家蠶生物反應(yīng)器共表達(dá)豬α+γ干擾素的生產(chǎn)研究

丁 農(nóng)， 張金衛(wèi)， 李江濤， 魚(yú)南洋， 馮世民， 沈建華， 徐森華

(湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000)

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家蠶生物反應(yīng)器共表達(dá)豬α+γ干擾素的生產(chǎn)研究

丁 農(nóng)， 張金衛(wèi)， 李江濤， 魚(yú)南洋， 馮世民， 沈建華， 徐森華

(湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000)

近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，家蠶生物反應(yīng)器(家蠶BmNPV桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng))生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物活性物質(zhì)的良好特性被生物學(xué)家所認(rèn)識(shí)，許多基因工程產(chǎn)品通過(guò)家蠶這一優(yōu)良生物反應(yīng)器得到表達(dá)，家蠶生物反應(yīng)器成為免疫學(xué)和基因工程真核生物表達(dá)系統(tǒng)等研究領(lǐng)域的重大進(jìn)展之一[1]。采用家蠶生物反應(yīng)器技術(shù)成功地表達(dá)了乙肝表面抗原的M蛋白基因[2]、丙肝病毒核心蛋白[3]、類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1[4]、禽馬立克氏病毒糖蛋白B抗原[5]、口蹄疫疫苗抗原[6-7]等產(chǎn)品，其中有的已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

干擾素(Interferon,IFN)是人和動(dòng)物細(xì)胞受到特定干擾素誘生劑刺激后，由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的一種具有多種生物學(xué)活性的糖蛋白。干擾素具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫增強(qiáng)等多種生物活性，具備無(wú)休藥期、無(wú)藥殘、無(wú)毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性、可反復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，為目前最理想的一種抗病毒生物制劑。干擾素IFN-α和干擾素IFN-γ聯(lián)合使用具有協(xié)同作用，比單獨(dú)使用其中一種具有更強(qiáng)的抗病毒效果[8-9]。因此，利用基因工程技術(shù)制備含有豬干擾素α和豬干擾素γ的復(fù)合型干擾素對(duì)防治豬的病毒性疾病具有重要意義。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所成功研究出豬的α干擾素基因和γ干擾素基因重組家蠶桿狀病毒共表達(dá)載體rBmNPV(BmIFN-α+γ)，并取得了發(fā)明專(zhuān)利，可以將豬α干擾素基因和γ干擾素基因在家蠶桿狀病毒生物反應(yīng)器中聯(lián)合表達(dá)或共表達(dá)，所表達(dá)的重組α干擾素產(chǎn)物和重組γ干擾素之間具有協(xié)同增效作用，能夠提高重組干擾素產(chǎn)物的效價(jià)及穩(wěn)定性[10-11]。筆者采用該共表達(dá)載體，研究以家蠶為生物反應(yīng)器規(guī)?；脖磉_(dá)豬α+γ干擾素的生產(chǎn)應(yīng)用中存在的相關(guān)技術(shù)問(wèn)題，以期為家蠶生物反應(yīng)器規(guī)?；脖磉_(dá)豬α+γ干擾素生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 rBmNPV(BmIFN-α+γ)重組病毒培養(yǎng)液由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩＆粮蓴_素ELISA檢測(cè)試劑盒由德國(guó)IBL公司生產(chǎn)，上海將來(lái)實(shí)業(yè)有限公司提供；試驗(yàn)用蠶品種由湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保存飼養(yǎng)，規(guī)?；a(chǎn)試驗(yàn)用蠶繭由安吉縣良棚鎮(zhèn)黃金村和南潯區(qū)菱湖鎮(zhèn)射中村分別生產(chǎn)提供，酶標(biāo)儀和10萬(wàn)級(jí)無(wú)菌凈化車(chē)間等儀器設(shè)備由湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1共表達(dá)干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的接種注射。蠶蛹接種注射前剔除壞死、敗血和蠅蛆等不健康蠶蛹，然后用0.3%的次氯酸鈣進(jìn)行蛹體浸漬消毒涼干；rBmNPV(BmIFN-α+γ)重組病毒按105pfu /頭(5 μl/頭)接種蠶蛹，置于25～26 ℃下表達(dá)4.5 d，收集發(fā)病蠶蛹，于-20 ℃冷凍保存供檢測(cè)。

1.2.2共表達(dá)干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達(dá)量的檢測(cè)。采用α干擾素ELISA檢測(cè)試劑盒，以IFN-α表達(dá)量來(lái)說(shuō)明IFN-α+γ的表達(dá)量。按雌雄1∶1的比例隨機(jī)抽取20頭蠶蛹，勻漿機(jī)研磨蛹體，離心取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。其原理：應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定樣本中豬IFN-α的水平。用純化的豬IFN-α抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入IFN-α，再與HRP標(biāo)記的IFN-α抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IFN-α呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中豬IFN-α含量。

1.2.3共表達(dá)干擾素(BmIFN-α+γ)規(guī)?；a(chǎn)用蠶品種的選擇。選擇湖州市農(nóng)村推廣應(yīng)用的春用多絲量品種菁松×皓月(正反交)和夏秋用中絲量秋豐×白玉(正反交)進(jìn)行豬rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達(dá)量的測(cè)試，以選擇規(guī)?；瘧?yīng)用的農(nóng)村推廣品種，采用表達(dá)量高的品種作為規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用品種。

1.2.4手工接種與機(jī)械接種對(duì)干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達(dá)效率的影響。采用湖洲市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生產(chǎn)的專(zhuān)利產(chǎn)品蠶蛹集團(tuán)注射機(jī)器[12]注射與手工注射進(jìn)行工作效率與產(chǎn)品表達(dá)效率的比較，以了解采用機(jī)械注射生產(chǎn)的可行性和優(yōu)勢(shì)。供試品種為皓月×菁松，注射劑量相同為105pfu /頭(5 μL/頭)，機(jī)器按4人標(biāo)準(zhǔn)配制，其中3人放蛹，1人操作機(jī)器注射，對(duì)照為4人進(jìn)行手工注射蠶蛹，工作時(shí)間定為7.0 h(上午、下午各3.5 h)。

1.2.5蠶蛹注射接種干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)適期的確定。采用皓月×菁松蠶品種從熟蠶上蔟開(kāi)始于25 ℃保護(hù)，在上蔟的第4天起即化蛹的第1～10天每天連續(xù)接種注射200頭健康蛹，注射接種后的蠶蛹于25 ℃保護(hù)7 d，調(diào)查注射蠶蛹的細(xì)菌敗血病死亡率、化蛾率(有變態(tài)形狀不能羽化死亡的也計(jì)入化蛾頭數(shù))及接種成功率。

1.2.6蠶蛹的冷藏對(duì)重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達(dá)量的影響。將供試蠶兒上蔟結(jié)繭后于25 ℃保護(hù)6 d為冷藏起始日，分別于冷柜(4～5 ℃)冷藏5、10和15 d時(shí)將蠶繭削繭取蛹，然后手工注射干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)，檢測(cè)表達(dá)效率，以未經(jīng)冷藏的蠶蛹接種作為對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1共表達(dá)干擾素(BmIFN-α+γ)規(guī)?；a(chǎn)用蠶品種檢測(cè)結(jié)果表明，菁松×皓月、皓月×菁松、秋豐×白玉、白玉×秋豐的IFN表達(dá)量為710.61、805.69、577.49和592.12 ng/L。由此可知，品種間對(duì)重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的表達(dá)效率差異較大，春用品種以皓月×菁松為好，夏秋用品種以白玉×秋豐為好。

2.2手工接種與機(jī)械接種對(duì)干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達(dá)效率的影響對(duì)采用該設(shè)備的生產(chǎn)效率及產(chǎn)品表達(dá)量與手工注射生產(chǎn)方式進(jìn)行了比較。由表1可知，機(jī)器注射共接種蠶蛹16 744顆/(d·人)，手工注射共接種蠶蛹4 102顆/(d·人)，機(jī)械注射接種效率提高了3倍以上，檢測(cè)產(chǎn)品表達(dá)量相差不大，說(shuō)明在保準(zhǔn)產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，機(jī)械注射接種可以大幅度提高工作效率。

表1手工接種與機(jī)械注射對(duì)生產(chǎn)效率及豬干擾素基因(BmIFN-α+γ)表達(dá)量的影響

Table 1Expression comparison of production efficiency and porcine interferon gene (BmIFN-α+γ)

注射接種方式Injectionmethod注射蠶蛹頭數(shù)Numberofinjectedsilkwormchrysalis顆/(d·人)工效指數(shù)EfficiencyindexIFN表達(dá)量IFNexpressionng/L手工注射接種Manualinjection4102100826.09機(jī)械注射接種Mechanicalinjection16744408823.24

2.3重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的蠶蛹注射適期由表2可知，過(guò)早注射因蠶蛹太嫩容易出血，增加細(xì)菌感染機(jī)會(huì)，造成損失，接種成功率低，而過(guò)遲注射蛹體內(nèi)容物已形成各種器官，不利于重組桿狀病毒的繁殖，化蛾率大幅度提高，接種成功率低。從調(diào)查結(jié)果看，在蠶上蔟后25 ℃保護(hù)，第5～9天是注射適期，以第6～8天為最佳，蠶品種不同或蠶繭保護(hù)溫度不同在注射適期上會(huì)略有差異。

表2　重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)的注射適期

2.4蠶蛹的冷藏對(duì)重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達(dá)量的影響由圖1可知，將蠶繭冷藏于4～5 ℃,冷藏5與10 d的表達(dá)量與未經(jīng)冷藏處理蠶蛹的表達(dá)效率差異不大，而冷藏15 d的表達(dá)量顯著下降。因此在規(guī)?；a(chǎn)時(shí)如遇到蠶蛹接種注射速度與勞動(dòng)力緊張的突出矛盾時(shí)，可以將蠶繭冷藏于4～5 ℃ 10 d以?xún)?nèi)，對(duì)重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)在蠶蛹中的表達(dá)效率影響不大，在規(guī)?；a(chǎn)中可以利用冷藏來(lái)延長(zhǎng)蠶蛹接種適期。

圖1　不同時(shí)間冷藏蠶蛹的重組桿狀病毒rBmNPV(IFN-α+γ)表達(dá)量Fig. 1　Expression quantity of recombinant baculovirus rBmNPV(IFN-α+γ) in silkworm chrysalis under different cold storage days

3小結(jié)與討論

該試驗(yàn)采用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研究成果豬的α干擾素基因和γ干擾素基因重組家蠶桿狀病毒共表達(dá)載體rBmNPV(BmIFN-α+γ)，研究利用家蠶(蠶蛹)生物反應(yīng)器進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)的相關(guān)技術(shù)。結(jié)果表明，蠶品種對(duì)豬干擾素基因(IFN-α+γ)的表達(dá)效率差異較大，皓月×菁松的表達(dá)效率高于其他品種，因此選擇高表達(dá)效率的蠶品種是提高生產(chǎn)效率的有效手段。注射接種是一項(xiàng)勞動(dòng)力密集型的工作，且技術(shù)要求高，該試驗(yàn)采用機(jī)器注射平均每天人均注射接種量比手工注射提高了3倍以上，且對(duì)產(chǎn)品表達(dá)量無(wú)影響，該機(jī)械把注射器的消毒、清洗、加藥、蠶蛹接種等步驟在機(jī)械上逐一完成，標(biāo)準(zhǔn)容易制定和控制，有利于規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，提高工作效率和降低生產(chǎn)成本。從該試驗(yàn)結(jié)果看注射接種的最佳時(shí)間以蠶上蔟的第6～8天為最佳，最佳注射時(shí)間的短促為規(guī)?；a(chǎn)帶來(lái)很大不便，通過(guò)冷藏蠶蛹的生產(chǎn)試驗(yàn)顯示在4～5 ℃冷藏10 d對(duì)重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)在蠶蛹中的表達(dá)效率影響不大，因此在規(guī)?；a(chǎn)上可以通過(guò)冷藏蠶繭的方式來(lái)延長(zhǎng)蠶蛹接種適期。2015年春秋蠶期，采用上述的試驗(yàn)結(jié)果成功進(jìn)行了生產(chǎn)1 t鮮繭規(guī)模的共表達(dá)基因工程產(chǎn)品豬α+γ干擾素的試生產(chǎn)，春用品種采用皓月×菁松，夏秋用品種采用白玉×秋豐，生產(chǎn)得率為55%～60%，即1 t鮮繭可生產(chǎn)豬α+γ干擾素共表達(dá)蠶蛹0.55～0.60 t。實(shí)踐證明只要在生產(chǎn)上將適合不同季節(jié)飼養(yǎng)的蠶品種合理運(yùn)用，蠶期養(yǎng)蠶收蟻時(shí)間作合理的安排以及結(jié)合機(jī)械的使用和規(guī)范操作可以確保規(guī)?；a(chǎn)的成功。

參考文獻(xiàn)

[1] 張耀洲，吳祥甫.家蠶生物反應(yīng)器[M].杭州:浙江大學(xué)出版社，2008.

[2] 楊瑞麗，任學(xué)毅，趙秀玲，等.家蠶蛹表達(dá)乙肝表面抗原中蛋白免疫原性的研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2002,10(4):359-362.

[3] 曹廣力，華剛，張志芳，等.應(yīng)用重組家蠶核多角體病毒在蠶體中表達(dá)人丙型肝炎病毒C區(qū)及E1區(qū)基因[J].蠶業(yè)科學(xué)，1999，25(4)：230-236.

[4] 張志芳，何家祿.應(yīng)用家蠶桿狀病毒生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子口服藥物的方法：中國(guó)，ZL02112766.2[P].2008-11-26.

[5] 肖慶利，季平，何家祿，等.禽馬立克氏病毒糖蛋白B基因在家蠶中的表達(dá)[J].蠶業(yè)科學(xué)，1997,23(2):104-108.

[6] 張韻，易詠竹，李志勇，等.O型口蹄疫P1-2A3C基因在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)[J].蠶業(yè)科學(xué)，2008，34(1):148-153.

[7] 張韻，張金衛(wèi)，易詠竹，等.Asia I口蹄疫病毒組合基因P1-2A3C在不同家蠶品種中的表達(dá)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(33)：20490-20491,20510.

[8] 張小楠.干擾素α與干擾素γ聯(lián)合處理加強(qiáng)抗病毒效應(yīng)分子機(jī)理初步研究[D].上海：復(fù)旦大學(xué)，2006.

[9]王彥彬，孫向麗，魏戰(zhàn)勇，等.豬干擾素α和γ在桿狀病毒中共表達(dá)及對(duì)PRRSV抑制作用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(9)：1931-1938.

[10] 鐘魯龍.豬干擾素α和γ在家蠶中的共表達(dá)[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[11] 張志芳，李金祥，李軼女，等. 動(dòng)物α干擾素和γ干擾素的表達(dá)方法:中國(guó)，ZL2012101105336[P].2014-11-19.

[12] 魚(yú)南洋，丁農(nóng)，張金衛(wèi)，等. 昆蟲(chóng)蛹集團(tuán)注射機(jī)[P]:中國(guó)，ZL200920113230.3.2011-05-18.

摘要[目的] 研究家蠶生物反應(yīng)器規(guī)?；脖磉_(dá)基因工程產(chǎn)品豬α+γ干擾素的關(guān)鍵技術(shù)，為家蠶生物反應(yīng)器規(guī)模化共表達(dá)豬α+γ干擾素的生產(chǎn)提供技術(shù)支持。[方法]采用α干擾素ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蠶品種、接種方式、蠶蛹冷藏對(duì)共表達(dá)干擾素重組桿狀病毒rBmNPV(BmIFN-α+γ)表達(dá)量的影響。 [結(jié)果]不同蠶品種對(duì)重組桿狀病毒的表達(dá)效率差異較大，春用品種選擇皓月×菁松，夏秋用品種選擇白玉×秋豐。機(jī)械注射接種效率比手工注射提高了3倍以上，檢測(cè)產(chǎn)品表達(dá)量相差不大。蠶在上蔟后25 ℃保護(hù)，第5～9天是注射適期，以第6～8天為最佳。蠶繭冷藏于4～5 ℃ 10 d以?xún)?nèi)，對(duì)重組桿狀病毒在蠶蛹中的表達(dá)效率影響不大。[結(jié)論]采用高表達(dá)效率的蠶品種以及結(jié)合機(jī)械的使用和規(guī)范操作可以確保規(guī)?；a(chǎn)的成功。

關(guān)鍵詞家蠶生物反應(yīng)器；共表達(dá)；豬；α+γ干擾素

Productive Study of Silkworm Bioreactor Porcine Co-expression α+γ Interferon

DING Nong, ZHANG Jin-wei, LI Jiang-tao et al (Huzhou Academy of Agricultural Sciences, Huzhou, Zhejiang 313000)

Abstract[Objective] To study the key technologies of silkworm bioreactor large scale porcine co-expression α+γ interferon, and provide technical support for the production of silkworm bioreactor large scale porcine co-expression α+γ interferon. [Method]α interferon ELISA testing kits were used for testing the effects of silkworm varieties, inoculation methods and silkworm pupae cold storage on the amount of expression of co-expression interferon recombinant baculovirus rBmNPV (BmIFN-α+γ). [Result] Different kinds of silkworms differ largely in expression efficiency to recombinant baculovirus, with Haoyue × Jingsong higher and Qiufeng × Baiyu lower. Mechanical injection inoculation was over three times more efficient than manual, with similar expression of tested products. After mounting, the silkworms needed to be protected at a temperature of 25 ℃. The fifth to ninety day was the optimum time for injection, with the sixth to eighth the best. Cocoons were refrigerated at 4-5 ℃ for ten days, which had a little influence on the expression efficiency of recombinant baculovirus in cocoons.[Conclusion] The use of high expression efficiency silkworm varieties and the standardized use of machines can ensure the success of large scale production.

Key wordsSilkworm bioreactor；Co-expression；Porcine；α+γ Interferon

收稿日期2015-12-07

作者簡(jiǎn)介丁農(nóng)(1961- )，男，浙江德清人，研究員，從事家蠶遺傳育種及生物技術(shù)應(yīng)用研究。

基金項(xiàng)目浙江省公益技術(shù)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2014C32054)；湖州市公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目(2013GY09)。

中圖分類(lèi)號(hào)S 882.3+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)01-220-03