水稻品種(系)種子休眠特性評價

王麗萍，田 偉，姜孝成*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙 410081；2.廣西亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001)

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水稻品種(系)種子休眠特性評價

王麗萍1，2，田 偉1，姜孝成1*

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南長沙 410081；2.廣西亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001)

鳴謝感謝陳良碧教授在該研究工作中提供的寶貴建議和幫助；感謝湖南師范大學(xué)植物發(fā)育與分子生物學(xué)所有老師和同學(xué)的幫助。

種子休眠是植物經(jīng)過長期演化而獲得的一種適應(yīng)環(huán)境變化的生物學(xué)特性，具有重要的生物學(xué)意義[1]。水稻種子的休眠特性是一個重要的農(nóng)藝性狀，與種子質(zhì)量直接相關(guān)[2]。目前，我國南方地區(qū)水稻在成熟收獲季節(jié)，若遇高溫陰雨天氣，容易出現(xiàn)穗發(fā)芽現(xiàn)象[3]，從而降低稻米品質(zhì)和種子質(zhì)量。在水稻育種實踐中，種子萌發(fā)整齊、發(fā)芽勢高往往是一個重要的目的性狀；如果水稻種子具有較強的休眠特性，將導(dǎo)致種子在萌發(fā)處理時難以出苗或出苗率很低，也不利于通過萌發(fā)試驗進(jìn)行種子純度鑒定和質(zhì)量檢測，從而影響種子的銷售經(jīng)營。因此，人為選育快速整齊發(fā)芽的水稻品種可能是導(dǎo)致水稻種子休眠特性喪失的重要原因。此外，雜交水稻制種過程中，大劑量施用“920”(赤霉素)也可能對解除水稻種子休眠有促進(jìn)作用[4]。為解決穗萌問題、提高種子質(zhì)量，篩選和培育在成熟收獲時具一定休眠特性、在播種時休眠解除而能正常萌發(fā)的水稻品種，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種子經(jīng)營具有重要意義。

曹雅君等[5]對13 個水稻主栽品種的種子進(jìn)行休眠特性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種間的萌發(fā)率存在顯著差異。孫君亮等[6]研究發(fā)現(xiàn)培矮64S 種子屬于深度休眠類型，在海南春繁和湖南夏繁兩地收獲種子的休眠期分別為105和77 d。培兩優(yōu)500 和培兩優(yōu)288 種子的休眠期與母本培矮64S 種子差別不大。蔣家月等[7]研究發(fā)現(xiàn)光溫敏核不育系新安S種子具有深度休眠特性，休眠期在47～62 d。石瑜敏等[4]檢測了3個雜交水稻恢復(fù)系純系的休眠特性，發(fā)現(xiàn)不同材料種子在同一年份同一收獲季節(jié)的休眠特性不同；同一材料的種子休眠期在同一年份不同收獲季節(jié)間存在差異，且同一材料的種子休眠特性在不同年度間也不同。對種子休眠的分子機制研究表明，RNA干涉水稻OsVP1的表達(dá)能夠顯著提高種子的萌發(fā)速率，從而導(dǎo)致穗發(fā)芽[8]。目前對生產(chǎn)上廣為應(yīng)用的不育系品種的休眠特性尚缺乏總體認(rèn)識，對野生稻種子的休眠特性及其可開發(fā)潛力尚未見報道，OsVP1等休眠相關(guān)基因的表達(dá)是否與水稻品種(系)種子的休眠程度存在相關(guān)性尚不得而知。筆者以茶陵野生稻種子為對照，對目前生產(chǎn)上普遍使用的不育系品種、湖南師范大學(xué)植物發(fā)育與分子生物學(xué)實驗室選育的眾多水稻新資源品系的休眠特性進(jìn)行評價，并對休眠相關(guān)基因OsVP1、Sdr-4和TRAB1在不同休眠程度的不同水稻品系種子中的表達(dá)量進(jìn)行比較，以期為選育具有合適休眠程度的水稻品種、解決穗萌問題提供理論依據(jù)和親本資源，為深入探討種子休眠的分子機制提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料茶陵野生稻種子，采自湖南省茶陵縣堯水鄉(xiāng)愛里村湖里野生稻保護區(qū)；27個光溫敏核不育系水稻品種和699個常規(guī)水稻新資源品系的種子，由湖南師范大學(xué)植物發(fā)育與分子生物學(xué)實驗室栽培或選育。以上種子成熟收獲后，部分種子立即檢測其萌發(fā)能力；其余種子于室內(nèi)實驗臺上自然風(fēng)干后，于室內(nèi)自然通風(fēng)條件下貯藏，每隔30 d進(jìn)行一次萌發(fā)率檢測。

1.2試驗方法

1.2.1休眠特性評價。按國家標(biāo)準(zhǔn)GB3453-95《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》測定萌發(fā)率[9]。選取各供試材料發(fā)育良好、整齊的種子300粒(每個處理100粒種子，3次重復(fù))，在30 ℃蒸餾水中浸泡24 h后，均勻排列于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，加適量蒸餾水以保持濾紙濕潤，加蓋后置于培養(yǎng)箱[(30±1)℃，RH=100%]中，萌發(fā)處理10 d，統(tǒng)計萌發(fā)率。以胚根長度不短于種子長度且胚芽長度不短于種子長度的50%視為種子萌發(fā)。萌發(fā)率=萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。根據(jù)新采收種子萌發(fā)率的高低，將休眠特性分為5種類型：①極強休眠類型，萌發(fā)率≤5%；②強休眠類型，萌發(fā)率為5%～40%；③中度休眠類型，萌發(fā)率為40%～70%；④淺休眠類型，萌發(fā)率為70%～90%；⑤無休眠類型，萌發(fā)率>90%。

1.2.2種子休眠相關(guān)基因的PCR鑒定及其表達(dá)分析。從http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/About/index.html上查詢獲得3個與種子休眠相關(guān)的基因：①種子成熟和休眠所必須的脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子OsVP1；②水稻種子休眠和馴化調(diào)節(jié)子基因Seed dormancy 4(Sdr-4)；③既能與VP1互作也能結(jié)合ABA應(yīng)答元件basic region leucine zipper(bZIP)的轉(zhuǎn)錄因子TRAB1。用熒光定量PCR法[10]檢測它們在休眠程度不同的水稻種子中的表達(dá)差異。所用PCR引物見表1。

表1水稻休眠相關(guān)基因PCR分子鑒定所用的引物

Table 1The primers of dormancy-related genes in rice used in PCR molecular identification

基因名稱Genename正向引物Forwardprimer反向引物ReverseprimerOSVP1CGTTCTTCATGGAGTG-GCTTCTTCTGGAGGTGGTGGTTSdr-4AGGACGAGGACGAG-GAGAGGACGTCGATGTGGACTGACTTRAB1GCTGTCAACAACAGCTC-CATACTCCGGACATCAGCCTATT

極強休眠品系(CR210，X031)、強休眠品系(X069，L025)、淺休眠品系(002，006)和無休眠品系(X019，CR202)種子DNA的提取參照CTAB法[11]，PCR擴增休眠相關(guān)基因及其產(chǎn)物檢測按照常規(guī)方法，20 μL 反應(yīng)體系：10 μL PCR Mix，正、反引物各0.5 μL，DNA模板1 μL(含1 μg)，添加已滅菌的去離子水至終體積20 μL。擴增反應(yīng)在Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler PCR儀上進(jìn)行。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性1 min，55～60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30個循環(huán)；反應(yīng)終止在22 ℃。PCR擴增產(chǎn)物用TBE溶液配制的2%～3%的瓊脂糖凝膠電泳，EB法顯色觀察，拍照。上述材料的RNA提取及休眠相關(guān)基因的表達(dá)分析參照成海蘭[12]的方法，切取待測材料種子的種胚裝入EP管，液氮中速凍30 min后，經(jīng)過樣品處理-相分離-RNA沉淀-RNA溶解幾個步驟獲得總RNA，用紫外分光光度法測定RNA濃度，重復(fù)測定3次；取2 μL樣品進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，評價RNA的純度和完整性。采用染料法(SYBR Green I)對OsVP1、Sdr-4和TRAB1的表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同類型水稻品種(系)休眠特性差異

2.1.1茶陵野生稻種子在貯藏期間的休眠特性變化。由表2可知，剛采收的茶陵野生稻成熟種子具有極強的休眠特性，萌發(fā)處理10 d時萌發(fā)率為0。隨著貯藏時間的延長，其休眠程度逐漸減弱，貯藏90 d后，萌發(fā)處理10 d時，萌發(fā)率可達(dá)46%。野外觀察表明，茶陵野生稻種子成熟后，落在水中，浸泡數(shù)月而不腐爛，次年春天遇到適宜的溫度，在水深不超過5 cm水中可正常發(fā)芽并成苗，但萌發(fā)很不整齊。因此，茶陵野生稻種子的強休眠特性可能與其生態(tài)適應(yīng)性有關(guān)，可為以后培育抗穗萌的水稻新種質(zhì)提供基因源。

表2不同貯藏時間對茶陵野生稻種子萌發(fā)的影響

Table 2Effect of different storage time on seed germination of Chaling wild rice

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2.1.2不同兩用核不育系水稻種子的休眠特性比較。由表3可知，27個水稻兩用核不育系品種中，5個品種(系)具有極強休眠特性(萌發(fā)率≤5%)，占兩用核不育系品種(系)總數(shù)的18.5%，其中4個品種在萌發(fā)處理4 d時未見萌發(fā)；13個品種(系)(占48.2%)具有強休眠特性，萌發(fā)率在7%～40%；7個品種(系)(占26.0%)具有中度休眠特性，萌發(fā)率在41%～70%；光敏不育系S318具有淺休眠特性，萌發(fā)率為71%；有些品種(系)在萌發(fā)處理的第2天開始萌動，但萌發(fā)處理結(jié)束時，其萌發(fā)率都不超過71%，說明這些品種(系)種子個體間的休眠特性存在差異或嚴(yán)重的遺傳分化；總體而言，大部分兩用核不育系水稻品種(系)具有中度偏強的休眠特性。早秈溫敏核不育系株1S幾乎無休眠特性，新鮮成熟種子萌發(fā)處理7 d的萌發(fā)率即達(dá)到最高值93%，在生產(chǎn)上，該品種種子采收后，為保存其種子活力，建議低含水量、低溫條件貯藏。

表3不同類型兩用核不育系水稻種子的休眠特性

Table 3Determination of dormancy characteristics of rice seeds of different dual purpose genic sterile lines

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2.1.3不同水稻資源種子的休眠特性比較。699個水稻資源品系在休眠程度上存在極顯著差異。具體分類見表4。

表4699個水稻資源品系的休眠特性差異

Table 4Differences in dormancy characteristics of 699 rice resources lines

休眠程度Dormancydegree品系數(shù)目Numberoflines∥個典型特征Typicalcharacteristics極強休眠Extremelystrongdormancy20萌發(fā)出現(xiàn)的最短時間不少于5d;萌發(fā)處理10d,萌發(fā)率不高于5%;很少出現(xiàn)種子發(fā)霉腐爛的現(xiàn)象強休眠Strongdormancy73萌發(fā)出現(xiàn)的最短時間不少于5d;萌發(fā)處理10d,萌發(fā)率為5%～40%中度休眠M(jìn)oderatedor-mancy170多數(shù)品系種子在萌發(fā)處理1d后,即開始萌發(fā),但萌發(fā)速率參差不齊;萌發(fā)處理10d時,萌發(fā)率為40%～70%淺休眠Lightdormancy290萌發(fā)行為類似中度休眠類型,萌發(fā)處理10d,萌發(fā)率為70%～90%無休眠Non-dormancy146種子萌發(fā)整齊、時間短,幼苗長勢好;萌發(fā)處理10d,萌發(fā)率為90%～100%;這類品系如種子成熟時遇連續(xù)高溫多雨天氣,極易出現(xiàn)穗萌現(xiàn)象(圖1)

注：A.高溫多雨1 d；B.室內(nèi)保濕處理3 d。Note：A.1 d of high temperature and rainy weather；B.3 d of indoor moisture treatment.圖1　水稻品系YD133的穗萌現(xiàn)象Fig.1　Seed sprouting phenomenon of rice line YD133

699個資源品系中，淺休眠和無休眠類型共436個，占所有供試資源品種(系)的62%。反映了大多數(shù)水稻材料休眠特性偏弱，也間接反映了目前水稻種子在貯藏過程中容易失去活力的原因；但也有20個休眠特性極強的品系，部分是湖南師范大學(xué)植物發(fā)育與分子生物學(xué)實驗室從育種資源品種(系)植株開花期間受野生稻串粉結(jié)實選育而來，可望作為研究和開發(fā)利用野生稻種子休眠基因的材料；同時，可用作親本資源，培育貯藏性能好的水稻新品種。

具休眠特性的水稻種子在自然通風(fēng)貯藏過程中，每隔30 d檢測一次種子的萌發(fā)率，結(jié)果表明，隨著貯藏時間延長，休眠特性越強的品種(系)種子達(dá)到最高萌發(fā)率(皆可達(dá)到90%以上)的貯藏時間也相應(yīng)延長，無休眠特性的品種(系)其種子萌發(fā)率則在貯藏至某一時間后呈下降趨勢，這與水稻種子具一定休眠特性有利于種子貯藏，無休眠種子則在貯藏過程中種子活力下降的生產(chǎn)實際相吻合。

2.2種子休眠相關(guān)基因表達(dá)與休眠特性的關(guān)系OsVP1、Sdr-4和TRAB1是3個已報道的與種子休眠相關(guān)的基因，PCR擴增結(jié)果表明，它們在8個不同休眠特性的水稻品種(系)中都存在(圖2)。

注：M.marker；1(CR210)和2(X031).極強休眠品系；3(X069)和4(L025).強休眠品系；5(002)和6(006).淺休眠品系；7(CR202)和8(X109).無休眠品系。Note：M.marker；1(CR210)and 2(X031).Lines with extremely strong dormancy；3(X069)and 4(L025).Lines with strong dormancy；5(002)and 6(006).Lines with light dormancy；7(CR202)and 8(X109).Non-dormancy lines.圖2　不同休眠特性水稻品系中OsVP1、Sdr-4和TRAB 1的PCR擴增結(jié)果Fig.2　PCR amplification results of OsVP1，Sdr-4 and TRAB 1 in rice lines with discrepant dormancy characteristics

Real-time PCR分析結(jié)果(圖3)表明，OsVP1、Sdr-4、TRAB1的表達(dá)在水稻品系間存在明顯差異，但并不與休眠特性的強弱成比例。OsVP1在強休眠特性品系X069中的表達(dá)量是極強休眠特性品系CR210的3倍多；Sdr-4在休眠特性相差不大的002品系和006品系中基因表達(dá)量差異較大，而在強休眠特性的L025和無休眠特性的X019中表達(dá)量幾乎無差異；在具不同休眠特性的水稻品系中，TRAB1的表達(dá)量有差異，但在休眠程度相近的品系間也有差異。

注：CR210和X031.極強休眠品系；X069和L025.強休眠品系；002和006.淺休眠品系；X019和CR202.無休眠品系。Note：CR210 and X031.Lines with extremely strong dormancy；X069 and L025.Lines with strong dormancy；002 and 006.Lines with light dormancy；X 019 and CR202.Non-dormancy lines.圖3　OsVP1、Sdr-4和TRAB1基因在不同特性水稻品系種子中的相對表達(dá)量Fig.3　Relative expression of OsVP1，Sdr-4 and TRAB1 in seeds of rice lines with discrepant dormancy characteristics

3結(jié)論與討論

通過對茶陵野生稻、27個兩用核不育系和699個資源品種(系)共727個水稻材料休眠特性的評價結(jié)果表明，水稻品種(系)的休眠特性存在明顯差異。其中，茶陵野生稻、5個兩用核不育系水稻和20個水稻資源品系具有極強的休眠特性，其新采收成熟種子的萌發(fā)率在0～5%，它們可望成為研究和開發(fā)利用水稻種子休眠基因的材料，培育貯藏性能好的水稻新品種。除株1S種子幾乎無休眠外，其他兩用核不育品種的種子皆表現(xiàn)出一定程度的休眠，這是保證種子貯藏質(zhì)量的有利性狀。另一方面，在699個資源品系中，淺休眠和無休眠類型共436個，占所有供試品種(系)的62.4%，反映了在水稻新品種選育過程中，新種質(zhì)的休眠特性偏弱或容易喪失，田間觀察發(fā)現(xiàn)其中有些品系容易出現(xiàn)穗發(fā)芽現(xiàn)象，會嚴(yán)重影響稻米品質(zhì)和種子質(zhì)量，也是目前水稻種子在貯藏過程中容易失去活力的重要原因。

在該研究中，剛采收的茶陵野生稻成熟種子具有極強的休眠特性，萌發(fā)率為0。而劉貴華等[13]研究表明，剛采收的茶陵野生稻種子(1997年10月22日采于庵家山普通野生稻保護地)萌發(fā)處理14 d后的萌發(fā)率為11%，造成這種差異的原因可能與茶陵野生稻種子生長發(fā)育所處的不同生態(tài)、氣候、地理環(huán)境或萌發(fā)處理條件等有關(guān)。孫君亮等[6]研究表明，海南和湖南兩地生產(chǎn)的培矮64S種子，在海南3月中旬成熟，初始萌發(fā)率低于10%；在湖南8月中旬成熟，初始萌發(fā)率達(dá)50%以上；該研究的培矮64S種子是9月下旬在湖南成熟采收的，萌發(fā)率為70%。這一現(xiàn)象為通過異地栽培制種的方式有效調(diào)控水稻種子的休眠特性提供了參考。此外，兩用核不育系和水稻資源品種(系)種子表現(xiàn)出休眠特性強弱不同的連續(xù)變化類型。表明水稻種子的休眠特性存在多樣性，從中選育適度休眠特性的優(yōu)良品種是切實可行的。

研究表明，轉(zhuǎn)錄因子viviparous1(VP1)在種子成熟和休眠過程中脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用，它通過激活脅迫激素ABA應(yīng)答基因來調(diào)控植物種子的成熟和休眠[14]。Fan等[15]在研究水稻同源基因OsVP1時發(fā)現(xiàn)，在岡46B 和黑B 水稻這2種極易發(fā)生穗萌的品系中，OsVP1的大部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物常出現(xiàn)錯誤剪接加工；然而，在抗穗萌的品種輻恢838 和Lemont中，只有小部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會出現(xiàn)此種情況，因此推測水稻穗萌可能是OsVP1基因功能喪失造成的。Seed dormancy 4(Sdr-4)是一個水稻種子休眠和馴化調(diào)節(jié)子基因，有防止水稻kasalath種子穗萌而保持深度休眠的作用，導(dǎo)致種子萌發(fā)率下降[16]。TRAB1是結(jié)合ABA應(yīng)答元件，且與VP1互作的轉(zhuǎn)錄因子，其本身的轉(zhuǎn)錄依賴于VP1和ABA誘導(dǎo)，從而控制植物胚胎的成熟和休眠[17]。該研究對這3個已報道的與種子休眠相關(guān)的基因OsVP1、Sdr-4、TRAB1在8個不同休眠特性水稻品系中的表達(dá)變化進(jìn)行了Real-time PCR分析，結(jié)果表明它們在具有不同休眠特性的水稻品種種子中的表達(dá)存在明顯差異，但不與種子的休眠特性強弱呈線性關(guān)系。

該研究結(jié)果表明，種子休眠可能存在物種或個體特異性，而且與種子生長發(fā)育所處的生態(tài)、氣候等環(huán)境因素有關(guān)，在不育系新品種選育和種子生產(chǎn)過程中應(yīng)引起重視；種子休眠的分子機制可能相當(dāng)復(fù)雜，OsVP1、Sdr-4、TRAB1等單一基因可能只在某一品種或個體中起關(guān)鍵調(diào)控作用；要揭示種子休眠的普遍機制，可能涉及一個由遺傳和生態(tài)、氣候等環(huán)境因素協(xié)同作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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摘要[目的]評價水稻品種(系)種子休眠特性，為選育具有合適休眠程度的水稻品種、解決穗萌問題提供理論依據(jù)和親本資源。[方法]通過萌發(fā)試驗對不同類型水稻品種或品系新鮮種子的休眠特性進(jìn)行評價，并通過熒光定量PCR檢測種子休眠相關(guān)基因OsVP1、Sdr-4和TRAB1在休眠程度不同的水稻種子中的表達(dá)差異。[結(jié)果]不同類型水稻品種(系)的休眠特性存在明顯差異，新采收的茶陵野生稻種子不能萌發(fā)，18.5%的兩用核不育系水稻品種(系)的種子萌發(fā)率不高于5.0%，13.3%的資源品系的種子萌發(fā)率不高于40.0%；OsVP1、Sdr-4和TRAB1普遍存在于不同水稻品種(系)中，且表達(dá)量差異明顯，但不與休眠程度成比例。[結(jié)論]水稻種子休眠特性可通過品種改良失去或重新獲得。

關(guān)鍵詞水稻種子；休眠；OsVP1;Sdr-4;TRAB1

Evaluation of Seed Dormancy of Various Rice Varieties (Lines)

WANG Li-ping1,2, TIAN Wei1, JIANG Xiao-cheng1*(1. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha, Hunan 410081; 2. Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning, Guangxi 530001)

Abstract[Objective] To evaluate seed dormancy of various rice varieties(lines), and provide theoretical basis and parent resources for breeding of rice varieties with suitable degree of dormancy and solving the problem of spike sprouting. [Method] By means of germination test, the dormancy of fresh mature seeds of different types of rice varieties or lines were evaluated. Meanwhile, by fluorescence quantitative PCR method, the expression of seed dormancy-related genesOsVP1,Sdr-4 andTRAB1 were measured in seeds of different rice varieties or lines. [Result] Seeds of different rice varieties or lines exhibited remarkable difference in dormancy degree, fresh matured seeds of chaling wild rice did not exhibit germinability, the germination percentage of seeds of 18.5% dual-purpose genic male sterile lines was not more than 5.0%, the germination percentage of seeds of 13.3% resource lines for rice breeding was less or equal to 40.0%;OsVP1,Sdr-4 andTRAB1 were widely identified and showed significant difference in expression in various types of rice seeds, but did not exhibit linear relationship with dormancy degree. [Conclusion] Seed dormancy of rice varieties can be regained or weakened by breed improvement.

Key wordsRice seed; Dormancy;OsVP1;Sdr-4;TRAB1

收稿日期2015-12-07

作者簡介王麗萍(1986- )，女，廣西藤縣人，實習(xí)研究員，碩士，從事植物發(fā)育與分子生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，從事種子生物學(xué)研究。

基金項目湖南省生態(tài)學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目((0713))；湖南省高校生物發(fā)育與新產(chǎn)品開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項目。

中圖分類號S 330.3+3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)01-226-04