溫和灸對慢性內(nèi)臟痛敏模型大鼠結(jié)腸CRFR2表達的影響

戚 莉 易 韜 張建斌 常小榮 楊 玲 劉慧榮 豐曉溟 吳煥淦

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，上海，201203； 3 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海，200040； 4 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京，210023； 5 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙，410208)

溫和灸對慢性內(nèi)臟痛敏模型大鼠結(jié)腸CRFR2表達的影響

戚 莉1,2易 韜3張建斌4常小榮5楊 玲1劉慧榮1豐曉溟1吳煥淦1

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科學(xué)E-研究院，上海，201203； 3 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海，200040； 4 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京，210023； 5 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙，410208)

目的：觀察溫和灸對慢性內(nèi)臟痛敏(Chronic Visceral Hyperalgesia，CVH)模型大鼠行為學(xué)及結(jié)腸組織促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子2型受體(Corticotrophin Releasing Factor Receptor 2，CRFR2)蛋白及其mRNA表達的影響。方法：采用乳鼠結(jié)直腸擴張(Colorectal Distention，CRD)刺激建立CVH大鼠模型，模型制備成功后選取雙側(cè)天樞、上巨虛穴分別進行溫和灸及假灸干預(yù)，1次/d，連續(xù)7 d。全部干預(yù)結(jié)束后，以腹部撤回反射(Abdominal Withdrawl Reflex，AWR)評分作為檢測大鼠內(nèi)臟痛敏的行為學(xué)指標(biāo)；采用免疫組織化學(xué)法、實時熒光定量PCR法觀察結(jié)腸組織CRFR2蛋白及其mRNA的表達。結(jié)果：在不同強度的CRD刺激下，與正常組相比，模型大鼠AWR評分升高(P<0.01)。溫和灸組干預(yù)后，大鼠AWR評分下降(P<0.01)。模型組大鼠CRFR2蛋白及其mRNA表達均高于正常組(P<0.01)，溫和灸干預(yù)后，CRFR2蛋白及其mRNA表達進一步升高(P<0.01)。假灸組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：溫和灸有效緩解CVH模型大鼠內(nèi)臟痛敏狀態(tài)，與其升高結(jié)腸組織CRFR2蛋白及其mRNA的表達有關(guān)。

溫和灸；慢性內(nèi)臟痛敏；結(jié)腸；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子2型受體；大鼠

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適伴排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鞯墓δ苄阅c病。近年來，由慢性內(nèi)臟痛敏(Chronic Visceral Hyperalgesia，CVH)被認(rèn)為可能是產(chǎn)生IBS癥狀(腹痛和腸道動力異常等)的主要原因[1-4]。但其確切的神經(jīng)生物學(xué)機制尚不清楚。有研究認(rèn)為，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子2受體(Corticotrophin Releasing Factor Receptor 2，CRFR2)在內(nèi)臟痛覺信號傳導(dǎo)過程中起到重要調(diào)節(jié)作用，CRFR2信號途徑的激活可緩解結(jié)腸擴張導(dǎo)致的內(nèi)臟痛敏[4-5]。課題組前期研究顯示[6]，在乳鼠結(jié)直腸擴張(Colorectal Distention，CRD)刺激建立的CVH模型大鼠，結(jié)腸組織CRF(Corticotrophin Releasing Factor，CRF)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子1受體(Corticotrophin Releasing Factor Receptor 1，CRFR1)蛋白及mRNA表達升高，而溫和灸干預(yù)降低結(jié)腸組織異常升高的CRF、CRFR1蛋白及mRNA表達。那么，在IBS慢性內(nèi)臟痛敏大鼠模型，CRFR2是否存在關(guān)鍵性作用？基于此模型，本研究率先從結(jié)腸組織CRFR2角度探討溫和灸緩解IBS慢性內(nèi)臟痛敏的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD(Sprague Dawley)新生大鼠(出生后5 d)，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。每8～10只乳鼠與母鼠同籠直到28 d，鼠乳喂養(yǎng)，母鼠自由飲食。3 d后，無不良反應(yīng)乳鼠，納入實驗。

1.2 主要試劑與儀器 特制細(xì)艾條(南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司)，組織脫水機(TP1020型，德國徠卡公司)，石蠟包埋機(EG1160)，組織切片機(RM2235型，德國徠卡公司)，封片機(GV5030型，德國徠卡公司)，Rabbit anti-CRFR2(Abcam)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Canon PowerShot A640(日本佳能公司)，Gene Cycler PCR擴增儀(美國伯樂Bio-rad公司)，Real-time檢測儀(7500Sequence Detection System，Applied Biosystems美國)，qPCRTMCore Kit(Shanghai DaWei′K Biology Technology Co.Ltd)，Motic圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪視野集團有限公司)。

1.3 模型制備 造模大鼠在出生后第8～21天，在清醒狀態(tài)下，每天上午固定時間接受1次CRD刺激。具體操作如下[7]：使用自制的刺激球囊(氣囊在實驗前應(yīng)充氣過夜)，蘸少許石蠟油，自肛門內(nèi)輕柔插入。避免粗暴操作，深度約1～2 cm，大致達到大鼠的降結(jié)腸部位。球囊充氣0.2 mL，產(chǎn)生局部的擴張，持續(xù)1 min，撤氣，緩慢抽出刺激球囊。連續(xù)2周造模結(jié)束后，繼續(xù)飼養(yǎng)至第6周，隨機抽取2只正常大鼠、2只造模大鼠，進行一般情況觀察、AWR評分、結(jié)腸病理組織學(xué)觀察，以確定模型是否成功。

1.4 分組與治療 確認(rèn)模型成功后，大鼠隨機分為4組：溫和灸組，假灸組，模型組，正常組，每組8只。溫和灸組大鼠選取雙側(cè)天樞、上巨虛穴進行干預(yù)，以特制動物用艾條，點燃懸于穴位上約2 cm處施灸，1次/d，每次每穴溫和灸10 min，共7 d。假灸組大鼠選取雙側(cè)天樞、上巨虛穴進行假干預(yù)，以特制動物用艾條，點燃倒置，懸于穴位上約2 cm處施灸，1次/d，每次每穴溫和灸10 min，共7 d。正常組與模型組大鼠做與其他組相同的固定，不做任何干預(yù)。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 內(nèi)臟痛敏反應(yīng)測定 在全部干預(yù)結(jié)束后15～90 min內(nèi)對大鼠行急性CRD刺激，對AWR進行半定量評分，檢測大鼠慢性內(nèi)臟痛敏。CRD刺激與AWR評分方法如前所述[7]，相應(yīng)的AWR評分標(biāo)準(zhǔn)參照Al-chaer的方法[8]：對CRD無行為反應(yīng)，評為0分；給予刺激，大鼠有動作停頓并見短暫的頭部運動行為，評為1分；刺激期間，見有腹部肌肉的收縮，評為2分；如有腹部抬起行為，評為3分；身體拱起，并抬起盆腔和陰囊者，評為4分。

1.5.2 結(jié)腸組織CRFR2免疫組織化學(xué)檢測及圖像分析 自肛門向上約5 cm處取長1 cm的降結(jié)腸標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加適當(dāng)稀釋的一抗(Rabbit anti-CRFR2 1∶100)，滴加EnVision試劑，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。運用Motie Med 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析處理。陽性目標(biāo)呈棕黃色表達。每份樣本隨機取3個非重疊視野，取其平均值為該樣本陽性目標(biāo)積分光密度，分析過程中所有切片光源強度均相同。

1.5.3 結(jié)腸組織CRFR2mRNA實時熒光定量PCR檢測 1)PCR引物、探針序列CRFR2上游引物5′-TGAACCCATTTTGGATGACA-3′，下游引物5′-GTTGATGATGAGGGCGATTC-3′，長度206bp；GAPDH上游引物5′-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3′，下游引物5′-GCTGTTGAGTCACAGGAGCAA-3′，長度106bp；2)組織總RNA的抽提；3)逆轉(zhuǎn)錄cDNA；4)定量PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 溫和灸對CVH模型大鼠行為學(xué)的影響 如表1所示，在不同強度(20、40、60、80 mmHg)的CRD刺激下，與正常組大鼠相比，模型組AWR評分增加(P<0.01)。與模型組大鼠相比，溫和灸組大鼠AWR評分降低(P<0.01)。假灸組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 溫和灸對CVH模型大鼠結(jié)腸組織CRFR2表達的影響 CRR2免疫反應(yīng)陽性組織主要分布在腸黏膜上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞，黏膜固有層的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及纖維組織處，黏膜下及肌層也可見。正常組大鼠結(jié)腸黏膜有少量CRFR2陽性表達，染色較淺。模型組CRFR2陽性表達增加，密集分布于腺體周圍，染色加深，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。溫和灸組大鼠CRFR2呈強陽性表達，染色為棕黃色，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。假灸組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1，表2)。

表1 各組大鼠AWR評分比較(n=8)

注：**P<0.01,*P<0.05 vs 正常組；△△P<0.01 vs 模型組。

圖1 各組大鼠結(jié)腸CRFR2表達(免疫組化)

注：A:正常組；B:模型組；C:溫和灸組；D:假灸組(×200)。

表2 各組大鼠結(jié)腸CRFR2表達的比較

注：**P<0.01 vs 正常組；△△P<0.01 vs 模型組。

2.3 溫和灸對CVH模型大鼠結(jié)腸組織CRFR2mRNA表達的影響 如表3，圖2所示，與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織CRFR2 mRNA的相對表達升高(P<0.05)。與模型組相比，溫和灸組大鼠結(jié)腸組織CRFR2 mRNA的相對表達進一步升高(P<0.05)。假灸組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 各組大鼠結(jié)腸CRFR2mRNA表達比較

注：**P<0.01,*P<0.05 vs 正常組；△P<0.05 vs 模型組。

圖2 各組大鼠結(jié)腸CRFR2mRNA擴增動力學(xué)曲線

3 討論

研究表明，CRF是導(dǎo)致IBS發(fā)病的關(guān)鍵因素[9-10]。CRF通過與CRF受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，眾多研究提示：CRF-CRFR1信號途徑與應(yīng)激導(dǎo)致的CVH相關(guān)[11-12]。與CRFR1相比，CRFR2的功能研究較少，主要集中于情志疾病如抑郁、焦慮等的研究。報道顯示：CRFR2的激活在減少壓力與焦慮中起到重要的作用[13-15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，CRFR2的激活可以減少清醒大鼠結(jié)直腸擴張引起的內(nèi)臟痛敏[5,16]。

在利用乳鼠CRD刺激建立的CVH模型大鼠上，我們發(fā)現(xiàn)，CRFR2免疫反應(yīng)陽性組織主要分布在腸黏膜上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞，黏膜固有層的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及纖維組織處，黏膜下及肌層也可見，模型組CRFR2蛋白及其mRNA表達高于正常大鼠，提示結(jié)腸組織CRFR2在IBS大鼠慢性內(nèi)臟痛敏形成和調(diào)制中起重要作用。溫和灸干預(yù)后，大鼠結(jié)腸組織CRFR2蛋白及起mRNA表達進一步升高，提示結(jié)腸組織CRFR2參與了溫和灸干預(yù)CVH大鼠的過程。升高CRFR2的表達是溫和灸緩解IBS大鼠內(nèi)臟痛敏的機制之一。結(jié)合課題組前期研究結(jié)果[6,17]，CRFR2在結(jié)腸組織的分布與CRF、CRFR2具有一致性，我們推測，在傷害性刺激(急性CRD刺激)下，應(yīng)激促使外周結(jié)腸CRF大量表達，其分別與CRFR1和CRFR2結(jié)合，CRF-CRFR1信號途徑的激活導(dǎo)致內(nèi)臟痛敏，CRF-CRFR2信號途徑的激活緩解內(nèi)臟痛敏。在IBS樣慢性內(nèi)臟痛敏過程中，CRF-CRFR1信號途徑占優(yōu)勢。溫和灸干預(yù)刺激下，抑制CRF-CRFR1信號途徑，進一步激活CRF-CRFR2信號途徑，CRF-CRFR2信號途徑占優(yōu)勢，從而發(fā)揮緩解CVH的作用。

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(2016-12-07收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

Warming Moxibustion′s Effect on Chronic Visceral Hyperalgesia and Expression of CRFR2 in Colon of Rats

Qi Li1,2,Yi Tao3, Zhang Jianbin4, Chang Xiaorong5,Yang Ling1,Liu Huirong1,Feng Xiaoming1，Wu Huangan1

(1ShanghaiInstituteofAcupuncture-MoxibustionandMeridian,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200030,China; 2E-InstituteofShanghaiMunicipalEducationCommittee,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 3InstituteofIntegrativeMedicine,HuashanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China; 4NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023,China; 5HunanuniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Objective:To observe the anti-CVH effect of warming moxibustion and its influence on the expression of CRFR2 (protein and mRNA) in the colon. Methods:CVH rat model induced by mechanical colorectal distention (CRD) and abdominal withdrawal reflex (AWR) scores were assessed by acute CRD after warming moxibustion treatment. The protein and mRNA expressions of CRFR2 in the colon were determined by immunohistochemistry and real-time PCR, respectively. Results:Warming moxibustion markedly attenuated the abdominal withdrawal reflex (AWR) scores in response to acute CRD in IBS rats; The expressions of CRFR2 (protein and mRNA) in the colon were significantly increased in the model rats than in the normal rats. Warming moxibustion increased the expression of CRFR2 (protein and mRNA) in the model rats. Conclusion:WM treatment may attenuate CRD-induced CVH in rats and this effect may be related to WM upregulation of colonic CRFR2.

Warming moxibustion; Chronic visceral hyperalgesia; Irritable bowel syndrome; Corticotrophin releasing factor receptor 2; Colon

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81303031;81303034;81403472)；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(“973”計劃)資助項目(編號：2009CB522900)；上海市針灸機制與穴位功能重點實驗室資助(編號：14DZ2260500)

吳煥淦(1956—)，男，博士，首席教授，研究方向：灸法作用的基本原理與應(yīng)用規(guī)律研究，E-mail:wuhuangan@126.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.12.005