MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔蘚中的表達(dá)及相關(guān)性研究

劉長(zhǎng)歡，金　玲，丁麗娜，陳英新

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院VIP綜合科室，吉林 長(zhǎng)春130021)

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MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔蘚中的表達(dá)及相關(guān)性研究

劉長(zhǎng)歡，金玲，丁麗娜，陳英新*

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院VIP綜合科室，吉林 長(zhǎng)春130021)

摘要：目的檢測(cè)MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔蘚中的表達(dá)情況，探討兩者在扁平苔蘚發(fā)病機(jī)制中的作用及相關(guān)性。方法采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)MMP-9和Fascin蛋白在35例口腔正常黏膜組織、45例口腔扁平苔蘚和46例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)。應(yīng)用SPPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析。結(jié)果MMP-9在口腔正常黏膜組織、口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)依次增高，表達(dá)率分別為11.4%(4/35)、66.7%(30/45)、89.1%(41/46)，組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Fascin在口腔正常黏膜組織、口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)率依次增高表達(dá)率分別為0%(0/35)、15.6%(7/45)、69.6%(32/46)，組間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且MMP-9和Fascin蛋白在扁平苔蘚中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.427,P<0.05)。結(jié)論MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔蘚癌變的進(jìn)展過程中起著重要作用，兩者之間起相互協(xié)同促進(jìn)的作用。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0011)

口扁平苔蘚(lichen planus，LP)是一種伴有慢性淺表性炎癥的黏膜角化異常性疾病，具有一定惡變潛能，其惡變率約為0.39%-3.02%[1]。研究表明[2,3]，在多種惡性腫瘤疾病中，F(xiàn)ascin蛋白和MMP-9均發(fā)揮重要作用，但目前尚缺乏兩者在OLP中表達(dá)及相關(guān)性的報(bào)導(dǎo)。本課題通過用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)口腔正常黏膜組織、口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP-9和Fascin蛋白的表達(dá)，探討MMP-9和Fascin蛋白的表達(dá)及相關(guān)性在口腔扁平苔蘚發(fā)病中所起的作用。

1材料和方法

1.1標(biāo)本來源

選取吉林大學(xué)口腔醫(yī)院VIP綜合科和口腔頜面外科 2011—2014年經(jīng)病理科確診的活檢標(biāo)本，其中45例OLP組織，46例口腔鱗癌組織，35例正常組織來源于口腔頜面外科及急診科外傷，把甲醛溶液固定后的黏膜組織進(jìn)行石蠟包埋、固定制成石蠟片，以便進(jìn)行免疫組化染色，切片風(fēng)化后在顯微鏡下觀察。

1.2主要試劑

兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9多克隆抗體，小鼠抗人Fascin蛋白單克隆抗體，pv-6000 山羊抗兔小鼠IgGHRP聚合物，TrisEDTA修復(fù)液(pH8.0)，DAB kit(20x二管)，過氧化物封閉液均購(gòu)于中杉金橋試劑公司。

1.3主要設(shè)備

石蠟切片機(jī) (德國(guó) LEICA)、組織包埋機(jī)( 日本OLYMPUS)、光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)

1.4實(shí)驗(yàn)方法及步驟

采用免疫組化方法。石蠟塊連續(xù)切片，厚度為2.5 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蒸餾水沖洗；將切片放入Tris/EDTA修復(fù)液(pH8.0)中，高溫高壓修復(fù)，冷卻至室溫，PBS沖洗；3%H2O2室溫下孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗；滴加一滴一抗(小鼠抗人Fascin蛋白單克隆抗體為成品液；兔抗人基質(zhì)蛋白酶9多克隆抗體1∶200稀釋)在濕盒中孵育1個(gè) h;PBS液沖洗;滴加一滴pv-6000 山羊抗兔小鼠IgGHRP聚合物，室溫孵育30 min；PBS液沖洗；DAB顯色(A,B液1∶20混勻)；顯微鏡下觀察5-7 min；蘇木精復(fù)染；返藍(lán)；梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠固封，光學(xué)顯微鏡觀察并攝片，測(cè)定陽性細(xì)胞數(shù)。用已知的MMP-9和Fascin蛋白陽性的口腔鱗癌標(biāo)本作為陽性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5結(jié)果評(píng)定

評(píng)分法 每張切片由2名病理科醫(yī)師在顯微鏡下獨(dú)立雙盲觀察結(jié)果，染色陽性以細(xì)胞漿或胞膜呈現(xiàn)棕黃或棕褐色為標(biāo)準(zhǔn)，按半定量方法判定其表達(dá)強(qiáng)度。根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度分為：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)400倍視野計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和陽性表達(dá)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，得出細(xì)胞表達(dá)百分率：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞熟占1%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)結(jié)果相加：0-2分為陰性，≥3分者為MMP-9陽性。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用 SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組陽性率差異比較采用行×列表χ2檢驗(yàn)，α=0.05。

2結(jié)果

MMP-9在正常口腔黏膜大多呈陰性表達(dá)或少量表達(dá)；MMP-9在口腔扁平苔蘚組織主要在上皮細(xì)胞細(xì)胞膜或胞漿中表達(dá),陽性細(xì)胞胞漿或胞膜呈棕黃色或棕褐色;陰性細(xì)胞胞漿、胞膜不著色，胞核呈藍(lán)紫色；MMP-9的陽性細(xì)胞在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)顯著增強(qiáng)，在基底膜附近的腫瘤細(xì)胞和癌巢染色更為顯著，呈棕褐色，癌巢周圍間質(zhì)也有中等程度的染色。MMP-9在口腔正常黏膜、口腔扁平苔蘚、口腔鱗癌中的表達(dá)陽性率分別為 11.4%，66.7%，89.1%，組間差別具有顯著意義(P<0.05)見表1;圖1-3；Fascin蛋白在口腔正常黏膜中不表達(dá)或者少量表達(dá)；在扁平苔蘚Fascin主要定位在上皮基底層具有惡變潛能的基地細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和胞膜中，呈棕黃色染色，且其染色強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組，而在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，主要表達(dá)在癌細(xì)胞的胞漿和胞膜中，尤其在癌巢的浸潤(rùn)邊緣，表達(dá)更為明顯，而鱗狀細(xì)胞珠則為陰性，染色強(qiáng)度明顯高于正常組織和扁平苔蘚，其表達(dá)率分別為0%，15.6%，69.6%，組間差別具有顯著意義(P<0.05),見表2，3；圖4-6。

表1　MMP-9在正?？谇火つぁ⒖谇槐馄教μ\、

注：●口腔扁平苔蘚與正常組織比較；■口腔鱗狀細(xì)胞癌與正常組織比較；▲口腔扁平苔蘚與口腔鱗狀細(xì)胞癌比較

表2　Fascin蛋白在正常口腔黏膜、口腔扁平苔蘚、

注 ：●口腔扁平苔蘚與正常組織比較；■口腔鱗狀細(xì)胞癌與正常組織比較，；▲口腔扁平苔蘚與口腔鱗狀細(xì)胞癌比較

圖1　MMP-9在正常組織中的表達(dá)(SPx400)　　 圖2　MMP-9在扁平苔蘚中的表達(dá)(SPx400)　　圖3　MMP-9在鱗癌中的表達(dá)(SPx400)

圖4　Fascin在正常組織中的表達(dá)(SPx400)　　圖5　Fascin在扁平苔蘚中的表達(dá)(SPx400)　　圖6　Fascin在鱗癌中的表達(dá)(SPx400)

表3　口腔扁平苔蘚中MMP-9和Fascin蛋白表達(dá)的相關(guān)性

注：Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，MMP-9和Fascin蛋白在扁平苔蘚中的表達(dá)相關(guān)系數(shù)r=0.427，P<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

口腔癌的發(fā)病機(jī)理是一個(gè)多步驟、多因素的過程，其中包括從正常黏膜到單純?cè)錾?、異常增生、原位癌最后發(fā)展成浸潤(rùn)癌的一個(gè)連續(xù)的病理過程?？谇槐馄教μ\是臨床上一種常見的口腔黏膜病，已被確切證實(shí)是一種癌前病變，其惡變率約為0.39%-3.02%,對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是細(xì)胞外基質(zhì)降解所必需的鋅離子依賴性內(nèi)源性蛋白酶家族，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要生理性調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠特異性的降解基底膜的成分[4]?；啄ぶ兄饕姆€(wěn)定成分是Ⅳ型膠原，只有Ⅳ型膠原酶能降解IV型膠原成分，破環(huán)基底膜的完整性。MMPs家族中的明膠酶是唯一能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)中IV型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的酶，其中MMP-9發(fā)揮最重要的作用[5]。

MMP-9少量存在于人體正常組織中，主要是惡性細(xì)胞在侵襲過程中分泌或誘導(dǎo)其周邊間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的MMP-9破壞基底膜，基底膜Ⅳ型膠原的降解被認(rèn)為是惡性細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，惡性細(xì)胞除了產(chǎn)生內(nèi)源性MMP-9外，還能利用間質(zhì)細(xì)胞合成MMP-9前體(酶原)，并提供合成新生物上皮細(xì)胞，因此，惡性細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9也與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。大量研究已證實(shí)MMP-9在多種癌癥的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2,7]，本實(shí)驗(yàn)中MMP-9在正常黏膜、扁平苔蘚和鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)逐漸增高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0167)，證明口腔扁平苔蘚具有一定的惡變潛能，MMP-9在扁平苔蘚癌變的過程中發(fā)揮重要作用。

Fascin 蛋白屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族中的一員，自20世紀(jì)70年代Opassiri等[8]從海膽卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)并提純。人類Fascin基因定位于染色體7q22，最早從人類畸胎瘤中克隆，其編碼一種進(jìn)化相對(duì)保守的細(xì)胞骨架蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶邊緣的絲狀偽足、微棘的核心肌動(dòng)蛋白束中[9]。研究表明，F(xiàn)ascin在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，黏附以及細(xì)胞的信息交流中擔(dān)任重要角色[10]。

Fascin在不同類型的細(xì)胞中表達(dá)具有差異性，在一些正常上皮組織來源的細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，而在一些血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)升高[11]近年來研究發(fā)現(xiàn)Fascin蛋白在許多上皮性腫瘤細(xì)胞中也表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)，大量實(shí)驗(yàn)研究表明Fascin蛋白的表達(dá)與腫瘤的分化增殖、細(xì)胞遷移及浸潤(rùn)侵襲密切相關(guān)[3,12]，F(xiàn)ascin蛋白在正常組織、扁平苔蘚和口腔鱗癌中的表達(dá)依次增高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0167)，表明口腔扁平苔蘚具有一定的惡變潛能，F(xiàn)ascin蛋白在扁平苔蘚癌變的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，國(guó)內(nèi)外對(duì)MMP-9和Fascin的研究大多局限在惡性腫瘤，本實(shí)驗(yàn)中MMP-9和Fascin在口腔鱗狀細(xì)胞癌均成陽性表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)結(jié)果一致[7,12]。而對(duì)其在扁平苔蘚等癌前病變中的表達(dá)及相關(guān)性研究鮮有報(bào)道，研究表明MMP-9和Fascin在扁平苔蘚發(fā)展為口腔鱗狀細(xì)胞癌的過程中發(fā)揮重要作用，且發(fā)揮協(xié)同作用(r=0.427,P<0.05),因此以MMP-9和Fascin蛋白為靶點(diǎn)等分子水平治療，可能為扁平苔蘚的治療提供新思路。但兩者在OLP惡變發(fā)生發(fā)展中具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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關(guān)鍵詞：口腔扁平苔蘚；MMP-9 ；Fascin蛋白；免疫組化

Expression and correlation of MMP-9 and Fascin in oral lichen planusLIUChang-huan,JINLing,DINGLi-na,etal.(DepartmentofVIP,StomatologyHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo examine the expression and correlation of MMP-9 and Fascin in oral lichen planus(OLP).MethodsThe expression of MMP-9 and Fascin in 35 cases of normal oral mucosa,45 cases of oral lichen planus and 46 cases of oral squamous cell carcinoma(OSCC) was examined by immunohistochemical technique.The data was analyzed by SPSS,a exact test using software package.Resultsthe expression of MMP-9 in normal oral mucosa,oral lichen planus and oral squamous cell carcinoma rises in turn.The positive rate respectively is 11.4%(4/35)、66.7%(30/45)、89.1%(41/46)，the comparison among groups is statistically significant(P<0.05);The expression of Fascin in normal oral mucosa,oral lichen planus and oral squamous cell carcinoma rises in turn.The positive rate respectively is 0%(0/35)、15.6%(7/45)、69.6%(32/46),the comparison among groups is statistically significant(P<0.05);In oral lichen planus,the expression of MMP-9 is positively correlative with that of Fascin(P<0.05).ConclusionMMP-9 and Fascin not only respectively paly an important role in cancerous progress of oral lichen planus but also the two factor work together to promote the cancerous progress.

Key words:oral lichen planus;MMP-9;Fascin;immunohistochemistry

(收稿日期：2015-03-10)

作者簡(jiǎn)介：劉長(zhǎng)歡(1989-)，男，吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院研究生；陳英新，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：口腔黏膜病。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R446.62

文章編號(hào)：1007-4287(2016)01-0011-04

*通訊作者