連梅顆粒對糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ蛋白表達的影響※

● 米 佳 王秀閣 陳 曦 王國強 朱浩宇 樸春麗

連梅顆粒對糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ蛋白表達的影響※

● 米 佳*王秀閣 陳 曦 王國強 朱浩宇 樸春麗▲

目的：觀察連梅顆粒對自發(fā)性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ蛋白表達的影響。方法：將高脂飼料喂養(yǎng)的雄性SPF級ZDF(Zucker Diabetic Fatty rat)大鼠隨機分為模型組、連梅顆粒組、吡格列酮組，普通飼料喂養(yǎng)的雄性SPF級ZL(Zucker Lean)大鼠為正常對照組，每組各10只。連梅顆粒組按照5.1g·kg-1灌胃給藥，吡格列酮組按照1.07mg·kg-1灌胃給藥，連續(xù)給藥12周。經(jīng)Western blot法檢測各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達水平。結(jié)果：在治療第12周末，模型組、吡格列酮組、連梅顆粒組大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)。連梅顆粒組和吡格列酮組與模型組相比均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，且連梅顆粒組優(yōu)于吡格列酮組(P<0.05)。結(jié)論：連梅顆粒組在一定程度上能抑制糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ蛋白的表達。

連梅顆粒 ZDF大鼠 NF-κB IKKβ 糖尿病

糖尿病是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂綜合征[1]。在我國成人糖尿病人數(shù)已超過9200萬，并且糖尿病前期患者約有1.48億[2]。根據(jù)預(yù)測到2025年患病率將達到5.4%[3]。2013年，全球有510萬人死于糖尿病相關(guān)性疾病，占所有死亡人數(shù)的8.39%，而糖尿病醫(yī)療花費占全球醫(yī)療支出的11%。以糖尿病為代表的慢性疾病已經(jīng)成為導(dǎo)致人口死亡的主要原因，嚴重威脅著人民健康安全。若糖尿病早期及時有效治療，可預(yù)防及延緩并發(fā)癥的發(fā)生，延緩病情進展。胰島素抵抗及胰島功能受損是2型糖尿病(T2DM)發(fā)病的兩個基本環(huán)節(jié)[4]。因此，深入研究能夠改善胰島素抵抗及胰島功能受損的藥物，對于防治糖尿病及其并發(fā)癥具有重要意義。此次動物實驗旨在已有的前期研究基礎(chǔ)上，進一步深入探討連梅顆粒對自發(fā)性糖尿病大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白表達的影響，探討本方治療T2DM的作用機制，為糖尿病的中醫(yī)治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級9周齡雄性ZDF大鼠，體重(244～291)g；SPF級9周齡雄性ZL大鼠，體重(183～220)g，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證：SCXK(京)2014-0003。大鼠在北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗室中飼養(yǎng)，實驗室溫度20～22℃，相對濕度55±5%，12/12小時光照黑暗循環(huán)。適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。

1.1.2 實驗藥物 連梅顆粒，長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院顆粒藥房提供；吡格列酮，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供(批號：國藥準字H20040631)。

1.1.3 實驗試劑 鼠NF-κB單克隆抗體(批號：PW2-3)、兔IKKβ多克隆抗體(批號：PW2-3)、Anti-GAPDH(批號：25007)均購于美國CST公司；蛋白裂解液+苯甲基磺酰氟(批號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0006)均購于上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.4 實驗儀器 調(diào)節(jié)臺式高速低溫離心機(HERAEUS Fresco 17，Thenno Scientific，USA)；溫控震蕩儀(Thenno Scientific，USA)；電泳儀、電泳及電轉(zhuǎn)移裝置(PowerPac Basic，Bio-Rad，USA)；酶標儀(Model 550 Microplate Reader，Bio-Rad ，USA)；凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tanon GIS-1000，上海)。

1.2 動物模型的制作 ZDF大鼠予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予高脂飼料#5008(購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2009-0008，粗脂肪6.5%、粗蛋白23.5%)喂養(yǎng)。大鼠定期行糖耐量實驗，試驗前禁食不禁水15h，剪尾取血用微量血糖儀測空腹血糖后，予30%葡萄糖溶液按2g·kg-1灌胃[5]。糖負荷后分別在0.5h、1h、1.5h和2h剪尾取血，用血糖儀測量血糖。當血糖峰值高于16.7mmol·L-1和/或糖負荷后2h高于11.1mmol·L-1時，可診斷為糖尿病或糖耐量減低，表明造模成功。

1.3 分組及給藥方法 將造模成功的ZDF大鼠30只隨機分為模型組、連梅顆粒組、吡格列酮組3組，每組各10只，10只ZL大鼠為正常對照組。將連梅顆粒和吡格列酮分別配置成混懸液，造模成功后，連梅顆粒使用時按照5.1g·kg-1體重(前期工作已確定的最佳劑量)混懸液灌胃，吡格列酮組按照1.07mg·kg-1體重灌胃，正常對照組和模型組均予等體積蒸餾水灌胃，各組大鼠均連續(xù)灌胃12周，每日1次。用藥治療期間正常對照組大鼠飼以普通飼料，其它組飼以高脂飼料，自由進食、飲水，每周稱重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃劑量。

1.4 標本采集 給藥12周后，將大鼠處死后打開腹腔，迅速取出腹部脂肪組織，把組織剪切成細小的碎片，PMSF與PIPA裂解緩沖液以1∶100的比例加入組織中，渦旋振蕩，冰浴中用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，將勻漿液其置于EP管中，4℃、13000rpm·nim-1離心30分鐘，收集中層清液，用于檢測NF-κB、IKKβ蛋白的表達。

1.5 Western-blot法檢測各組大鼠腹部脂肪組織NF-κB、IKKβ蛋白的表達 Western blot：裂解脂肪細胞并勻漿，離心取上清液，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，取樣品5uL，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，Anti-NF-κB、Anti-IKKβ、Anti-GAPDH抗體稀釋液與膜充分接觸，4℃過夜，TBST中室溫脫色，放入二抗稀釋液，封閉，37℃孵育1h，顯影曝光、洗片，掃描儀掃描電泳調(diào)帶，軟件進行光密度值分析。

2 結(jié)果

在治療第12周末，模型組、吡格列酮組、連梅顆粒組大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)。連梅顆粒組和吡格列酮組與模型組相比均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，說明連梅顆粒和吡格列酮均有降低糖尿病大鼠腹腔脂肪組織NF-κB、IKKβ蛋白表達的作用，且連梅顆粒組優(yōu)于吡格列酮組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 western blot檢測各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、

IKKβ蛋白的表達變化

注：與正常組相比*P<0.01，與模型組相比△P<0.01，△△P<0.05；與吡格列酮組相比，##P<0.05。

圖1 各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達

(A．正常對照組；B．模型組；C．吡格列酮組；D．連梅顆粒組)

3 討論

課題組所在的團隊經(jīng)10余年的臨床和動物實驗研究[6，7]證實，六郁和絡(luò)滯并存是導(dǎo)致肥胖型2型糖尿病的核心病機。六郁是指以肥甘滋膩之品滯脾礙胃(食郁)為先導(dǎo)而形成的氣郁、血郁、熱郁、痰郁、濕郁的病理狀態(tài)；膏、濁、痰、脂、瘀、毒化生，郁滯絡(luò)脈。絡(luò)滯是由六郁交互作用而形成絡(luò)脈郁滯的病理狀態(tài)。連梅顆粒主要由黃連、烏梅、大黃、麥冬、生地、干姜組成。黃連為君，其性大苦大寒，《本草衍義》云：“生物者氣也，成之者味也……氣堅則壯，故苦可以養(yǎng)氣?！薄饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“寒傷形，熱傷氣。”消渴六郁化火，漸耗氣陰，氣因熱而傷，苦可養(yǎng)氣，取黃連苦寒之性以瀉熱，使邪去正安，其氣自復(fù)，故為君藥。臣用烏梅、大黃，烏梅性味酸溫，主收斂生津，與黃連相伍以苦酸制甜；大黃苦寒，助黃連瀉熱，并可除積行瘀。干姜辛溫，辛通入絡(luò)，合黃連辛開苦降以調(diào)暢氣機，使郁滯得除，且可反佐黃連、大黃苦寒之弊，以顧護陽氣；針對消渴陰虛為本的病機特點，以麥冬、生地養(yǎng)陰生津，三藥同為佐使。六藥合用，苦、酸、辛并施，通調(diào)結(jié)合，達到了燥濕瀉壅、養(yǎng)陰清熱、通調(diào)氣機的目的。

實驗結(jié)果表明，與空白對照組相比，糖尿病模型組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白表達量顯著上調(diào)，連梅顆粒組在一定程度上能抑制糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達，這可能是連梅顆粒抑制炎癥信號通路的傳導(dǎo)而發(fā)揮其改善胰島素抵抗治療糖尿病的機制之一。這為我們以后開展中藥復(fù)方有效物質(zhì)的研究提供了思路。

[1]陳艷芬，王春怡，李衛(wèi)民，等.黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠氧化應(yīng)激和NF-KB表達的影響[J].中成藥，2012，34(8)：1428-1432．

[2]中華醫(yī)學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南/2013年版[S].中國糖尿病雜志，2014，22(8)：2-42.

[3]Shaw J E，Sicree R A，Zimmet P Z.Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030[J]. DiabetRes ClinPract，2010，87(1)：4-14.

[4]Lanuza-Masdeu J，Arevalo mI，Vila C，et al. In vivo JNK activation in pancreatic β-cells leads to glucose intolerance caused by insulin resistance in pancreas[J].Diabetes，2013，Jan 24.Epub ahead of print.

[5]Pick A，Clark J，Kubstrup C，et al．Role of apoptosis in failure of beta-cell mass compensation for insulin resistance and beta-cell defects in the male Zucker diabetic fatty rat [J]．Diabetes，1998，47(3)：358-64.

[6]王淑俊，樸春麗，劉禹辛.苦酸通調(diào)I號方治療肥胖型2型糖尿病40例臨床觀察[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2009，22(4)：221-222.

[7]樸春麗，鄧 悅，米 佳.苦酸通調(diào)法抑制糖尿病脂肪組織炎癥機制的理論探討[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2009，22(3)：146-148.

吉林省教育廳課題(No.吉教科合字2012第65號)

米佳，女，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥治療內(nèi)分泌及其代謝病的研究。

▲通訊作者 樸春麗，女，教授，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥治療內(nèi)分泌及其代謝病的研究。E-mail：pcl2013@sina.cn

長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(130021)