艾灸足三里脊髓響應(yīng)通路的實(shí)驗(yàn)研究

王 明 蔡 輝 吳煥淦 余 芝 王欣君 陳智宇 金傳陽 張建斌,3

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南京，210023； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030；3 江蘇省第二中醫(yī)院，南京，210017)

艾灸足三里脊髓響應(yīng)通路的實(shí)驗(yàn)研究

王 明1蔡 輝1吳煥淦2余 芝1王欣君1陳智宇1金傳陽1張建斌1,3

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南京，210023； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030；3 江蘇省第二中醫(yī)院，南京，210017)

目的：研究艾灸“以溫促通”的傳入通路與脊髓背角神經(jīng)元響應(yīng)的關(guān)系。方法：選用成年雄性SD大鼠40只，玻璃微電極細(xì)胞外記錄L4節(jié)段脊髓背角神經(jīng)元活動(放電頻率)，分別給予足三里肌注150 μL的0.01M辣椒素(Capsaicin，CAP)和49 ℃艾灸30 s刺激，觀察不同刺激后神經(jīng)元放電的變化。結(jié)果：1)脊髓背角神經(jīng)元對足三里注射辣椒素有響應(yīng)，其效應(yīng)特征以興奮性作用為主；2)49 ℃艾灸足三里穴與辣椒素穴位注射足三里可以在脊髓背角的同一個神經(jīng)元中匯聚；3)脊髓背角神經(jīng)元對49 ℃艾灸的響應(yīng)，也存在與足三里辣椒素注射不一致效應(yīng)。結(jié)論：高溫?zé)峋牡膫魅胪泛图顾桧憫?yīng)，部分是由辣椒素敏感的C纖維和TRPV1通道介導(dǎo)的。

艾灸；足三里；傳導(dǎo)通路；辣椒素

艾灸施術(shù)簡便，療效顯著，古今臨床廣泛應(yīng)用。在艾灸現(xiàn)代原理研究中，施灸部位的溫?zé)岽碳ぜ捌洚a(chǎn)生的溫通效應(yīng)，受到關(guān)注，并形成了“以溫促通”的艾灸溫通理論[1-2]。但是，從施灸部位的溫?zé)岽碳さ綔赝ㄐ?yīng)產(chǎn)生的通路和環(huán)節(jié)尚不十分清晰。1997年，一個能被辣椒素(Capsaicin，CAP)激活的受體被克隆，被稱為辣椒素受體。根據(jù)其離子通道特性，此受體屬于瞬時感受器電位離子(Transient Receptor Potentia1，TRP)通道家族，主要存在于溫度敏感神經(jīng)元等，對外周和中樞溫度信息起著重要介導(dǎo)作用[3-5]。TRPV1是TRP的重要亞型，分布于全身，包括大腦、脊髓以及外周神經(jīng)系統(tǒng)，可被大于43 ℃的熱刺激激活，因此也被稱為“熱敏感”通道[6-7]。

艾灸“以溫促通”的傳入通路，首先應(yīng)該是由施灸部位或穴位局部到脊髓中樞的過程。脊髓背角神經(jīng)元對外周施灸刺激的響應(yīng)，是艾灸“以溫促通”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，脊髓背角TRPV1陽性神經(jīng)元激活可能是艾灸“以溫促通”的脊髓中樞調(diào)制環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過電生理學(xué)技術(shù)和手段，研究外周穴位施灸后的脊髓背角神經(jīng)元響應(yīng)，探索“以溫促通”的傳入通路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康雄性SD成年大鼠40只，體質(zhì)量300～450 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供(許可證號：GCXK(滬)2013-0016)，在室溫(22±2)℃、光照8:00—20：00、自由進(jìn)食飲水等同等標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 腦立體定位儀(David Kopf Instruments，美國)，微電極操作器控制(NARISHIGE，日本)，細(xì)胞外電生理記錄放大器(A-M systmes，美國)，Micro3-1401生理信號采集分析系統(tǒng)(CED，英國)，玻璃微電極拉制儀(WD-1，成都儀器廠)，玻璃微電極(長度100 mm，外徑1.2 mm，南京市泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠)，純艾條(南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠)，紅外測溫儀(Fluke 566)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 烏拉坦(氨基甲酸乙酯，上海青析化工科技有限公司)，滂胺天藍(lán)(Sigma，美國)，無水乙酸鈉(南京化學(xué)試劑有限公司)，辣椒素(Sigma，美國)，吐溫80(南京化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司)，生理鹽水(南京化學(xué)試劑有限公司)，石蠟油(南京化學(xué)試劑有限公司)。

1.4 細(xì)胞外記錄方法 將麻醉大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，用咬骨鉗開脊髓，暴露大鼠第四腰椎，用手術(shù)顯微鑷剝離硬脊膜，用蘸有生理鹽水的棉球小心地將周圍的血擦干凈，注意操作中盡可能的避免碰到脊髓，剝離硬脊膜后盡快滴38 ℃左右的石蠟油防止脊髓水分蒸發(fā)。實(shí)驗(yàn)過程中，用加熱板維持大鼠體溫在(37±0.5)℃。手術(shù)完成后，休息30 min等待大鼠狀態(tài)平穩(wěn)。拉制玻璃微電極(尖端直徑1～2 μm,內(nèi)含0.5 mol/L的醋酸鈉灌注和2%的膀胺天藍(lán)，阻抗為5～10MΩ)，并固定于微電極操作器上，通過微電極操作器(步進(jìn)1 μm/s)控制到達(dá)脊髓背角(前正中裂旁開：0.5～1.0 mm，深度：250～1 500 mm。)，探查神經(jīng)元，進(jìn)行細(xì)胞外記錄。干預(yù)前記錄30 s作為基線對照。記錄的放電信號經(jīng)前置放大器放大后，輸入多道生理信號采集系統(tǒng)，使用Spike2軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析，通過比較干預(yù)反應(yīng)時間內(nèi)神經(jīng)元放電頻率變化率來判斷神經(jīng)元的反應(yīng)。放電頻率計(jì)算率計(jì)算公式為：(干預(yù)時-干預(yù)前)/干預(yù)前×100%，變化率的絕對值≥15%視為興奮/抑制，<15%視為無變化。

1.5 取穴和刺激方法 參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]取大鼠左側(cè)“足三里”，記錄到穩(wěn)定的神經(jīng)元放電后，先記錄30 s，然后依次開始注射150 μL的0.01M辣椒素和49 ℃艾灸(30 s)。每個干預(yù)均等到神經(jīng)元放電恢復(fù)到干預(yù)前水平后才開始下一個干預(yù)刺激。在以上記錄過程中，隨時補(bǔ)充38 ℃的溫石蠟油保持脊髓濕潤，并保持安靜，以減少周圍環(huán)境的干擾。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脊髓背角神經(jīng)元對辣椒素的響應(yīng) 在40只大鼠的脊髓L4段，共記錄到自發(fā)穩(wěn)定放電的脊髓背角神經(jīng)元共60個，其中46個(76.67%)對辣椒素有反應(yīng)。46個有反應(yīng)的神經(jīng)元中，38個(82.61%)神經(jīng)元對辣椒素刺激產(chǎn)生了興奮放電，8個(17.39%)神經(jīng)元對該刺激產(chǎn)生了抑制放電。放電頻率特征見表1。

表1 脊髓背角神經(jīng)元對辣椒素的響應(yīng)±s)

2.2 脊髓背角神經(jīng)元對49 ℃艾灸的響應(yīng) 在40只大鼠脊髓背角L4段60個自發(fā)穩(wěn)定放電的神經(jīng)元中，24個(40.00%)對49 ℃艾灸30 s有反應(yīng)。24個有反應(yīng)的神經(jīng)元中，18個(75.00%)神經(jīng)元對49 ℃艾灸產(chǎn)生了興奮放電；6個(25.00%)神經(jīng)元對該刺激產(chǎn)生了抑制放電。放電頻率特征見表2。

表2 脊髓背角神經(jīng)元對49 ℃艾灸的響應(yīng)±s)

2.3 脊髓背角神經(jīng)元接受不同刺激后效應(yīng)特征 在40只大鼠脊髓背角L4段60個自發(fā)穩(wěn)定放電的神經(jīng)元中，分別有46個、24個神經(jīng)元對0.01M辣椒素150 μL足三里穴位注射和49 ℃艾灸30 s有響應(yīng)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩者效應(yīng)特征差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在有響應(yīng)的脊髓背角神經(jīng)元中，對足三里辣椒素注射和49 ℃艾灸30 s均以興奮性響應(yīng)為主，但也有少量神經(jīng)元產(chǎn)生抑制響應(yīng)。刺激后效應(yīng)特征見表3，圖1、圖2。

表3 脊髓背角神經(jīng)元接受不同刺激后效應(yīng)特征

注：*為與49 ℃艾灸興奮性神經(jīng)元進(jìn)行對比P<0.05。

值得注意的是，在24個對49 ℃艾灸有響應(yīng)的神經(jīng)元中，有6個(25.00%)神經(jīng)元對辣椒素注射無響應(yīng)；在38個對辣椒素產(chǎn)生興奮性響應(yīng)的神經(jīng)元中，對49 ℃艾灸30 s刺激產(chǎn)生興奮性響應(yīng)的神經(jīng)元有10個，抑制性響應(yīng)的4個，占全部艾灸響應(yīng)神經(jīng)元的58.33%(14/24)。

圖1 脊髓背角神經(jīng)元接受不同刺激后效應(yīng)特征

圖2 脊髓背角神經(jīng)元接受刺激后變化圖

注：A為注射辣椒素后神經(jīng)元興奮的變化圖；B為注射辣椒素后神經(jīng)元抑制的變化圖；C為49 ℃艾灸后神經(jīng)元興奮的變化圖；D為49 ℃艾灸后神經(jīng)元興奮的變化圖。

3 討論

足三里穴廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)等疾病，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與神經(jīng)支配和和相應(yīng)的中樞傳入傳出有關(guān)。足三里穴所在區(qū)的皮膚和肌肉由脊髓L4-S2段發(fā)出的腓淺、腓深神經(jīng)支配[9]。研究發(fā)現(xiàn)，用辣根過氧化物酶逆行追蹤足三里穴位的脊髓投射節(jié)段為T12-S2，尤其以L5-S2的標(biāo)記最多[10]。研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠脊髓背根L4-S1切斷后，針刺足三里對胃平滑肌電的改善作用呈顯著減弱，即足三里的效應(yīng)被抑制[11]。因此，脊髓背角L4-S2段是針灸足三里穴的初級傳入中樞，在足三里穴區(qū)的各種刺激，可以通過傳入通路在脊髓背角L4-S2段得到響應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，49 ℃艾灸足三里穴區(qū)，可以激活大鼠脊髓L4段背角神經(jīng)元，L4段脊髓背角神經(jīng)元是艾灸足三里“以溫促通”傳入通路的主要響應(yīng)靶區(qū)之一。

本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，大鼠脊髓L4段背角神經(jīng)元除了響應(yīng)足三里穴區(qū)49 ℃艾灸外，還可以同時響應(yīng)足三里穴區(qū)的辣椒素注射。辣椒素具有明顯細(xì)胞特異性，激活神經(jīng)C纖維上的非特異性離子通道——TRPV1受體，產(chǎn)生生物學(xué)活性[12]。辣椒素濃度的不同，對初級感覺神經(jīng)元的作用不同，機(jī)體由此產(chǎn)生的效應(yīng)也不同。低濃度的辣椒素能興奮辣椒素敏感神經(jīng)元[13]；高濃度的辣椒素可以使感覺神經(jīng)元失敏[14-15]。新生大鼠皮下注射50 mg/kg辣椒素是目前實(shí)驗(yàn)室主要的阻斷感覺神經(jīng)中痛纖維的方法。為了興奮辣椒素敏感神經(jīng)元，本實(shí)驗(yàn)選用0.01M(低濃度)的辣椒素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了該濃度能激活TRPV1通道，對L4脊髓背角神經(jīng)元產(chǎn)生以興奮為主的作用。值得注意的是，在38個辣椒素興奮性神經(jīng)元中，對49 ℃艾灸30 s刺激有響應(yīng)的神經(jīng)元有14個，占全部艾灸響應(yīng)神經(jīng)元的58.33%(14/24)，49 ℃艾灸足三里穴與辣椒素足三里兩種干預(yù)均可以在脊髓背角的同一個神經(jīng)元中匯聚，提示了49 ℃艾灸足三里穴與辣椒素足三里存在共同傳入通路和相近的效應(yīng)作用，都可能與TRPV1通路有關(guān)。任何形式的傷害性刺激只要達(dá)到一定強(qiáng)度，對組織發(fā)生損傷作用，組織就會釋放某些致痛物質(zhì)，如K+、H+、組胺、5-羥色胺、緩激肽、前列腺素等，作用于游離的神經(jīng)末梢，產(chǎn)生沖動，由傳導(dǎo)傷害信息的Aδ(Ⅲ)類和C(Ⅳ)類纖維傳入中樞引起痛覺[16]。49 ℃艾灸和辣椒素對足三里穴的刺激都屬于傷害性刺激，都能通過上述通道傳入中樞，實(shí)驗(yàn)中有同一神經(jīng)元對兩種刺激產(chǎn)生相同效應(yīng)，也證實(shí)了共同通路的存在。

但是，實(shí)驗(yàn)還提示，49 ℃艾灸足三里穴區(qū)30 s引起的脊髓背角神經(jīng)元響應(yīng)，與0.01M辣椒素150 μL足三里穴位注射引起的脊髓背角神經(jīng)元響應(yīng)，還存在不完全一致的差異。這種差異，主要表現(xiàn)在：1)不是全部辣椒素敏感的神經(jīng)元，都響應(yīng)艾灸49 ℃艾灸；2)有部分響應(yīng)49 ℃艾灸的神經(jīng)元，對辣椒素穴位注射不敏感；3)49 ℃艾灸足三里穴和0.01M辣椒素穴位注射，也可以分別引起神經(jīng)元的抑制作用。我們分析認(rèn)為，導(dǎo)致這種差異的原因，一方面可能與足三里穴刺激方式和刺激量有關(guān)，另一方面也與脊髓背角的神經(jīng)元類型有關(guān)。高溫?zé)峋拇碳こ司哂袦責(zé)崽匦阅艽蜷_TRPV1通道外，還可以引起受刺激局部體表組織中某些生物活性物質(zhì)含量的改變，如H+、組胺、緩激肽等，這些物理化學(xué)刺激均可以被感覺神經(jīng)末梢上相應(yīng)的離子通道(受體)所感知；還能在施灸穴位局部皮膚中產(chǎn)生與皮膚免疫相關(guān)蛋白物質(zhì)如MhC-、IL-12、CD80等，這些高溫艾灸產(chǎn)生的物質(zhì)傳入中樞的通路或許就是與辣椒素通路存在差異的地方之一。本次實(shí)驗(yàn)，僅采用了49 ℃30 s艾灸足三里與0.01M辣椒素150 μL穴位注射的比較，無論是艾灸的溫度、艾灸的持續(xù)時間，都存在可變性，尚需要在今后的研究中進(jìn)一步探究艾灸刺激方式和刺激量與脊髓背角神經(jīng)元響應(yīng)的量效關(guān)系。

綜上所述，高溫?zé)峋牡膫鲗?dǎo)通路部分是由辣椒素敏感的C纖維介導(dǎo)，并且在脊髓背角部分辣椒素敏感性神經(jīng)元得到響應(yīng)。但是，高溫?zé)峋脑诩顾璞辰巧窠?jīng)元響應(yīng)中也存在獨(dú)特的效應(yīng)規(guī)律，其機(jī)制和原理，尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持。

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(2016-12-07收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Moxibustion in Conduction Response Pathway between Zusanli and Spinal Cord

Wang Ming1，Cai Hui1，Wu Huangan2，Yu Zhi1，Wang Xinjun1，Chen Zhiyu1，Jin Chuanyang1，Zhang Jianbin1,3

(1NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 2ShanghaiUniversityofChinsesMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China; 3JiangsuSecondHospitalofChineseMedicine,Nanjing210017,China)

Objective:To study the relationship between the afferent pathway of moxibustion and the response of dorsal horn neurons of the spinal cord, warming the meridians to eliminate stagnation. Methods:There were 40 Adult male SD rats selected, extracellular recording the activity of spinal dorsal horn neurons of L4by glass microelectrode (discharge frequency), given intramuscular injection of 150 μl 0.01M capsaicin at Zusanli and at 49 degrees for 30 s to observe the changes of different neuron discharge before and after different stimulation. Results:1)Spinal dorsal horn neurons gave response to capsaicin stimulation, which was characterized by excitatory effect.2)49 degrees of moxibustion at Zusanli point and capsaicin injection could converge on the same neurons in the dorsal horn of spinal cord．3)The response of spinal dorsal horn neurons to the 49 degrees of moxibustion were inconsistent with that of capsaicin injection at Zusanli. Conclusion:The afferent pathway and the spinal cord response with high temperature moxibustion were mediated by capsaicin sensitive C fibers and TRPV1 channels partially.

Moxibustion；Capsaicin；Conductive pathway；Zusanli(ST36)

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973”計(jì)劃)項(xiàng)目(編號：2009CB522905；2015CB554501)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81373750)

王明(1992—)，女，漢族，江蘇常州人，2010級針灸推拿七年制在讀生

張建斌(1967—)，男，漢族，江蘇無錫人，研究方向：針灸理論的臨床應(yīng)用，E-mail：zhangjianbin@njucm.edu.cn

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.008