ATP生物發(fā)光法在快速檢測(cè)物體表面清潔度中的應(yīng)用

劉 陽(yáng),牟金明

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000)

?

ATP生物發(fā)光法在快速檢測(cè)物體表面清潔度中的應(yīng)用

劉 陽(yáng),牟金明*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000)

細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)是食品衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域的重要檢測(cè)指標(biāo)，主要是用來(lái)判斷食品等被污染的程度。對(duì)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行快速準(zhǔn)確地檢測(cè)一直是該領(lǐng)域內(nèi)重要的研究課題。對(duì)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法是平板計(jì)數(shù)法[1]，該方法測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)，操作繁瑣，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。檢測(cè)的時(shí)效性在食品等行業(yè)尤為重要，在加工過程中實(shí)時(shí)的監(jiān)控生產(chǎn)環(huán)境更是防患于未然的根本方法，顯然這是國(guó)標(biāo)法無(wú)法做到的。ATP生物發(fā)光微生物檢測(cè)技術(shù)是一種以生物發(fā)光反應(yīng)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)技術(shù)[2]，此技術(shù)用生物發(fā)光法測(cè)定細(xì)菌體中ATP的含量，再利用細(xì)菌體ATP含量與菌落總數(shù)成正比這一原理，推算出菌落總數(shù)[3]。與傳統(tǒng)的細(xì)菌總數(shù)國(guó)標(biāo)平板計(jì)數(shù)法相比，ATP生物發(fā)光微生物檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、成本低廉、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。利用ATP發(fā)光法實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)可以很好地彌補(bǔ)國(guó)標(biāo)法的不足，兩者相互輔助，相得益彰。近幾年，在我國(guó)ATP發(fā)光法也得到了廣泛的應(yīng)用。筆者以ATP生物發(fā)光微生物檢測(cè)技術(shù)為指導(dǎo)，通過提取重組的螢火蟲熒光素酶，配制完成一體化的熒光反應(yīng)試劑并研究其在物體表面清潔度快速檢測(cè)方面中的應(yīng)用。

1材料與方法

1.1材料試驗(yàn)中所用到的氯化鈉(NaCl)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritionX-100)等生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，廣東華大技術(shù)有限公司；0.4 μm的硝酸纖維素膜，美國(guó)Millipore公司；蛋白純化所用儀器為液相色譜系統(tǒng)AKTA PURIFIER，美國(guó)GE公司；檢測(cè)熒光強(qiáng)度儀器為BHP9505微量光度計(jì)，北京濱松光子技術(shù)有限公司。

1.2試劑制備

1.2.1ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。用分析天平稱取0.010 1 g ATP白色粉末溶于20 mL滅菌的雙蒸水中，配制成1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)ATP母液，分裝到2 mL無(wú)菌EP管中，放入-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)稀釋即得到濃度為10 μmol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2一體化熒光反應(yīng)試劑的制備(終濃度)。Tris-HCl pH 7.8 50 mmol/L；KCl 100 mmol/L；MgCl22 mmol/L；丙三醇(glyercol)10%；聚乙二醇辛基苯基醚(TritionX-100)1%。

1.2.3PBS緩沖液的配制。pH 7.8 的0.2 mol/L NaH2PO48.5 mL與0.2 mol/L Na2HPO491.5 mL混合。

I=Imax×cATP/Km+cATP

式中，Imax為最大發(fā)光強(qiáng)度；Km為1×10-4。由上式可知，當(dāng)cATP遠(yuǎn)小于Km時(shí)，I正比于樣品中的cATP。因此可通過測(cè)定發(fā)光體系的I值來(lái)定量ATP濃度[5]。

正常條件下細(xì)菌體內(nèi)的ATP含量趨近恒定，為10-18mol[6]。以光電倍增管為核心采光部件的光度計(jì)都能檢測(cè)低于 10 pg分子的ATP，這就使快速、準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)菌成為可能。

1.4蛋白純化螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒由美國(guó)Cellex公司 CEO James惠贈(zèng)，該質(zhì)粒載體為pET15b-sumo 。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞為BL21DE3中37 ℃培養(yǎng)16 h，從含AMP(氨芐西林)100 μg/mL的平皿中挑取單克隆到5 mL的 LB培養(yǎng)基中(AMP 50 μg/mL)，37 ℃搖動(dòng)培養(yǎng)5 h，按接種比例1∶1 000將前培養(yǎng)樣品轉(zhuǎn)接到3 L 的LB 培養(yǎng)基中(AMP 50 μg/mL)37 ℃搖動(dòng)培養(yǎng)，直至OD值到 0.6～0.7，加入0.3 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖(ITPG)后，改成18 ℃搖動(dòng)培養(yǎng)16 h。4 000 r/min、30 min、4 ℃低溫離心收集發(fā)酵細(xì)菌，細(xì)菌超聲波破碎后，12 000 r/min、4 ℃低溫離心30 min，取上清液。將上清液用0.45 μm一次性硝酸纖維素濾膜過濾后通過Ni-NTA(GE Healthcare)初步純化，洗脫的樣品再次通過陽(yáng)離子sp(GE Healthcare)純化得到重組的螢火蟲熒光素酶，將得到的樣品加入10% 甘油凍存在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。 用雙蒸水將濃度為10 μmol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1∶10梯度比例稀釋成1 μmol/L 、100 nmol/L、10 nmol/L 、1 nmol/L、 100 pmol/L、10 pmol/L系列溶液(注意：ATP溶液極易降解，稀釋好的溶液應(yīng)放在冰上)。用微量移液器吸取50 μL熒光反應(yīng)試劑(Tris-HCl pH 7.8 50 mmol/L；KCl 100 mmol/L；MgCl22 mmol/L ；glyercol 10%)，加入熒光反應(yīng)比色杯中，然后分別加入5 μL稀釋后的各梯度ATP溶液，用微量光度計(jì)檢測(cè)相對(duì)熒光值(RLU)，重復(fù)上述步驟。

1.5.2細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。 將從冰箱中取出的大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌3種細(xì)菌分別在LB培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)6 h，將3種不同濃度的菌液按1∶1∶1比例進(jìn)行混合搖勻后備用。用無(wú)菌的PBS緩沖液將混合菌液連續(xù)10倍稀釋，稀釋至可以得到單菌落的濃度梯度(10-7～10-9)為止，用傾注平板法將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入1 mL稀釋的混合菌液，每個(gè)稀釋梯度做2個(gè)平行試驗(yàn)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，對(duì)平板上形成的單菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，單位用CFU/mL表示(平皿計(jì)數(shù)法參見國(guó)標(biāo)，GB4789. 2-2010)。同時(shí)檢測(cè)相對(duì)應(yīng)梯度菌液的相對(duì)熒光值(RLU)，即用移液槍吸取混合稀釋好的菌液10 μL加入配制好的一體化熒光反應(yīng)試劑50 μL，輕輕吸打混勻，推入至微量光度計(jì)檢測(cè)管內(nèi)讀取相對(duì)熒光值(RLU)，每個(gè)梯度測(cè)2次，取平均值計(jì)數(shù)。分別以相對(duì)熒光值對(duì)數(shù)值即lg(RLU)和菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值lg(CFU/mL)為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖。

1.5.3物體表面細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。 取無(wú)菌棉簽，將棉簽頭部放入無(wú)菌的裝有2 mL PBS緩沖液的EP管中浸濕，然后用此棉簽在被測(cè)物體表面均勻涂擦，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽，采樣總面積為10×10 cm2。將取完樣的棉簽頭部再次放入到原EP管中渦旋搖晃洗滌數(shù)次，即得到物體表面菌樣。將得到的菌樣進(jìn)行菌落總數(shù)和相對(duì)熒光值檢測(cè)(方法同“1.5.2”)。分別以相對(duì)熒光值對(duì)數(shù)值lg(RLU)和物表菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值lg(CFU/mL)為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖。

2結(jié)果與分析

2.1重組螢火蟲熒光素酶檢測(cè)ATP活力 螢火蟲熒光素酶分子量為60 kD，pET-sumo載體含有20 kD的sumo標(biāo)簽蛋白，野生型的螢火蟲熒光素酶經(jīng)過發(fā)酵誘導(dǎo)后大多在包涵體里，幾乎沒有可溶性的目的蛋白。為此在構(gòu)建時(shí)加入sumo促溶標(biāo)簽共同表達(dá)，以增加該蛋白的可溶性，在試驗(yàn)的過程中，如果用sumo酶(promega)進(jìn)行標(biāo)簽切除，蛋白變得極不穩(wěn)定，出現(xiàn)大量沉淀，所以最終得到的蛋白是含有20 kD sumo標(biāo)簽的重組蛋白，見圖1。為檢驗(yàn)重組蛋白是否仍具有良好的活力，試驗(yàn)分別以相對(duì)發(fā)光值對(duì)數(shù)值lg(RLU)和ATP濃度值lg[ATP]為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖。圖2 表明，在ATP濃度為10 pmol/L～10 μmol/L范圍內(nèi)，ATP濃度與相對(duì)熒光值(RLU)呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)性R2=0.986 9。

圖1　重組螢火蟲熒光素酶SDS-PAGE 10%Fig.1　Recombinant firefly luciferase SDS-PAGE 10%

圖2　ATP生物發(fā)光法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of the ATP bioluminescent method

2.2ATP生物發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌總數(shù)的相關(guān)性在馬妮等的研究中，利用ATP發(fā)光法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)至少需要2步，首先要加入裂解液去釋放細(xì)菌中的ATP，再加入發(fā)光反應(yīng)試劑與菌體釋放出的ATP反應(yīng)檢測(cè)光值[7]。因?yàn)樵摪l(fā)光反應(yīng)極其靈敏，并且生活中遍布著大量游離的ATP，使得每多加一步反應(yīng)過程都會(huì)增加污染的可能。筆者在試驗(yàn)的過程中嘗試了多種去污劑，最后篩選出既可以快速裂解細(xì)菌又不會(huì)影響發(fā)光的非離子型表面活性劑TritionX-100[8]。

圖3試驗(yàn)結(jié)果表明，加入TritionX-100的反應(yīng)試劑，不僅得到了相對(duì)熒光值與菌落總數(shù)良好的線性關(guān)系，而且也完成了裂解與發(fā)光反應(yīng)的一體化試劑。以此構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，重新做10組試驗(yàn)，方法同“1.5.2”，將得到的RLU值代入到y(tǒng)=1.708 8x-1.942 5中，算出y轉(zhuǎn)換成菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值。預(yù)測(cè)值與平板計(jì)數(shù)法得到的菌落總數(shù)值實(shí)際值結(jié)果見表1。將表1中的菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值進(jìn)行相關(guān)性分析得到表2。結(jié)果表明，菌落總數(shù)實(shí)際值與菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值相關(guān)性系數(shù)r=1.000，呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，即ATP生物發(fā)光法檢測(cè)混合菌液菌落總數(shù)與國(guó)標(biāo)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果基本一致。

2.3ATP生物發(fā)光法快速檢測(cè)物體表面細(xì)菌總數(shù)對(duì)4種表面大小為10×10 cm2的不同樣品物體清洗前后進(jìn)行ATP生物發(fā)光法對(duì)比檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。說明應(yīng)用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)物體表面清洗前后相對(duì)熒光值差異顯著，在實(shí)際檢測(cè)中可以快速地定性判斷物體表面的清潔程度。

圖3　ATP生物發(fā)光法細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of total bacterial count in ATP bioluminescent method

序號(hào)No.相對(duì)熒光值(RLU)Relativelightunit相對(duì)熒光值對(duì)數(shù)lg(RLU)XLogarithmvalueofrelativelightunit菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值對(duì)數(shù)lg(CFU)YLogarithmvalueofthepredictedvalueoftotalbacterialcount菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值Predictedvalueoftotalbacterialcount∥CFU/mL菌落總數(shù)實(shí)際值A(chǔ)ctualvalueoftotalbacterialcount∥CFU/mL19722.9876662.98766615003200212513.0972573.09725722003200338743.5881603.5881601500020000454183.7338393.733839270000320000586433.9366653.9366656100007000006126304.1014034.101403120000018000007354194.5492364.549236680000072000008495524.6950614.69506112000000200000009745084.8722034.8722032400000020000000105224905.7180785.718078670000000700000000

表2混合菌液菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相關(guān)性分析

Table 2Correlation analysis of the actual and predicted values of the mixed bacteria

項(xiàng)目Item相關(guān)Correlation菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值Predictedvalueoftotalbacterialcount菌落總數(shù)實(shí)際值A(chǔ)ctualvalueoftotalbacterialcount菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值Pearson相關(guān)性11.000**Predictedvalueoftotal顯著性(單側(cè))0.000bacterialcountN1010菌落總數(shù)實(shí)際值Pearson相關(guān)性1.000**1Actualvalueoftotal顯著性(單側(cè))0.000bacterialcountN1010

注：**表示極顯著相關(guān)。

Note： ** indicated extremely significant correlation.

表3不同種類的同一物體表面清洗前后檢測(cè)相對(duì)熒光值(RLU)結(jié)果對(duì)比

Table 3Comparison of relative light units(RLU)of the same object surface before and after cleaning

檢測(cè)項(xiàng)目Detectionitem清洗前(RLU)Beforecleaning自來(lái)水(RLU)Runningwater酒精消毒(RLU)Alcoholsterilization刀Knife63516218案板Choppingboard83929721手Hand3890806102辦公桌Officetable1598293236

圖4　ATP生物發(fā)光法檢測(cè)不同餐盤表面菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of total bacterial count in different plate surfaces by ATP bioluminescent microbial detection

進(jìn)一步對(duì)食堂的130個(gè)不同餐盤表面進(jìn)行菌落總數(shù)和相對(duì)熒光值同步檢測(cè)，方法同“1.5.3”。圖4將2組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合得到良好的線性關(guān)系。同樣以此標(biāo)準(zhǔn)曲線為數(shù)學(xué)模型，重新檢測(cè)食堂10個(gè)不同餐盤的表面，將得到的RLU值代入到公式y(tǒng)=0.992x+0.367 4中，得到y(tǒng)換算成菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值，預(yù)測(cè)值與平板計(jì)數(shù)法得到的菌落總數(shù)實(shí)際值結(jié)果見表4。將表4中菌落總數(shù)的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值進(jìn)行相關(guān)性分析得到表5。結(jié)果表明，ATP生物發(fā)光法測(cè)定的盤子物體表面菌落總數(shù)實(shí)際值和菌落總數(shù)預(yù)測(cè)值相關(guān)性系數(shù)r=0.998，呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)。即ATP生物發(fā)光法檢測(cè)物體表面的結(jié)果與國(guó)標(biāo)平板計(jì)數(shù)法基本一致，可用此法進(jìn)行物體表面清潔度的快速檢測(cè)。

表4　10組餐盤表面菌落總數(shù)的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值

表5　不同餐盤表面菌落總數(shù)的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相關(guān)性分析

注：**表示極顯著相關(guān)。

Note： ** indicated extremely significant correlation.

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論該研究建立的ATP生物發(fā)光微生物檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)的相對(duì)熒光值與物體表面的菌落總數(shù)存在良好的線性相關(guān)性，且ATP生物發(fā)光法操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、成本低廉、綠色環(huán)保，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)物體表面清潔度。

3.2討論

3.2.1建立食品及服務(wù)等行業(yè)的半定量標(biāo)準(zhǔn)。ATP發(fā)光法實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)應(yīng)用廣泛，在生產(chǎn)設(shè)施清潔、消毒效果檢測(cè)，原、輔料細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)，生產(chǎn)設(shè)備關(guān)鍵控制點(diǎn)(例如供水、通風(fēng)閥門)、衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè)，化妝品及乳品微生物總數(shù)檢測(cè)中都可以起到很好的實(shí)時(shí)監(jiān)控的作用，但是目前只能作為企業(yè)內(nèi)部生產(chǎn)環(huán)節(jié)控制的輔助手段。統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí)，凡ATP熒光法顯示衛(wèi)生水平有所改善，則對(duì)應(yīng)的平皿計(jì)數(shù)細(xì)菌總數(shù)也會(huì)顯著減少；如果檢測(cè)點(diǎn)ATP檢測(cè)結(jié)果偏高，24 h后必然大量滋生細(xì)菌導(dǎo)致嚴(yán)重污染。如能通過國(guó)標(biāo)法和ATP熒光法兩者之間建立起符合食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的有效范圍(如合格、警告、不合格)；將會(huì)大大增加食品企業(yè)的產(chǎn)品合格率。

3.2.2ATP發(fā)光法實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)菌的不足。 ATP發(fā)光法最大的優(yōu)勢(shì)就是檢測(cè)過程快速，且靈敏度極高，但該方法在不同的大環(huán)境下容易受到影響，不同的食品企業(yè)會(huì)在食品中加入種類繁多的添加劑，其中有些會(huì)影響到光值的穩(wěn)定性，這種特性就制約著ATP發(fā)光法檢測(cè)細(xì)菌的普遍性，使得該檢測(cè)方法還沒能進(jìn)入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方案，所以目前只能是企業(yè)內(nèi)部建立自我衛(wèi)生監(jiān)控，還無(wú)法成為國(guó)家衛(wèi)生執(zhí)法部門統(tǒng)一有效的檢測(cè)手段。ATP發(fā)光法檢測(cè)細(xì)菌的快速、便捷是顯而易見的，如何克服該方法的不足將是今后努力的目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1] GRACIAS K S，MCKILLIP J L.A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food[J].Microbiology，2004，50(11):883-890．

[2] FORD S R，LEACH F R.Improvements in the application of firefly luciferase assays[J].Methods in molecular biology，1998，102：1-20.

[3] 連英姿，董雪，李勇，等.ATP生物發(fā)光技術(shù)快速檢測(cè)水中細(xì)菌的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜，2007，17(10)：1859-1860.

[4] 唐倩倩，葉尊忠，王劍平，等.ATP生物發(fā)光法在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2008，29(6)： 460-464.

[5] 吳巨賢，石曉艷，王焰紅，等.ATP熒光傳感器在食品中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2011，32(5)：171-173.

[6] 李利霞，伍金娥，常超，等.優(yōu)化的ATP生物發(fā)光法快速檢測(cè)面粉中細(xì)菌總數(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(7)：4055-4057.

[7] 馬妮，趙紅，張旭，等.ATP發(fā)光技術(shù)快速檢測(cè)食品中菌落總數(shù)[J].中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)，2008，7(5)：296-297.

[8] ISHIDA A，YOSHIKAWA T，NAKAZAWA T，et al.Enhanced firefly bioluminescence assay of ATP in the presence of ATP[J].Analytical biochemistry，2002，305： 236-241.

摘要[目的]建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)物體表面清潔度的方法。[方法]以ATP生物發(fā)光微生物檢測(cè)技術(shù)為指導(dǎo)，提取重組的螢火蟲熒光素酶并配制成熒光反應(yīng)試劑，測(cè)定其與ATP發(fā)光反應(yīng)值的線性關(guān)系；根據(jù)ATP含量與細(xì)菌數(shù)量成正比例關(guān)系原理, 測(cè)定物體表面ATP發(fā)光強(qiáng)度值，同時(shí)用國(guó)標(biāo)平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定其菌落總數(shù)，兩者對(duì)比分析。[結(jié)果] ATP生物發(fā)光法檢測(cè)的相對(duì)熒光值與物體表面的菌落總數(shù)存在良好的線性相關(guān)性，利用ATP發(fā)光法實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)可以很好地彌補(bǔ)國(guó)標(biāo)法的不足。[結(jié)論] ATP生物發(fā)光法與傳統(tǒng)的細(xì)菌總數(shù)國(guó)標(biāo)平板計(jì)數(shù)法相比較具有操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、成本低廉、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)物體表面清潔程度。

關(guān)鍵詞ATP生物發(fā)光法；菌落總數(shù)；物體表面；清潔度

Application of ATP Bioluminescent Method in Rapid Detection of Object Surface Cleanliness

LIU Yang, MU Jin-ming*(College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130000)

Abstract[Objective] To establish a rapid and accurate detection method for object surface cleanliness. [Method] With ATP bioluminescent microbial detection technology as the guidance, recombinant firefly luciferase was extracted in order to prepare fluorescence reaction reagent. Its linear relation with ATP response value was detected. According to the principal of positive correlation between ATP content and bacterial population, ATP luminous intensity of object surface was detected. Total bacterial count was calculated by national standard plate counting method. And comparative analysis was carried out. [Result] There was good linear relationship between relative fluorescence unit and total bacterial count of object surface. Real-time detection of total bacteria by ATP bioluminescent method could make up for the disadvantages of national standard. [Conclusion] Compared with traditional national standard plate counting method, ATP bioluminescent microbial detection technology is more simple, rapid, sensitive and cheap. And it can rapidly and accurately detect the cleanliness of object surface.

Key wordsATP bioluminescent method; Total bacterial count; Object surface; Cleanliness

收稿日期2015-12-04

作者簡(jiǎn)介劉陽(yáng)(1987-)，女，遼寧丹東人，碩士，從事農(nóng)田生態(tài)與作物種植規(guī)劃研究。*通訊作者，副教授，博士，從事農(nóng)田生態(tài)與作物種植規(guī)劃研究。

中圖分類號(hào)TS 207.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)01-125-04