有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱降解菌的篩選及生理生化特性研究

劉虎成+楊麗萍

摘 ?要：本文采用微生物修復(fù)農(nóng)藥污染的方法，從武漢市江夏區(qū)長期受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤中馴化、分離、篩選出幾株生長最具優(yōu)勢的降解有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的菌株，分析和研究了單菌株和復(fù)合菌株對(duì)土壤的降解效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在7種組合和2個(gè)空白對(duì)照的對(duì)比下，AB菌株組合成為最佳組合降解菌，證明在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中確實(shí)存在菌種間的相互作用來促進(jìn)其對(duì)農(nóng)藥的降解，且降解效果明顯。另外，研究了不同溫度、PH值、碳源、氮源等環(huán)境因子對(duì)優(yōu)勢菌株生長的影響。

關(guān)鍵詞：毒死蜱;農(nóng)藥殘留;降解;復(fù)合菌株

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

1 引言

毒死蜱（Chlorpyrifos），即氯吡硫磷，作為一種中毒性有機(jī)磷殺蟲劑類農(nóng)藥， 作用效果好，藥效持續(xù)時(shí)間長，在我國乃至世界都有著廣泛的使用，目前逐漸替代高毒性有機(jī)磷農(nóng)藥。在施用中，會(huì)殘留于土壤、水、作物葉片上。如果不及時(shí)處理，會(huì)隨著揮發(fā)性和移動(dòng)性富集于生物體內(nèi)，最后隨著生物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康。目前對(duì)于農(nóng)藥污染的研究有很多，對(duì)毒死蜱也是如此。通過對(duì)他人研究成果的分析，筆者發(fā)現(xiàn)“研究過多的集中在一種高效降解菌的提取和研究”，即人們研究的高效降解菌株多局限于一株，然而單一的菌株易受土壤環(huán)境和土著微生物的影響，降解效率極易下降，并且土壤中的微生物環(huán)境極其復(fù)雜，降解農(nóng)藥污染不是一株降解菌就可以降解到人們滿意的效果。筆者從長期使用受機(jī)磷農(nóng)藥污染的農(nóng)田取樣，以含有毒死蜱農(nóng)藥的培養(yǎng)基篩選耐性菌株。通常情況下，在較高濃度的培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)多種耐性菌種，在多次循環(huán)使用農(nóng)藥培養(yǎng)基培養(yǎng)后，菌種會(huì)逐漸穩(wěn)定，其中極有可能出現(xiàn)含有毒死蜱抗性的降解菌株。然后通過組合培養(yǎng)可以確定復(fù)合菌株能否提高分解效率，以期證明環(huán)境中確實(shí)存在菌種間的相互作用來促進(jìn)其對(duì)農(nóng)藥的降解，研究結(jié)果可以為農(nóng)藥污染的土壤生物修復(fù)相關(guān)研究提供一定的依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

土樣：取自江夏區(qū)長期受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的田地中，風(fēng)干，避光保存。

農(nóng)藥：毒死蜱（美國陶氏益農(nóng)公司登記注冊(cè)）

2.2 試劑及設(shè)備

（1）試劑 KH2PO4，MgSO4·7H2O，（NH4）2SO4，蔗糖，HCl，NaOH，革蘭氏染色試劑，瓊脂，牛肉膏，乙酸乙酯。

（2）儀器設(shè)備 PGX-250多段光照培養(yǎng)箱（寧波）;UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)（日本）;奧林巴斯BX51顯微鏡（日本）;光照恒溫?fù)u床（上海）。

（3）富集培養(yǎng)基（液體）配方：K2HPO4·3H2O 13.3g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O 0.2g，（NH4）2SO4 0.5g，蔗糖10g，水1000mL，PH 7.0。

（4）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（液體）配方：牛肉膏 3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水 1000mL，PH 7.5。

（5）農(nóng)藥儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確移取毒死蜱農(nóng)藥，用乙酸乙酯為溶劑配制成質(zhì)量濃度為0.5g/L的毒死蜱農(nóng)藥儲(chǔ)備液，于冰箱中保存，使用時(shí)根據(jù)實(shí)際需要配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 菌種的篩選、分離和提純方法

土壤樣品來自江夏區(qū)紙坊附近的農(nóng)田，取2g新鮮土壤加入98g蒸餾水，搖勻制成懸浮液。取懸浮液的25%加入到含有一定量毒死蜱的培養(yǎng)基中，放入搖床中震蕩培養(yǎng)，30℃，100r/min轉(zhuǎn)培養(yǎng)48小時(shí)。48小時(shí)后移取懸浮液500微升于50mL含有一定量的毒死蜱的培養(yǎng)基中，然后在搖床繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，條件一致，重復(fù)3次。采用平板劃線法分離菌種，通過多次分離，在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)確定得到三株優(yōu)勢菌種，暫命名為A菌，B菌，C菌，分別挑取A、B、C，接種于50mL富集培養(yǎng)基中，30℃，120r/min，振蕩培養(yǎng)24h（富集培養(yǎng)），得到三種純的菌液備用。

2.3.2 ?不同組合菌株降解毒死蜱的土壤模擬實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)土壤取回后風(fēng)干過40目篩備用。采用a、b、c三個(gè)處理組，每個(gè)處理組重復(fù)兩次。向每個(gè)錐形瓶中加入50 g土壤，25mL水，作如下處理：

a 組：1、滅菌、加入A菌懸液6mL、農(nóng)藥儲(chǔ)備液2mL;2、滅菌、加入b菌懸液6mL、農(nóng)藥儲(chǔ)備液2mL;3、滅菌、加入c菌懸液6mL、農(nóng)藥儲(chǔ)備液2mL;4、滅菌、加入a、b菌懸液各3 mL、農(nóng)藥儲(chǔ)備液2mL;5、滅菌、加入a、c菌懸液各3 mL、農(nóng)藥儲(chǔ)備液2mL;6、滅菌、加入b、c菌懸液各3 mL、農(nóng)藥儲(chǔ)備液2mL;7、滅菌、加入a、b、c菌懸液各2 mL、農(nóng)藥儲(chǔ)備液2mL;

b 組：滅菌、未加入菌懸液，加入農(nóng)藥儲(chǔ)備液2 mL;

c 組：未滅菌、未加入菌懸液，加入農(nóng)藥儲(chǔ)備液2 mL。

其中，b、c兩組均為空白對(duì)照組，b組為了測定土壤和農(nóng)藥之間的吸附關(guān)系，c組為了測定土壤固有微生物和農(nóng)藥之間的降解關(guān)系。需要滅菌的樣品放入高壓滅菌鍋中，121℃條件下滅菌30min。將滅菌后的樣品和C組樣品放入30℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其間分別在第1、4、7、11、15、21天取樣，用紫外可見分光光度計(jì)測定各對(duì)應(yīng)組別對(duì)毒死蜱的降解率。每周向A處理組中加入對(duì)應(yīng)等量的菌懸液，并于試驗(yàn)期間每隔3天進(jìn)行稱重和補(bǔ)足流失水分，保證試驗(yàn)期間土壤中總含水量維持在一個(gè)較穩(wěn)定的水平。

2.3.3 降解純菌株及復(fù)合菌株的生理生化特性研究

將分離出的優(yōu)勢降解菌株利用革蘭氏染色法，在生物數(shù)碼顯微鏡下觀察菌體形態(tài)大小。在優(yōu)勢菌株的培養(yǎng)過程中，通過對(duì)培養(yǎng)基配制不同的PH值、碳源、氮源，設(shè)定不同的培養(yǎng)溫度，采用不同的接種方式，研究環(huán)境因子（氧氣，PH值，溫度，碳源和氮源）對(duì)優(yōu)勢菌株生長的影響。

2.4 毒死蜱提取及其測定方法

2.4.1 毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度分別為0.0001mg/mL、0.0002mg/mL、0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.005mg/mL的毒死蜱溶液，采用紫外分光光度計(jì)于293mm波長下測定各濃度溶液的吸光度，繪出吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 土壤中毒死蜱的殘留提取方法

稱取1.0g土壤，加入少量乙酸乙酯，充分搖勻混合，混合物用濾紙過濾，過濾前撒上少量無水硫酸鈉以吸收土樣中的水分，過濾過程中多次加入乙酸乙酯于試管中沖洗，最后定容至5毫升。采用紫外分光光度計(jì)于293mm波長下測定吸光度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 各處理組菌株降解結(jié)果與分析

由圖1、圖2可知，培養(yǎng)第一天，各個(gè)處理組的殘留量減少約一半，初始添加量均為0.5mg，共九個(gè)處理組在添加農(nóng)藥一天后均下降為0.2mg左右，在此初步認(rèn)為是土壤顆粒的吸附所致。由于土壤的吸附性，毒死蜱滴入土壤中后迅速被吸附并進(jìn)入顆粒內(nèi)部，而乙酸乙酯在常規(guī)手段下難以有效溶解吸附在顆粒內(nèi)部的毒死蜱，導(dǎo)致無法析出，因而在測定時(shí)含量下降。在第3天即第2次測量時(shí)除a3組含量降低不明顯，其他幾組含量均有較大幅度下降，下降趨勢相似。第8天測量時(shí)，b組濃度出現(xiàn)回升，可能是土壤吸附的毒死蜱重新釋放回土壤所致，a6組與b組變化趨勢相近。除a3組外其他各組均出現(xiàn)持續(xù)下降，說明添加菌種均對(duì)毒死蜱產(chǎn)生降解效應(yīng)，但是否確實(shí)為降解還無法確定。培養(yǎng)至第21天，毒死蜱殘留量出現(xiàn)不同程度下降，其中a4、a5、a1組與b、c組相比下降尤為明顯，殘留量分別為0.114mg、0.138 mg、0.164 mg。殘留量由高到低排序?yàn)閍3>b>a2>a6>a7>b>a1>a5>a4，即降解量a4>a5>a1>c>a7>a6>a2>b>a3，而降解量前三的組別中均有菌種A，由此可以斷定菌種A確實(shí)對(duì)毒死蜱具有一定的吸收或降解能力，而相比于A菌種單獨(dú)或與其他菌種的組合，A菌種與B菌種的組合在降解效率上顯得尤為突出。這一結(jié)果表明，本次實(shí)驗(yàn)最終篩選得到的最優(yōu)組合為AB菌種組合，對(duì)于其他組合，除a3無明顯效果外，均呈現(xiàn)出比B組（空白組）降解效果好的趨勢，而并未呈現(xiàn)出比C組（全菌種模擬野外環(huán)境組合）具有更明顯優(yōu)勢的趨勢，說明篩選出的A、B、C三個(gè)菌種中A菌、B菌具有吸收或降解能力，而C菌無明顯吸收或降解能力。

3.2 優(yōu)勢菌株生理生化特性研究結(jié)果與分析

3.2.1 顯微形態(tài)

A菌株為革蘭氏陰性菌，菌體為長桿狀，有鞭毛，有芽孢，菌落圓形，淡黃色，不透明，凸起，邊緣整齊;b菌株為革蘭氏陰性菌，菌體為短桿狀，無鞭毛，無芽孢，菌落圓形，淡黃色，不透明，凸起，邊緣整齊;c菌株為革蘭氏陽性菌，菌體為短桿狀，無鞭毛，無芽孢，菌落圓形，淡黃色，不透明，凸起，邊緣整齊。

3.2.2 氧氣和溫度對(duì)分離菌株的影響

A、B菌株在只在試管的表面處生長，因此A、B菌均為專性好氧菌。c菌株在試管的接近表面處和表面處生長，因此C菌為兼性厭氧菌。

由表1可以看出，單菌株的最適宜生長溫度在30-37℃，高于45℃或低于4℃菌株不生長;AB復(fù)合菌株的最適宜生長溫度在15-37℃，高于45℃或低于4℃菌株不生長。此復(fù)合菌株對(duì)溫度的適應(yīng)能力稍強(qiáng)于單菌株對(duì)溫度的適應(yīng)能力，說明復(fù)合菌株更能適應(yīng)自然條件。

3.2.3 PH值、碳源和氮源對(duì)菌株的生長的影響

由圖3可以看出，當(dāng)PH在5-9之間時(shí)，A、B、C和復(fù)合菌株三個(gè)菌株生長情況較好，PH在9以后，各菌株的生長情況隨著PH的增大而減小;復(fù)合菌株在不適宜生長的PH為2、4、10時(shí)的OD600均稍高于每一個(gè)單菌株，可以看出，復(fù)合菌株更加適宜在自然條件下生長。

由圖4可知，A菌株和復(fù)合菌株在以蔗糖為唯一碳源時(shí)，生長量最好，下面依次為葡萄糖、淀粉、毒死蜱。而B菌株和C菌株在以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，生長量最好，下面依次為毒死蜱、蔗糖、淀粉。但A菌株和復(fù)合菌株對(duì)上述碳源都可以進(jìn)行降解，且降解率差異不大，這樣更有利于自然環(huán)境中的生長。

由圖5可知，A菌株和B菌株在以蛋白胨為唯一氮源時(shí)，生長量最好，下面依次為牛肉膏、毒死蜱、酵母膏。C菌株在以牛肉膏為唯一氮源時(shí)，生長量最好，下面依次為蛋白胨、毒死蜱、酵母膏。這說明，在有其他營養(yǎng)物質(zhì)作為氮源時(shí)，降解菌首先降解其他物質(zhì)，但是在有毒死蜱存在時(shí)，這些菌株的生長量差別不是很大，所以對(duì)毒死蜱的降解影響不大。復(fù)合菌株在以蛋白胨為唯一氮源時(shí)，生長量最好，下面依次為毒死蜱、牛肉膏、酵母膏，可以看出復(fù)合菌株對(duì)毒死蜱有較好的降解效果。

4 結(jié)論和建議

在單菌株處理組中，菌株a對(duì)毒死蜱的降解效果最好;復(fù)合菌株處理組中，菌株ab對(duì)毒死蜱的降解效果最好。在9組菌株處理組中，AB菌種組合成為最佳組合，證明在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中確實(shí)存在菌種間的相互作用來促進(jìn)其對(duì)農(nóng)藥的降解，效果明顯。生理生化研究表明，a菌種為專性好氧菌，在30℃，PH為8，蔗糖為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源的條件下時(shí)，對(duì)毒死蜱的降解量最高;ab組合菌種在30℃，PH為8，蔗糖為唯一碳源，蛋白胨為唯一氮源的條件下時(shí)，對(duì)毒死蜱的降解量最高。

由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)條件所限，實(shí)驗(yàn)還需繼續(xù)深入，例如相關(guān)三個(gè)菌種之間的相互作用，降解效果定量分析，菌種定量搭配分析，菌種生物學(xué)鑒定等還需要進(jìn)一步研究。

（指導(dǎo)老師 萬 ?紅）

（本文審稿 劉向明）