(xì)胞白血病的一種新型誘導(dǎo)分化劑。

【關(guān)鍵詞】氨基甾體，MEG-01細(xì)胞，增殖分化，白血病

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:175～178)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是造血系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性克隆增生性疾病。本實(shí)驗(yàn)室以往的工作證實(shí)[1-2]，氨基甾體類化合物能有效地抑制WEHI-3B、HL-60、K562白血病細(xì)胞系的增殖，并誘導(dǎo)其向單核系或紅系分化。本實(shí)驗(yàn)采用氨基甾體Z1作用于人慢性粒細(xì)胞白血病MEG-01細(xì)胞，觀察該藥物對(duì)MEG-01細(xì)胞增殖分化的影響，為白血病藥物治療新方向提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1細(xì)胞系MEG-01細(xì)胞株來(lái)自一位CML患者成巨核細(xì)胞轉(zhuǎn)換期的骨髓細(xì)胞，酸性磷酸酶陽(yáng)性，堿性磷酸酶陰性，Ph染色體陽(yáng)性。由湘雅醫(yī)學(xué)院血液生理研究室保存。用含10%熱滅活小牛血清的RPMI1640置37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每4～5 d換液1次。

1.1.2試劑RPMI1640培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品，小牛血清購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司。氨基甾體Z1由本實(shí)驗(yàn)室何群教授合成。MTT為AMRESCO公司產(chǎn)品。瑞氏染料1 g加入600 ml甲醇配成瑞氏染劑。醋酸AS-D萘酚、監(jiān)牢藍(lán)B鹽購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司。FITC標(biāo)記的鼠抗人CD41單克隆抗體購(gòu)自深圳晶美生物公司。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取指數(shù)生長(zhǎng)期MEG-01細(xì)胞以1.0×105個(gè)/ml終濃度加入到10 ml含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液(培養(yǎng)體系)中，處理組調(diào)整加入終濃度為10-4～10-8mol/L的氨基甾體Z1，對(duì)照組加入等量DMSO。每孔1 ml接種于24孔板，每組平行種3孔。置37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)5 d，每天計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2集落培養(yǎng)取指數(shù)生長(zhǎng)期MEG-01細(xì)胞以終濃度1.0×105個(gè)/ml加入到體外半固體培養(yǎng)體系中(含30%小牛血清，0.9%甲基纖維素)，處理組調(diào)整加入終濃度為10-4～10-8mol/L的氨基甾體Z1，對(duì)照組加入等量DMSO。每孔0.5 ml接種于24孔板，每組平行種3孔，置37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)8 d后，置倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落，并顯微照相。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3MTT檢測(cè)取指數(shù)生長(zhǎng)期MEG-01細(xì)胞以1.0×105個(gè)/ml終濃度加入培養(yǎng)體系，處理組加入終濃度為10-4～10-8mol/L的氨基甾體Z1，對(duì)照組加入等量DMSO。每孔200 μl接種于96孔板，每組平行種3孔。置37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)5 d后離心，去上清，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl及PBS 100 μl，37 ℃、5%CO2飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心，去上清，加入150 μl DMSO，充分震蕩，用酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek，ELx800UV)檢測(cè)各孔A值，波長(zhǎng)492 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Wright染色取指數(shù)生長(zhǎng)期MEG-01細(xì)胞以1.0×105個(gè)/ml終濃度加入到培養(yǎng)體系，處理組加入終濃度為10-6mol/L的氨基甾體Z1，對(duì)照組加入等量DMSO。置37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)5 d后，收集細(xì)胞，涂片做Wright染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并顯微照相。

1.2.5醋酸AS-D萘酚酯酶染色(AS-D NAE) 取指數(shù)生長(zhǎng)期MEG-01細(xì)胞以1.0×105個(gè)/ml終濃度加入到培養(yǎng)體系，處理組加入終濃度為10-4～10-8mol/L的氨基甾體Z1，對(duì)照組加入等量DMSO，于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)5 d。第5 d離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞分別置于20 ml孵育液(含PBS，PH7.4磷酸鹽緩沖液，醋酸AS-D萘酚10 mg，丙酮液0.25 ml，監(jiān)牢藍(lán)B鹽20 mg)中，37 ℃水浴10 min，離心，懸浮。熒光分光光度計(jì)570 nm下進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)取指數(shù)生長(zhǎng)期MEG-01細(xì)胞以1.0×105個(gè)/ml終濃度加入到培養(yǎng)體系，處理組加入終濃度為10-6mol/L的氨基甾體Z1，對(duì)照組加入等量DMSO。置37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)5 d后，收集106個(gè)細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞3次，加入FITC標(biāo)記的鼠抗人CD41單克隆抗體，4 ℃避光反應(yīng)30 min，再用PBS洗滌細(xì)胞3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　細(xì)胞增殖指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞液體培養(yǎng)的影響加入10-8～10-4mol/L的氨基甾體Z1連續(xù)培養(yǎng)5 d，隨著藥物濃度增大，MEG-01細(xì)胞生長(zhǎng)抑制越明顯。說(shuō)明氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞生長(zhǎng)呈濃度依賴性抑制(表1，圖1)。

組別MEG-01細(xì)胞數(shù)(×104/ml)d0d1d2d3d4d5對(duì)照組10.00±0.0012.92±1.4919.14±0.9435.11±3.1272.72±5.69107.92±4.97氨基甾體濃度 10-8mol/L10.00±0.0012.31±1.9215.79±0.84**22.86±4.10**33.04±5.89**42.56±3.92** 10-7mol/L10.00±0.0011.60±1.47*14.71±0.83**20.36±3.21**31.57±11.37**40.93±12.24** 10-6mol/L10.00±0.0011.88±1.3214.03±0.57**19.04±1.95**28.11±4.99**37.04±7.39** 10-5mol/L10.00±0.0010.97±0.99**12.83±1.49**16.84±1.38**24.26±1.49**32.01±2.15** 10-4mol/L10.00±0.0010.13±0.65**11.61±0.70**11.76±0.97**12.38±1.37**12.28±0.85**

注：*表示與對(duì)照組比較P<0.05，**表示與對(duì)照組比較P<0.01。

圖1　10-8~10-4mol/L氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞

2.1.2氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞集落產(chǎn)率的影響

加入10-8～10-4mol/L的氨基甾體Z1連續(xù)培養(yǎng)8 d后，MEG-01細(xì)胞集落產(chǎn)率降低，且呈一定濃度依賴性(表2)。

2.1.3氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞MTT值的影響

加入10-8～10-4mol/L的氨基甾體Z1連續(xù)培養(yǎng)MEG-01細(xì)胞5 d，各濃度作用下的細(xì)胞GIR分別為：10-8mol/L、(50.87±11.67)%，10-7mol/L、(56.71±4.52)%，10-6mol/L、(66.60±6.37)%，10-5mol/L、(77.65±3.10)%，10-4mol/L、(94.17±3.05)%?？梢?jiàn)，處理組細(xì)胞GIR增大，MTT值明顯降低，并呈一定濃度依賴關(guān)系(表2)。

2.2　細(xì)胞分化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞形態(tài)的影響氨基甾體Z1處理MEG-01細(xì)胞5 d后Wright染色，油鏡下觀察。對(duì)照組細(xì)胞大部分呈圓形或橢圓形，外形不規(guī)整，胞質(zhì)呈云霧狀或刷狀，部分有空泡，細(xì)胞核大，染色質(zhì)粗細(xì)不均，部分細(xì)胞核仁大而明顯。處理組細(xì)胞體積增大，核漿比例減小，細(xì)胞核不規(guī)則，核質(zhì)變粗，胞質(zhì)增多，淺染，核周胞質(zhì)出現(xiàn)淡染區(qū)，有一定程度的分化表現(xiàn)。

2.2.2氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞AS-D NAE染色的影響加入10-8～10-4mol/L的氨基甾體Z1連續(xù)培養(yǎng)5 d，處理組AS-DNAE染色后A570 nm值明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明處理組MEG-01細(xì)胞有向巨核系成熟方向分化的表現(xiàn)(表2)。

2.2.3MEG-01細(xì)胞膜CD41表面標(biāo)記表達(dá)的檢測(cè)流式細(xì)胞儀分析顯示，終濃度為10-6mol/L的氨基甾體Z1作用于MEG-01細(xì)胞5 d后，MEG-01細(xì)胞膜上CD41表面標(biāo)記表達(dá)陽(yáng)性率為76%，說(shuō)明該化合物可誘導(dǎo)MEG-01細(xì)胞向巨核系分化(圖2)。

A為對(duì)照組；B為10-6mol/L氨基甾體Z1處理組。

3討論

造血干細(xì)胞增殖與分化的失平衡是白血病發(fā)生的重要原因，近年來(lái)的藥物研究著力于尋找能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向正常細(xì)胞分化的藥物，此類藥物的特點(diǎn)是不殺死腫瘤細(xì)胞，而是誘導(dǎo)其向成熟細(xì)胞分化，以達(dá)到治療效果。上世紀(jì)60年代，Piercet首先發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸畸胎瘤細(xì)胞可以自發(fā)地分化成良性的正常細(xì)胞[3]，證實(shí)了通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化來(lái)治愈惡性腫瘤的假設(shè)，開(kāi)創(chuàng)了惡性腫瘤的分化誘導(dǎo)研究。隨后，我國(guó)的王振義教授應(yīng)用全反式維甲酸治療急性早幼粒細(xì)胞白血病，患者完全緩解率達(dá)72%[4]，其作用機(jī)制就是該藥能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的分化和凋亡。這一報(bào)道開(kāi)創(chuàng)了臨床應(yīng)用誘導(dǎo)分化劑治療白血病的先河。2001年5月美國(guó)食品和藥物管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)Gleevec為治療新診斷慢粒的第一線藥物，作為1種有效的基因靶向藥物在CML的治療上開(kāi)辟了一條新的途徑，目前該藥在臨床藥物治療中仍占有重要地位[5]。在成功案例的啟發(fā)下，經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的努力探究，至今全球已發(fā)現(xiàn)和合成各類誘導(dǎo)分化劑80余種，并有30多種獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床[6]。

甾體是具有廣泛生物活性的一類物質(zhì)，甾體類化合物不僅在正常細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，紅細(xì)胞的氧化損傷，臟器缺血再灌注的修復(fù)和神經(jīng)的修復(fù)過(guò)程中起到重要的作用，而且對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化也有著重要的調(diào)節(jié)作用[7-8]。氨基甾體是一類新合成的化合物，被美國(guó)《化學(xué)文摘》確定為國(guó)際上首次合成的新化合物，并已確證該類化合物具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化、抑制增殖的作用，而且發(fā)現(xiàn)其具有獨(dú)特的作用機(jī)理，對(duì)正常的造血細(xì)胞毒副作用較小。

本實(shí)驗(yàn)顯示氨基甾體Z1作用后，MEG-01細(xì)胞的液體培養(yǎng)和集落生成均被明顯抑制，藥物處理后MTT檢測(cè)不同濃度下GIR也有明顯升高，可見(jiàn)5種濃度的氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞都有抑制增殖的作用且呈一定的濃度依賴關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)氨基甾體Z1對(duì)MEG-01細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)分化作用。終濃度為10-6mol/L的氨基甾體Z1作用于MEG-01細(xì)胞5 d后，做細(xì)胞涂片，油鏡下觀察細(xì)胞呈現(xiàn)一定程度的分化表現(xiàn)。原始粒細(xì)胞中的醋酸AS-D萘酚酯酶含量極低，隨著細(xì)胞向巨核系成熟方向發(fā)展，胞質(zhì)中的醋酸AS-D萘酚酯酶含量逐漸升高。因此，AS-D NAE染色能在一定程度上反應(yīng)巨核系細(xì)胞的分化成熟情況。處理組細(xì)胞經(jīng)AS-DNAE染色，熒光強(qiáng)度值明顯升高，說(shuō)明氨基甾體Z1能誘導(dǎo)MEG-01細(xì)胞向巨核系成熟方向分化。CD41又稱GP Ⅱb或αⅡ β整合素，是1種相對(duì)分子量為14 kD的膜糖蛋白，在巨核細(xì)胞和血小板細(xì)胞膜上特異表達(dá)。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示經(jīng)10-6mol/L的氨基甾體Z1作用5 d后，MEG-01細(xì)胞膜上CD41表面標(biāo)記表達(dá)上調(diào)，證明MEG-01細(xì)胞有向巨核系分化成熟的傾向。

組別 集落數(shù)①A492nm②A570nm③對(duì)照組349.11±18.760.554±0.020.015±0.002氨基甾體濃度 10-8mol/L297.33±13.08**0.272±0.06**0.078±0.045** 10-7mol/L281.56±17.94**0.240±0.03**0.105±0.002** 10-6mol/L225.44±35.88**0.185±0.04**0.159±0.005** 10-5mol/L92.67±13.14**0.123±0.01**0.222±0.014** 10-4mol/L2.89±4.68**0.032±0.02**0.304±0.040**

注：①不同濃度氨基甾體Z1處理細(xì)胞8 d，集落數(shù)/0.5 ml體系；②不同濃度氨基甾體Z1處理細(xì)胞5 d，MTT實(shí)驗(yàn)酶標(biāo)儀所測(cè)A492 nm值；③不同濃度氨基甾體Z1處理細(xì)胞5 d，AS-D NAE染色實(shí)驗(yàn)熒光分光光度計(jì)所測(cè)A570 nm值;**為與對(duì)照組比較，P<0.01。

綜上所述，氨基甾體Z1可以有效地抑制MEG-01細(xì)胞的增殖，并能誘導(dǎo)其向巨核系分化。

參考文獻(xiàn)

[1]He Q,Dong J,Zhen HY,et al.A small molecule significantly inhibits the bcr/abl fusion gene at the mRNA level in human chronic myelogenous leukemia〔J〕.Leuk Res,2011,35(8):1074-1079.

[2]張君，周陽(yáng)，何群.氨基甾體H42649對(duì)K562白血病細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用〔J〕.解剖學(xué)研究，2012，34(3)：215-219.

[3]Pierce GB Jr,Dixon FJ Jr,Verney EL.Teratocarcinogenic and tissue-forming potentials of the cell types comprising neoplastic embryoid bodies〔J〕.Lab Invest,1960,9:583-602.

[4]Huang ME,Ye YC,Chen SR,et al.Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia〔J〕.Blood,1988,72(2):567-572.

[5]Santorsola D,Abruzzese E.Successful Management of P-

regnancy and Hepatic Toxicity in a CML Female Patient Treated with Nilotinib:a Case Report and a Review〔J〕.Mediterr J Hematol Infect Dis，2015,7(1):e2015020.

[6]Jiang GS.Induction of committed differentiation and target immunotherapy of patients with hematopoietic malignancy〔J〕.Chin J Cancer Biother,2010,17(6):589-596.

[7]Sharifi S,Dzik WH,Sadrzadeh SM.Human plasma and Tirilazad mesylate protect stored human erythrocytes against the oxidative damage of gamma-irradiation〔J〕.Transfusion Medicine,2000,10(2):125-130.

[8]Gonzalez Deniselle MC,Gonzalez SL,De Nicola AF.Cellular basis of Steroid neuroprotection in the wobbler mouse,a genetic model of motoeuron disease〔J〕.Cell Mol Neurobiol,2001,21(3):237-254.

(編輯：吳小紅)

Proliferation-inhibiting and Differentiation-inducing Effects of Aminosteroid Z1 on

MEG-01 Leukemia Cells

ZHOUYang,ZHANGJun,LIZheng,etal.Hu'nanUniversityofMedicine,Huaihua,418000

【Abstract】ObjectiveTo explore the proliferation-inhibiting and differentiation-inducing effects of aminosteroid Z1 on human chronic myelogenous leukemia MEG-01 cells.MethodsLiquid culture,colony culture and MTT assay were used to detect the proliferation.Meanwhile,morphology,AS-D NAE stain and flow cytometry were adopted to measure the differentiation.Results

The number of MEG-01 cells and colony was decreased sufficiently after the constant treatment with 10-8~10-4mol/L aminosteroid Z1,and the MTT assay was decreased in a dose-dependent manner.The cells with Wright stain treatment had an obvious differentiation.The A figure of AS-D NAE stain increased and the positive rate of CD41 cell-surface marker on cytomembrane in flow cytometry reached 76%.ConclusionAminosteroid Z1 can effectively inhibit the differentiation of MEG-01 cells and induce them to differentiate into megakaryocytic lineage.It indicates that this kind of medicine may become a new differentiation inducer for chronic myelogenous leukemia.

【Key words】Aminosteroid；MEG-01 cell；Proliferation and differentiation；Leukemia

(收稿日期2015-03-19修回日期 2015-09-17)

中圖分類號(hào)：R733.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)02-0175-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.001

通訊作者：何群

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：39970316)
作者單位:418000 湖南醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院