食品中白色念珠菌的檢測(cè)工藝

◎王 愚，李甜甜

（西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710000）

食品中白色念珠菌的檢測(cè)工藝

◎王 愚，李甜甜

（西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710000）

白色念珠菌是一種常見的真菌病原體，用不同的培養(yǎng)基對(duì)白色念珠菌進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，它所展現(xiàn)的菌落特征與其他酵母存在很大差別。在顯色培養(yǎng)基上白色念珠菌菌株呈藍(lán)綠色，并且能夠產(chǎn)生后垣孢子與芽管，在葡萄糖與麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)中能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)中只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，將10個(gè)左右的白色念珠菌放入到100 μL樣品中，白色念珠菌能夠被顯色培養(yǎng)基檢測(cè)出來(lái)。

白色念珠菌；顯色培養(yǎng)基；檢測(cè)

白色念珠菌在自然界中存在較為廣泛，又稱假絲酵母，通常寄生在人的皮膚、口腔和腸黏膜等處，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，白色念珠菌會(huì)變換生長(zhǎng)形式，侵入機(jī)體細(xì)胞，從而對(duì)人體造成傷害引發(fā)疾病。白色念珠菌的檢測(cè)方法有很多種，主要分為生化鑒定和快速檢測(cè)2種方法。一般認(rèn)為最簡(jiǎn)便的初步鑒定方法是觀察其假菌絲末端或中間是否形成典型的厚膜孢子，再結(jié)合其他生化特性加以鑒別。

目前，我國(guó)主要是參照國(guó)家藥典中的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測(cè)。首先進(jìn)行增菌培養(yǎng)，取10 mL的供試液進(jìn)行處理，將其接種至適量的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d。然后在沙氏葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)以上培養(yǎng)物1～2 d，便可以依據(jù)菌落的形態(tài)進(jìn)行鑒定。此外，動(dòng)物接種、免疫血清檢查、濕片法、PCR技術(shù)、分子雜交、顯色培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)、芽管實(shí)驗(yàn)和熒光探針快速分析法等技術(shù)均可用于檢測(cè)白色念珠菌。該試驗(yàn)利用白色念珠菌的生化特性，通過(guò)厚垣孢子實(shí)驗(yàn)、芽管形成實(shí)驗(yàn)和糖類發(fā)酵試驗(yàn)，檢測(cè)食品中的白色念珠菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烤腸、魷魚絲、銀魚、標(biāo)準(zhǔn)試劑型超純水機(jī)、精密電子天平、滅菌器、上海一恒生化培養(yǎng)箱及離心機(jī)等。

1.2 菌株及培養(yǎng)基

白色念珠菌-ATCC10231、釀酒酵母-ATCC 26603、球擬酵母-ATCC 19433。選擇沙氏瓊脂培養(yǎng)基、顯色培養(yǎng)基、TTC培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基和玉米浸粉培養(yǎng)基等。

1.3 方法

首先要使菌株活化，用接種環(huán)挑取菌苔，將其接種在36 ℃的沙氏瓊脂平板上培養(yǎng)2 d后把形態(tài)相同的菌落轉(zhuǎn)接到斜面上進(jìn)行染色，然后從斜面選取菌樣品于1 mL的無(wú)菌水中，來(lái)回震蕩使其混合均勻后對(duì)菌液進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。取50 μL上述菌液，將其均勻涂在顯色培養(yǎng)基、血瓊脂平板、TTC培養(yǎng)基、玉米浸粉培養(yǎng)基平板上，保持周圍環(huán)境溫度為28 ℃，觀察并記錄菌落的形態(tài)。然后依次進(jìn)行以下4個(gè)實(shí)驗(yàn):厚垣孢子實(shí)驗(yàn)、芽管形成實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、回收實(shí)驗(yàn)，并記錄相應(yīng)的數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

1.3.1 厚垣孢子實(shí)驗(yàn)

分別取10231白色念球菌、26603釀酒酵母、19433球擬酵母各50 μL均勻涂在1%吐溫玉米瓊脂培養(yǎng)基上，另取一份相同的1%吐溫玉米瓊脂培養(yǎng)基不作任何處理，室溫下培養(yǎng)1～2 d后觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并記錄。

1.3.2 芽管形成實(shí)驗(yàn)

分別取10231白色念球菌、26603釀酒酵母、19433球擬酵母接種到1 mL的血清中和無(wú)菌蒸餾水中，在37 ℃下培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并記錄。

1.3.3 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

分別取10231白色念球菌、26603釀酒酵母、19433球擬酵母接種在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖培養(yǎng)基和無(wú)菌蒸餾水中，在室溫下培養(yǎng)1 d，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并記錄。

1.3.4 回收實(shí)驗(yàn)

分別取烤腸、魷魚絲、銀魚各0.5 g，充分碾磨后置于離心管中，并加入無(wú)菌的生理鹽水3 mL。取等量樣品于2支無(wú)菌試管中，一支適量12301白色念球菌，另一支加入等量的無(wú)菌蒸餾水，震蕩均勻。在2支試管內(nèi)分別取50 μL樣品均勻涂布在沙氏和顯色平板上，室溫下培養(yǎng)2 d，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)

10231白色念珠菌的菌落較大、圓形、乳白色、不透明，表面光滑、菌落兩側(cè)的顏色相同;26603釀酒酵母菌落較大、圓形、乳白色、不透明，表面光滑、菌落兩側(cè)的顏色相同;19433球擬酵母菌落較小、圓形、白色、不透明，表面光滑、菌落兩側(cè)顏色相同。3種菌落都有相同的氣味。

2.2 染色結(jié)果

10231白色念珠菌，26603釀酒酵母，19433球擬酵母均在指示劑中顯陽(yáng)性。

2.3 顯色培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

10231白色念珠菌菌落較大、圓形、藍(lán)綠色、表面光滑;26603釀酒酵母菌落較大、圓形、淡粉色、表面光滑;19433球擬酵母菌落較小、圓形、粉紅色、表面光滑。

2.4 ATCC培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)

10231白色念珠菌菌落較大、圓形、乳白色、不透明且表面光滑;26603釀酒酵母菌落較小、圓形、淡粉色、不透明且表面光滑;19433球擬酵母菌落較小、圓形、淡粉色、不透明且表面光滑。

2.5 血瓊脂平板實(shí)驗(yàn)

10231白色念珠菌菌落較大、圓形、奶油色、不透明，濃酵母氣味、表面光滑;26603釀酒酵母菌落較小、圓形、白色、半透明且表面光滑;19433菌落較小、圓形、白色、半透明且表面光滑。

2.6 厚垣孢子實(shí)驗(yàn)

10231白色念珠菌有厚垣孢子形成;26603釀酒酵母無(wú)厚垣孢子形成;19433球擬酵母無(wú)厚垣孢子形成;對(duì)照組無(wú)明顯現(xiàn)象。

2.7 芽管形成實(shí)驗(yàn)

10231白色念珠菌有芽管形成;26603釀酒酵母未生成芽管;19433其球擬酵母未形成芽管;對(duì)照組無(wú)芽管形成。

2.8 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

10231白色念珠菌發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖能產(chǎn)生乳酸和二氧化碳，發(fā)酵蔗糖時(shí)只產(chǎn)生乳酸;26603釀酒酵母可以發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)生乳酸和二氧化碳; 19433球擬酵母可以發(fā)酵葡萄糖和蔗糖只產(chǎn)生乳酸不產(chǎn)生二氧化碳;對(duì)照組無(wú)明顯現(xiàn)象。

2.9 回收實(shí)驗(yàn)

10231白色念球菌回收實(shí)驗(yàn):每50 μL樣品中含5個(gè)左右白色念球菌時(shí)，白色念球菌便可以被檢測(cè)出來(lái)，而對(duì)照的實(shí)驗(yàn)樣品中沒有檢測(cè)出含有白色念球菌。

3 結(jié)論

1）在沙氏瓊脂培養(yǎng)基、玉米浸粉和血瓊脂平板上，培養(yǎng)10231白色念珠菌、26603釀酒酵母、19433球擬酵母所形成的菌落的顏色基本相同，10231白色念珠菌的菌落最大，26603釀酒酵母和19433球擬酵母的菌落相對(duì)較小;用TTC培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，形成的菌落顏色有所不同，10231白色念珠菌的菌落為乳白色，26603釀酒酵母與19433球擬酵母的菌落卻是淡粉色;當(dāng)用顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，10231白色念珠菌的菌落為藍(lán)綠色，而26603釀酒酵母與19433球擬酵母的菌落是淡粉色。

2）厚垣孢子實(shí)驗(yàn)中，只有10231白色念球菌能夠產(chǎn)生厚垣孢子;芽管實(shí)驗(yàn)中，只有10231白色念球菌能夠產(chǎn)生芽管;糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，19433球擬酵母能夠發(fā)酵葡萄糖和蔗糖只產(chǎn)生乳酸不產(chǎn)生二氧化碳，10231白色念珠菌和26603釀酒酵母能夠發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖產(chǎn)生乳酸和二氧化碳，但發(fā)酵蔗糖時(shí)只產(chǎn)生乳酸。

3）每50 μL樣品中含5個(gè)左右白色念球菌時(shí)，白色念球菌便可以被顯色培養(yǎng)基檢測(cè)出來(lái)。

4 討論

該實(shí)驗(yàn)采用厚垣孢子實(shí)驗(yàn)、TTC培養(yǎng)基培養(yǎng)法對(duì)食品中的白色念球菌進(jìn)行鑒定。TTC還原、假菌絲和厚壁孢于產(chǎn)生均為普遍采用的酵母樣真菌的重要鑒定試驗(yàn)，此三項(xiàng)指標(biāo)為鑒別白念苗與其他念珠菌的主要依據(jù)。通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改良，與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法比較，成本相對(duì)較低且操作簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)的繁瑣步驟，節(jié)省了時(shí)間，而且得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)是吻合的。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解到DNA分子雜交技術(shù)—PCR技術(shù)可用于直接檢測(cè)食品中的白色念球菌。DNA分子雜交技術(shù)的原理并不復(fù)雜，靈敏度高，但是實(shí)驗(yàn)前的一些預(yù)處理要求高，而且成本相對(duì)較高，在其他檢測(cè)領(lǐng)域也有著較大的應(yīng)用價(jià)值。白色念珠菌在苯胺藍(lán)培養(yǎng)基上顯陽(yáng)性，因而可以高效地鑒定白色念珠菌。國(guó)外已采用該培養(yǎng)基用于食品環(huán)境，臨床標(biāo)本中白色念珠菌的快速分離與鑒定，其準(zhǔn)確率達(dá)98%以上。但在中國(guó)還沒有實(shí)際的應(yīng)用?？傊瑢?duì)于食品中的白色念球菌可以用顯色培養(yǎng)基進(jìn)行簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確地鑒定。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（第二部）[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:103-107.

[2]歐陽(yáng)珂瑕，劉生峰，肖進(jìn)文，等.白色念珠菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012（8）:420-427.

Analysis the Inspection Process of Candida albicans in Food

Wang Yu, Li Tiantian
（Shanxi Institute for Food and Drug Control, Shanxi Xi'an 710000, China）

Candida albicansis a common fungal pathogen, which shows a big difference in colony characteristics with the other yeast when using different culture medium to culture. On the chromogenic strains ofCandida albicansis blue-green, and can produce chlamydospore and germ tubes, what more important is that it can produce acid and gas in glucose and maltose fermentation test, however there is only acid acid fermentation test in sucrose yield. Experimental data shows that put 10 albicans into 100 microliters of sample,Candida albicanscan be detected by chromogenic medium.

Candida albicans; Chromogenic medium; Detection

TS207.4

王愚（1982-），女，陜西西安人，本科，藥師，主要研究方向：微生物檢驗(yàn)工作；李甜甜（1984-），女，陜西西安人，本科，藥師，主要研究方向：微生物檢驗(yàn)工作。