蛋白激酶C-δ特異性脫氧核酶對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響

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蛋白激酶C-δ特異性脫氧核酶對(duì)HepG2細(xì)胞生長的影響

魏卓1，羅速2*

(1.吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春130021；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林132013)

蛋白激酶C(PKC)存在于細(xì)胞漿內(nèi)，是一類由鈣激活的磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與神經(jīng)傳導(dǎo)、腫瘤生長及細(xì)胞生長、分化和凋亡等生理病理過程密切相關(guān)。依據(jù)對(duì)二酰基甘油(DAG)和Ca2+的依賴不同，PKC可以分為傳統(tǒng)型(cPKC)、新型PKC(nPKC)和非典型PKC(aPKC)[1-3]三類。蛋白激酶C-δ(PKC-δ)屬于nPKC，其激活物是DAG而并非是Ca2+；PKC-δ被激活后可轉(zhuǎn)移至線粒體或細(xì)胞膜上，活化并切割半胱天冬酶3(caspase-3)后釋放出活性片段，進(jìn)而使多種底物蛋白磷酸化，使其活化或者失活從而引起細(xì)胞凋亡[3-8]。PKC-δ對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控具有促凋亡和抗凋亡的雙重性。因此，PKC-δ的異常表達(dá)或者激活與多種生命現(xiàn)象密切相關(guān)，尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡有著非常重要的意義[9]。

脫氧核酶(deoxyribozymes,DRz)是一種新型的基因治療方法，尤其是10-23型DNAzyme，幾乎可以特異性地結(jié)合任何靶向RNA[10]，切割位點(diǎn)序列要求非常簡單，即嘌呤-嘧啶結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定[11-16]。10-23型脫氧核酶結(jié)構(gòu)包括底物結(jié)合臂和催化序列兩部分，其活性中心由15個(gè)脫氧核糖核酸組成，活性中心兩側(cè)各有約7-9個(gè)核苷酸的底物結(jié)合臂，底物結(jié)合臂通過Watson2 Crick配對(duì)與底物結(jié)合后進(jìn)行底物的定點(diǎn)切割[17-20]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了針對(duì)PKC-δ mRNA的10-23DNAzyme，并對(duì)其兩端進(jìn)行硫代化修飾，利用RT-PCR方法擴(kuò)增PKC-δ的cDNA片段后，將其克隆到pcDNA3.1(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒，篩選陽性重組質(zhì)粒后使用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄獲得PKC-δ mRNA表達(dá)載體，MTT法檢測DRz,DRz-s,和asON 對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞的生長影響。

1材料與方法

1.1材料

HepG2.2.15肝癌細(xì)胞由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心提供，JM109感受態(tài)細(xì)胞。T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自provmega，USA；RT-PCR 試劑盒、MTT試劑、DNA片段純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒等試劑均購自大連寶生物公司。 MEM培養(yǎng)基是Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1PKC-δ mRNA表達(dá)載體的構(gòu)建HepG2.2.15肝癌細(xì)胞以含10%胎牛血清(FBS,Gibco)的DMEM(Invitrogen,USA)培養(yǎng)液于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱(Nuaire,USA)中培養(yǎng)。Trizol法(Invitrogen,USA)提取細(xì)胞中的總RNA，RT-PCR擴(kuò)增PKC-δ基因，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠，于凝膠成像系統(tǒng)中分析、保存圖像后將產(chǎn)物純化并鑒定。用primer5.0軟件設(shè)計(jì)由上海生工合成表1引物，上游和下游分別加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

表1　引物基因序列

將RT-PCR擴(kuò)增出的PKC-δ cDNA片段，經(jīng)雙酶切后定向克隆入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的多克隆區(qū)T7啟動(dòng)子的下游。EcoRⅠ單酶切線性化PKC-δ重組質(zhì)粒，T7RNA聚合酶以T7為啟動(dòng)子、以線性化PKC-δ重組質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄出PKC-δ單鏈RNA(Invitrogen)。

1.2.2無細(xì)胞切割體系DRz對(duì)PKC-δ mRNA的催化切割效應(yīng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染DRz、DRz-s、asON由上海生工合成，達(dá)到PAGE級(jí)純化標(biāo)準(zhǔn)。基因序列如表2所示。

表2　PKC-δ特異性脫氧核酶基因序列

下劃線部分為10-23型脫氧核酶的活性中心。

PKC-δ mRNA和脫氧核酶酶切反應(yīng)后，7M尿素10%變性聚丙烯酰胺凝膠，凝膠成像系統(tǒng)觀察、保存、分析圖像。取生長狀態(tài)好、處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞，進(jìn)行DRz 、DRz-s、asON轉(zhuǎn)染，提取總RNA，RT-PCR半定量檢測HepG2.2.15細(xì)胞中PKC-δmRNA表達(dá)水平。MTT法觀察脫氧核酶對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的生長影響，96孔板上方為空白調(diào)零，設(shè)立陰性對(duì)照、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照、DRz、DRz-s、asON，共6組，每組10個(gè)孔。

2結(jié)果

2.1PKC-δ mRNA表達(dá)載體檢測

總RNA的質(zhì)量直接關(guān)系到RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)提取的總RNA的結(jié)果顯示如圖1(A)所示，光密度比值A(chǔ)260/280達(dá)1.814；瓊脂糖凝膠電泳28S、18S、5S條帶清晰，因此可作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物獲得成功，實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰可見，PKC-δ的RT-PCR電泳結(jié)果如圖1(B)所示。PKC-δ cDNA片段大小為228 bp，條帶大小正確，無非特異性條帶，可用于基因克隆。重組質(zhì)粒的紫外分光光度計(jì)測pcDNA3.1(+)-PKC-δ：A260/A280=1.868。pcDNA3.1(+)-PKC-δ經(jīng)過量的EcoRⅠ單酶切后，如圖1(C)所示，電泳結(jié)果顯示酶切完全，以重組質(zhì)粒為模板應(yīng)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增插入載體的PKC-δ基因片段與擴(kuò)增獲得的片段大小相同。重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果與理論序列一致，片段大小正確，可見PKC-δ重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，PKC-δ基因序列準(zhǔn)確無誤。

2.2脫氧核酶體外切割效應(yīng)及對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞生長的影響

實(shí)驗(yàn)將脫氧核酶對(duì)PKC-δ的特異性切割作用進(jìn)行了檢測。利用RT-PCR檢測PKC-δ表達(dá)，DRz、DRz-s、asON對(duì)照組對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞PKC-δ mRNA的影響,可知轉(zhuǎn)染后DRz 、DRz-s能有效降低細(xì)胞內(nèi)的PKC-δmRNA表達(dá)，且DRz-s作用稍強(qiáng)，而asON沒有降低細(xì)胞內(nèi)的PKC-δ mRNA表達(dá)的作用。

圖1　(A)總RNA電泳結(jié)果;(B)RT-PCR PKC-δ cDNA片段；(C)條帶1，pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒3,pcDNA3.1(+) 和 PKC-δ.重組質(zhì)粒4,EcoR I.重組質(zhì)粒.

MTT法測定細(xì)胞的生長狀態(tài)，如圖2所示。不同試劑轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間細(xì)胞的生長狀態(tài)?？梢钥闯鲛D(zhuǎn)染48 h內(nèi)：陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組細(xì)胞生長緩慢，無明顯變化；DRz、DRz-s、asON試劑組較陰性對(duì)照組細(xì)胞生長旺盛，與asON組相似；DRz和DRz-s組細(xì)胞生長速度明顯加快，細(xì)胞數(shù)量較多，狀態(tài)較好，DRz-s組細(xì)胞生長略快。48 h后，陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑和asON組細(xì)胞仍然緩慢生長，而DRz和DRz-s組細(xì)胞生長速度明顯下降。轉(zhuǎn)染96 h后，各組細(xì)胞生長速度幾乎相同。

圖2　培養(yǎng) HepG2.2.15細(xì)胞與DRz,DRz-s and asON不同

3討論

脫氧核酶對(duì)底物RNA的催化活性取決于脫氧核酶的設(shè)計(jì)，DRz、DRz-s具有催化切割底物RNA的特異作用。分析原因其GC含量適宜，結(jié)合臂9nt屬于催化效率最強(qiáng)的長度，且處于易于被脫氧核酶接近的位置，能與PKC-δ上的DNA位點(diǎn)發(fā)生特異性的結(jié)合，通過競爭作用而阻礙基因啟動(dòng)區(qū)上位點(diǎn)的結(jié)合，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中阻斷PKC-δ的活化，阻滯進(jìn)一步信號(hào)傳導(dǎo)過程，使抑癌基因表達(dá)受到抑制。對(duì)DRz 5′和3′端的兩個(gè)磷酸二酯鍵進(jìn)行硫代修飾形成DRz-s，在一定程度上穩(wěn)定性提高而又能保持DRz的大部分剪切活性。為了證明DRz對(duì)PKC-δ表達(dá)的抑制效應(yīng)并非完全源自其識(shí)別序列的反義效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了與DRz底物識(shí)別序列一致的反義寡聚核苷酸asON作為對(duì)照。結(jié)果顯示asON無催化切割作用。這表明基因表達(dá)的阻斷效應(yīng)不是以其識(shí)別序列的反義效應(yīng)所致，而是由于DRz對(duì)底物PKC-δ RNA的特異性切割所致。

DRz、DRz-s均能有效降低HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)PKC-δmRNA表達(dá)，且DRz-s作用更強(qiáng)，說明硫代修飾后的DRz-s能提高抗核酸酶降解的能力，所以具有更高的切割作用。asON作用遠(yuǎn)不及DRz、DRz-s，說明其有封閉作用但無切割效果。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脫氧核酶抑制PKC-δ基因表達(dá)呈現(xiàn)時(shí)間依賴趨勢。當(dāng)PKC-δ基因的表達(dá)受到抑制后，其抑癌活性消失，癌細(xì)胞生長旺盛，但是脫氧核酶對(duì)PKC-δ基因的表達(dá)抑制作用并不是持續(xù)不變的。隨著時(shí)間的延長，這種抑制作用逐漸減弱。

本實(shí)驗(yàn)DRz特異性地切割PKC-δ后，PKC-δ表達(dá)受到抑制，其活性消失(包含去磷酸化作用)，不能發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能，肝癌細(xì)胞則加速生長。說明作為PKC家族重要成員的PKC-δ在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要的調(diào)控作用。可能成為肝癌基因替代治療的藥物，具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

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(收稿日期：2015-06-19)

作者簡介：魏卓，女，吉林省長春市人，碩士研究生，中級(jí)檢驗(yàn)師。羅速，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，北華大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室。

文章編號(hào)：1007-4287(2016)01-0028-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生計(jì)生青年科研課題(2014Q009)