霍甫水絲蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)擾動(dòng)下沉積物-水界面pH值的二維、高分辨分布特征*

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霍甫水絲蚓(Limnodrilushoffmeisteri)擾動(dòng)下沉積物-水界面pH值的二維、高分辨分布特征*

(1：中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京210008)

(2：中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

摘要：采用平面光電極技術(shù)研究了霍甫水絲蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)擾動(dòng)對(duì)湖泊沉積物-水界面二維pH值分布特征的影響.結(jié)果表明水絲蚓擾動(dòng)能將沉積物-水界面處pH值的變化梯度由2.5 mm內(nèi)降低1.6個(gè)pH值單位減緩至約1 cm內(nèi)降低0.6個(gè)pH值單位，并在界面處形成約1 cm深的pH值緩沖區(qū)域.水絲蚓的造穴活動(dòng)也會(huì)對(duì)沉積物的二維pH值分布產(chǎn)生影響，洞穴內(nèi)的pH值高于洞穴周邊沉積物約0.6個(gè)pH值單位。

關(guān)鍵詞：二維分布；pH值；平面光電極；生物擾動(dòng)；霍甫水絲蚓

pH值是表征水環(huán)境地球化學(xué)性質(zhì)的重要參數(shù)，在控制有機(jī)質(zhì)的礦化、內(nèi)源污染物的釋放[1]、營(yíng)養(yǎng)鹽的循環(huán)[2]等過程中具有重要作用.湖泊沉積物具有非常顯著的空間異質(zhì)性，在沉積物界面發(fā)生的各種生物、物理、化學(xué)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致pH值在微尺度呈現(xiàn)強(qiáng)烈的梯度變化[2-3],因此高分辨獲取pH值的分布信息及動(dòng)力學(xué)變化是深入了解沉積物生物地球化學(xué)循環(huán)的關(guān)鍵。

傳統(tǒng)的pH值測(cè)定方法包括試紙法和clark玻璃電極法[4]，這兩種方法簡(jiǎn)便易行，適用于溶液pH值測(cè)定，很難應(yīng)用于沉積物-水界面微環(huán)境的測(cè)定.近年來，微電極法在沉積物-水界面pH值實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用變得比較廣泛[5]，擁有較高的準(zhǔn)確度和精密度，但是其測(cè)量體系復(fù)雜、造價(jià)過高、電極過于脆弱的缺點(diǎn)限制了其大規(guī)模的推廣應(yīng)用.隨后出現(xiàn)了光纖感應(yīng)器，其主要原理是基于熒光或磷光分析原理，將對(duì)分析物敏感指示劑固定在玻璃電極尖端，通過分析物對(duì)尖端指示劑的光學(xué)性質(zhì)的改變來測(cè)定分析物的濃度.光纖傳感器可以媲美微電極，而且成本較低、操作程序快捷、穩(wěn)定性好[6].盡管如此，無論是微電極還是光纖感應(yīng)器，均采用單點(diǎn)測(cè)試，獲取批量數(shù)據(jù)或者剖面pH值數(shù)據(jù)，需要通過探頭上下移動(dòng)，因此耗時(shí)且操作繁瑣.在光纖傳感器基礎(chǔ)上，平面光電極法測(cè)量pH值是應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的一種平面測(cè)量方法，由于其具有良好的操作性以及可以測(cè)量二維平面的pH值變化被引入環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域[7-9]。

生物擾動(dòng)是底棲動(dòng)物影響沉積物-水界面物質(zhì)與能量交換的主要過程之一，不僅可以改變沉積物的粒徑、容重、滲透率等物理指標(biāo)，也可以改變沉積物原有的生物分布、化學(xué)反應(yīng)速率等生化指標(biāo)[10].例如Pischedda等研究表明沙蠶擾動(dòng)可以增加沉積物溶解氧(DO)濃度并顯著改變沉積物中DO的分布特征[11].目前對(duì)于生物擾動(dòng)影響沉積物-水界面pH值的研究較少，且多集中于海洋沉積物方面，淡水沉積物方面的研究有限.沈萬斌等研究了顫蚓擾動(dòng)對(duì)沉積物-水界面pH值的影響[12]，指出顫蚓擾動(dòng)對(duì)沉積物中pH值時(shí)空變化的影響較小而對(duì)上覆水的影響較大，但是作者未能明確地給出顫蚓對(duì)沉積物-水界面pH值影響能力、影響范圍的大小.霍甫水絲蚓(Limnodrilushoffmeisteri)是富營(yíng)養(yǎng)化湖泊中大量出現(xiàn)的底棲動(dòng)物，缺氧條件下依然能夠存活[10].霍甫水絲蚓在太湖分布廣泛，在重污染區(qū)域沉積物中的密度可達(dá)25120 ind./m2[13].本研究擬利用平面光電極技術(shù)，二維、高分辨地探討霍甫水絲蚓擾動(dòng)對(duì)沉積物-水界面的pH值分布特征的影響，研究結(jié)果為闡明湖泊的內(nèi)源污染和有機(jī)物的礦化等過程提供重要科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 平面光電極原理

平面光電極的基本原理是基于特定熒光染料與不同濃度的待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，熒光物質(zhì)的強(qiáng)度或者壽命發(fā)生改變，利用熒光強(qiáng)度或者壽命改變的量來定量反映待測(cè)物質(zhì)的濃度[14].將熒光染料制成平面?zhèn)鞲心ず?，通過采集和處理平面?zhèn)鞲心さ膱D片，可以得到待測(cè)物質(zhì)在二維尺度上的濃度變化圖像.激發(fā)光源是發(fā)出特定波長(zhǎng)的光來激發(fā)平面?zhèn)鞲心?，平面?zhèn)鞲心な芗ぐl(fā)光照射后產(chǎn)生發(fā)射光，利用照相機(jī)作為圖像采集器采集發(fā)射光的二維數(shù)據(jù)并以圖片形式保存，最后利用軟件將圖片處理成為待測(cè)物質(zhì)濃度的二維圖像。

1.2 平面光電極材料

選取8-羥基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(HPTS)染料作為pH值的響應(yīng)染料，HPTS是一種常用的pH值熒光指示染料[15]，具有高量子產(chǎn)率、較大的stocks位移、良好的水溶性、較快的響應(yīng)時(shí)間(<120 s)[2]以及對(duì)生物無毒害作用等優(yōu)良特點(diǎn).該染料對(duì)pH值的靈敏響應(yīng)范圍在5.5~8.5之間[2]，淡水湖泊水體和沉積物的pH值與該染料的pH值響應(yīng)范圍契合，因此選擇HPTS作為本實(shí)驗(yàn)的pH值熒光染料.平面?zhèn)鞲心さ闹谱鲄⒖糧hu等的方法[2]，簡(jiǎn)述如下：HPTS染料經(jīng)過與五氯化磷的加成反應(yīng)，其分子中被加入磺?；鶊F(tuán)，形成分子團(tuán)A.將碳碳雙鍵負(fù)載至平面基材(聚酯薄膜)表面.在過硫酸銨(APS)和TEMED的催化作用下，染料分子團(tuán)A與碳碳雙鍵加成，被固定在平面基材表面，制成熒光染料均勻分布、總厚度約150 μm(含聚酯薄膜130 μm)的平面感應(yīng)薄膜。

1.3 平面光電極系統(tǒng)及圖像處理方法

平面光電極系統(tǒng)由激發(fā)光源、平面感應(yīng)膜、圖片獲取裝置以及圖片處理裝置構(gòu)成(圖1).本研究采用中心波長(zhǎng)為400和450 nm的LED燈(20 W，深圳天耀)作為激發(fā)光源.圖片獲取裝置采用佳能600 D相機(jī)，配置Sigma 50 mm F2.8 EX DG 微距鏡頭，鏡頭前加裝540 nm長(zhǎng)波通濾光片(深圳激埃特光學(xué)).pH值感應(yīng)薄膜經(jīng)激發(fā)光照射后，釋放560 nm波長(zhǎng)的光，經(jīng)過濾光片過濾后被相機(jī)獲取.目前平面光電極技術(shù)采用的定量方法主要有3種：熒光強(qiáng)度定量、強(qiáng)度比率定量和熒光壽命定量.熒光強(qiáng)度定量方法簡(jiǎn)單易行，但缺點(diǎn)也很明顯，容易受到背景光的干擾[16]；熒光壽命定量方法雖然精確，但是其設(shè)備體系復(fù)雜、造價(jià)過高、操作不便[17].本實(shí)驗(yàn)采用的是基于熒光強(qiáng)度比率定量的RGB三色參比法進(jìn)行圖形數(shù)據(jù)處理方法.該方法主要是通過獲取RAW圖像，利用圖像處理軟件將拍攝圖像的G通道的熒光強(qiáng)度值提取出來.將兩個(gè)不同波長(zhǎng)激發(fā)光源(400和450 nm)照射后產(chǎn)生的釋放光圖片G通道熒光強(qiáng)度做比率值，得到的比率值與pH值相對(duì)應(yīng)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以上操作通過計(jì)算機(jī)使用ImageJ軟件進(jìn)行.本實(shí)驗(yàn)中相機(jī)的有效像素分辨率為5184×3456，成像傳感器尺寸為22.3 mm×14.9 mm，拍照時(shí)放大倍數(shù)為5倍，因此可以獲得圖片分辨率為21.5 μm×21.5 μm的pH值二維分布圖.與傳統(tǒng)的pH值測(cè)定方法如微電極相比，本方法可以獲取二維pH值分布特征圖像并提供更高的分辨率，有利于檢測(cè)微尺度內(nèi)pH值的變化。

圖1 平面光電極系統(tǒng)裝置示意Fig.1 Schematic of the optical set-up in this study

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

研究樣點(diǎn)位于太湖梅梁灣(31°30′31″N, 120°10′31″E)，于2014年10月12日用彼得森采泥器抓取表層沉積物，并利用重力采水器采集深度1.2 m處的水樣.采樣后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，將沉積物和水樣一起放入聚乙烯材質(zhì)的整理箱中,將濕沉積物過300目的篩網(wǎng)以去除水絲蚓，對(duì)上覆水進(jìn)行曝氣培養(yǎng)，光照比為12 h∶12 h，白天開啟日光燈強(qiáng)度約為100 lx，晚上測(cè)試室用遮光布遮擋住外部光線.室溫控制在20±2℃。

霍甫水絲蚓和沉積物一同從太湖中采集，帶回實(shí)驗(yàn)室對(duì)上覆水進(jìn)行曝氣培養(yǎng)以保證上覆水中的溶解氧充足，培養(yǎng)一周后連同沉積物取出放入300目的篩網(wǎng)中，將沉積物洗凈，篩網(wǎng)中的剩余物(主要為植物殘?bào)w和底棲動(dòng)物)倒入托盤中，挑取其中體長(zhǎng)約3~4 cm、生長(zhǎng)程度相對(duì)均一、活性較強(qiáng)的霍甫水絲蚓成蟲裝入5 ml離心管中，20℃保溫待用。

裝有沉積物的有機(jī)玻璃盒子尺寸為10 cm(長(zhǎng))×8 cm(寬)×10 cm(高)，盒子的前端擋板材質(zhì)為透紫外光石英玻璃(10 cm×10 cm×2 mm).實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將HPTS平面感應(yīng)膜貼在石英玻璃上，排除所有氣泡，并在膜邊緣處用防水膠帶密封.將充分混勻的沉積物緩慢放入有機(jī)玻璃盒子中以保證沉積物中沒有氣泡，填充后沉積物的深度約為5 cm.通過虹吸方法緩慢加入湖水，然后將黑色有機(jī)玻璃擋板(10 cm×10 cm)在石英玻璃后2 mm處緩慢插入沉積物，以這2 mm寬度空間作為霍甫水絲蚓活動(dòng)區(qū)域.將挑選好的霍甫水絲蚓個(gè)體(共5條)加入沉積物中，定期觀察其擾動(dòng)對(duì)沉積物界面二維pH值變化的影響. 分別在不同的時(shí)間通過光學(xué)系統(tǒng)(圖1)獲取沉積物-水界面平面感應(yīng)膜熒光圖片.熒光圖片經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后得到沉積物-水界面二維pH值圖像。

3 結(jié)果與討論

3.1 霍甫水絲蚓擾動(dòng)對(duì)沉積物-水界面pH值二維分布的影響

霍甫水絲蚓投加前，沉積物和上覆水有明顯分層，形成穩(wěn)定的沉積物-水界面.霍甫水絲蚓放入后，第2 d在石英玻璃板面開始有水絲蚓洞穴結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(圖2)，經(jīng)過霍甫水絲蚓擾動(dòng)2 d后的沉積物-水界面開始模糊，最大擾動(dòng)深度約為3 cm.相對(duì)于傳統(tǒng)研究方法[18]，本實(shí)驗(yàn)采用的方法能夠更直觀、清楚地觀察到水絲蚓洞穴結(jié)構(gòu)以及擾動(dòng)軌跡。

圖2 霍甫水絲蚓擾動(dòng)前后熒光照片對(duì)比Fig.2 Fluorescent images before and after the bioturbation of Limnodrilus hoffmeisteri

圖3 霍甫水絲蚓擾動(dòng)作用對(duì)沉積物-水界面二維pH值分布變化，圖3A到圖3H分別為第0 d(即未投放霍甫水絲蚓)至第7 d的二維pH值圖像Fig.3 2D pH distribution pattern of sediment and water interface before (A) and after (B-H) bioturbation of Limnodrilus hoffmeistteri, from A to H were day 0 to day 7

霍甫水絲蚓擾動(dòng)后對(duì)沉積物-水界面的二維pH值影響如圖3所示.總體而言，上覆水的pH值較高，最高值達(dá)到8.4，而沉積物底部的pH值較低，只有6.6，在2~3 cm深度內(nèi)pH值降低了約1.8個(gè)單位.未加霍甫水絲蚓時(shí)，沉積物-水界面上下的pH值分布特征非常明顯，呈現(xiàn)上覆水高、沉積物低的趨勢(shì)(圖3A)，pH值變化梯度十分劇烈，在界面處約0.5 cm深度內(nèi)降低約1.2個(gè)pH值單位.加入霍甫水絲蚓后(圖3B)，由于霍甫水絲蚓短時(shí)間內(nèi)需要適應(yīng)新環(huán)境，所以沉積物pH值并沒有明顯變化，但是沉積物-水界面已經(jīng)開始變得模糊，這是由于霍甫水絲蚓的擾動(dòng)增大了沉積物-水界面面積[19]，為沉積物和上覆水中物質(zhì)交換提供了場(chǎng)地條件.第2 d開始，霍甫水絲蚓的生命活動(dòng)強(qiáng)度明顯增加，石英玻璃板壁出現(xiàn)明顯的水絲蚓洞穴軌跡，上覆水進(jìn)入沉積物中并引起了部分沉積物pH值的升高，之后的5 d內(nèi)，由于霍甫水絲蚓生命活動(dòng)的不斷進(jìn)行，沉積物-水界面的pH值分布特征已經(jīng)有明顯改變，最終在表層沉積物中形成了1 cm深的pH值緩沖區(qū)域.沉積物-水界面的pH值呈現(xiàn)以上變化主要有兩個(gè)原因：一方面是隨著霍甫水絲蚓適應(yīng)環(huán)境后不斷地進(jìn)行造穴活動(dòng)，在已形成的和遺棄的洞穴中必然會(huì)被引灌入上覆水[19]，導(dǎo)致洞穴中的pH值明顯高于周邊沉積物的pH值，隨著洞穴數(shù)量的不斷增加，沉積物-水界面處就形成了1 cm的pH值緩沖區(qū)域；另一方面是在實(shí)驗(yàn)過程中可以觀察到相對(duì)均勻尺寸的顆粒逐漸在上覆水底部形成，這可能是由于霍甫水絲蚓的排泄物和搬運(yùn)作用產(chǎn)生沉積物顆粒，這樣的混合作用可以使得上覆水與沉積物的pH值趨向均一[19].本研究發(fā)現(xiàn)水絲蚓洞穴能在沉積物表層引起約0.6個(gè)pH值單位的降低，并形成約1 cm深的pH值過渡區(qū)域.Lewandowski等[20]認(rèn)為水絲蚓可將底層沉積物運(yùn)送至表層，增加了上覆水與底層沉積物的接觸，這也會(huì)使水絲蚓改造后的沉積物在表層出現(xiàn)一個(gè)pH值緩沖區(qū)域.Zhu等[21]研究了沙蠶對(duì)海水沉積物-水界面二維pH值的改變，表明沙蠶通過掘穴行為將上覆海水引入到洞穴中，使得沉積物-水界面面積變大，并使表層沉積物在2.5 mm深度內(nèi)的pH值產(chǎn)生了約0.4個(gè)pH單位的升高。

霍甫水絲蚓擾動(dòng)會(huì)對(duì)沉積物-水界面pH值產(chǎn)生顯著影響(圖4).未加霍甫水絲蚓時(shí)，沉積物-水界面pH值具有強(qiáng)烈的梯度變化，界面上2.5 mm水體中pH值呈堿性，較穩(wěn)定，約為8.4，界面下2.5 mm深度內(nèi)降低至7.5.加入霍甫水絲蚓后，上覆水pH值逐漸下降，至第7 d時(shí)穩(wěn)定在約8.1，界面下2.5 mm內(nèi)沉積物的pH值由未加霍甫水絲蚓時(shí)的7.5上升至霍甫水絲蚓擾動(dòng)6 d后的7.8.經(jīng)過水絲蚓擾動(dòng)6 d后，在沉積物-水界面處5 mm深度(界面上、下各2.5 mm)內(nèi)，pH值的變化梯度得到顯著緩和.這很有可能是由于霍甫水絲蚓擾動(dòng)增大表層沉積物的含水率，即部分上覆水進(jìn)入到表層沉積物中，使表層沉積物中的氫離子與上覆水中的氫離子發(fā)生交換，從而緩和上覆水與表層沉積物的pH值變化梯度[22].生物擾動(dòng)帶來的沉積物交換還可能導(dǎo)致沉積物中腐植酸等成分發(fā)生上下移動(dòng)，這也會(huì)影響沉積物中的pH值分布.Rao等[23]用微電極研究了沙蠶擾動(dòng)前后沉積物-水界面處的pH值變化特征，發(fā)現(xiàn)沙蠶擾動(dòng)后，沉積物-水界面下1~5 mm深度處pH值變化梯度由每1 mm降低0.4個(gè)pH單位減緩至每1 mm降低0.25個(gè)pH值單位。

圖4 霍甫水絲蚓擾動(dòng)作用對(duì)沉積物-水界面處pH值的影響(由圖3A黑色豎線位置平面光電極數(shù)據(jù)每25個(gè)數(shù)值取1個(gè)平均值繪成)Fig.4 The pH values of the extracted vertical profiles across the sedimet-water interface during the incubation

3.2 霍甫水絲蚓洞穴周邊微環(huán)境pH值變化

霍甫水絲蚓掘穴行為可以在微觀尺度上改變沉積物的pH值(圖5)，有水絲蚓洞穴的位置，pH值比洞穴周邊未被擾動(dòng)的沉積物高出0.2～0.6個(gè)pH單位，這說明霍甫水絲蚓洞穴對(duì)沉積物pH值的分布有重大影響.霍甫水絲蚓在進(jìn)行掘穴活動(dòng)時(shí)能將蚓體周圍的表層沉積物附帶輸送至沉積物底層[24]，而表層沉積物的pH值明顯高于底層沉積物，再考慮到上覆水被引灌入洞穴中，這兩個(gè)因素都導(dǎo)致洞穴內(nèi)壁的pH值明顯高于周邊的底層沉積物.生物擾動(dòng)可使各層沉積物發(fā)生交換，進(jìn)而改變其物理化學(xué)性質(zhì)，其對(duì)沉積物擾動(dòng)能力的大小可能與生物體積有關(guān)[25].沈萬斌等[12]采用平面光電極方法研究發(fā)現(xiàn)顫蚓擾動(dòng)對(duì)沉積物的pH值改變并不明顯，可能是由于圖像采集技術(shù)分辨率不高導(dǎo)致的.本實(shí)驗(yàn)采用的熒光強(qiáng)度比率值成像技術(shù)擁有較高的分辨率(21.5 μm×21.5 μm)，霍甫水絲蚓掘穴之后，遺棄的洞穴內(nèi)pH值明顯高于周邊沉積物的pH值。

相比于傳統(tǒng)方法而言，本研究采用的基于RGB熒光比率值法測(cè)定沉積物-水界面二維pH值的方法擁有高分辨率、良好的均勻性、更快的響應(yīng)時(shí)間、合理的造價(jià)、簡(jiǎn)單方便的儀器操作等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)使本方法能滿足微尺度二維pH值檢測(cè)要求，例如植物根際、底棲生物擾動(dòng)、微生物群落等實(shí)驗(yàn)環(huán)境.本方法在生物地球化學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖5 霍甫水絲蚓洞穴周邊二維pH值分布Fig.5 The 2D pH value nearby the burrow of Limnodrilus hoffmeisteri

4 結(jié)論

1) 霍甫水絲蚓擾動(dòng)對(duì)沉積物-水界面的二維pH值產(chǎn)生了明顯的變化，主要表現(xiàn)在緩和了垂直方向上pH值的變化梯度，在沉積物-水界面處產(chǎn)生了pH值變化的緩沖區(qū)域.未擾動(dòng)時(shí)，沉積物-水界面的pH值在2.5 mm 深度內(nèi)由8.4下降至7.0，霍甫水絲蚓擾動(dòng)6 d后，在沉積物-水界面處1 cm深度范圍內(nèi)pH值由8.2變?yōu)?.6。

2) 霍甫水絲蚓產(chǎn)生的洞穴可將上覆水引灌入洞穴中，使得pH值較高(8.4)的上覆水與界面下的低pH值(6.8)的沉積物直接接觸，擴(kuò)大了沉積物-水界面面積，沉積物內(nèi)部的pH值分布特征也隨著洞穴的產(chǎn)生而改變，洞穴邊緣pH值可在1 mm范圍內(nèi)由7.4降至6.9。

致謝：感謝范興旺、周永強(qiáng)在實(shí)驗(yàn)中提供的熱情幫助。

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J.LakeSci.(湖泊科學(xué))， 2016， 28(1)： 156-162

?2016 byJournalofLakeSciences

Two dimensional, high resolution distribution of pH values at sediment-water interface under bioturbation ofLimnodrilushoffmeisteri

YAO Lei1,2, HAN Chao1& DING Shiming1**

(1:StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment,NanjingInstituteofGeographyandLimnology,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,P.R.China)

(2:UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,P.R.China)

Abstract：The presented study measured the 2 dimensional pH value at sediment-water interface under the bioturbation of Limnodrilus hoffmeisteri using the planar optode technique. The result showed pH gradient was alleviated, which decreased from 1.6 pH/2.5 mm to 0.6 pH/1 cm. A 1 cm-depth buffer zone for the pH was formed in the vicinity of the sediment-water interface (SWI). The process of digging burrows by Limnodrilus hoffmeisteri had significant effects on the distribution of the pH around the SWI, and the pH in the burrow was 0.6 pH higher than that of the outside。

Keywords：Two dimensional; pH value; planar optode; bioturbation; Limnodrilus hoffmeisteri

通信作者*；E-mail: smding@niglas.ac.cn。

基金項(xiàng)目收修改稿.姚磊(1990～)，男，碩士研究生；E-mail:ayaolei@126.com。;姚磊1,2，韓超1，丁士明1

DOI10.18307/2016.0118