小反芻獸疫及診斷方法的研究進(jìn)展

吳冉（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

小反芻獸疫及診斷方法的研究進(jìn)展

吳冉
（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

小反芻獸疫；診斷方法；研究進(jìn)展

小反芻獸疫是近年來對畜牧業(yè)生產(chǎn)安全造成嚴(yán)重危害的跨國動物疫病之一，在我國及周邊許多國家呈地方性流行趨勢，我國近期多個(gè)省份出現(xiàn)確診疫情，引起了國家農(nóng)業(yè)部的高度重視。

1　流行病學(xué)調(diào)查

小反芻獸疫（PPR）是一種高度接觸性傳染病，主要感染小反芻獸，尤其是山羊和綿羊。小反芻獸疫的傳染性強(qiáng)，有較高的發(fā)病率和致死率。小反芻獸疫在我國及鄰近國家頻繁發(fā)生，對畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅。健康動物主要通過與病畜直接接觸傳播，呼吸道是主要的感染途徑，該病在潮濕寒冷的季節(jié)多發(fā)。小反芻獸疫屬于一種外來動物疫病，我國于2007年7月首次確診西藏阿里地區(qū)出現(xiàn)的小反芻獸疫疫情，2013年11月，新疆幾個(gè)市縣發(fā)生了PPR疫情，疫情逐漸向內(nèi)地?cái)U(kuò)散。

2　實(shí)驗(yàn)室診斷

小反芻獸疫是一種嚴(yán)重的急性、烈性和高度接觸性傳染病，因此PPRV病毒的分離和血清學(xué)檢測等試驗(yàn)都必須在生物安全3級以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2.1病毒的分離培養(yǎng)采集病毒樣本最佳的時(shí)期是動物高熱之后腹瀉之前，可通過采取病畜的鼻腔、口腔、眼結(jié)膜、腸管等處的分泌物棉拭子，剖檢脾臟，肺臟和淋巴結(jié)等組織，也可采集病畜血液樣本。將可疑病料在原代綿羊胎腎細(xì)胞或非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）上培養(yǎng)增殖，5～6d后觀察PPRV可產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），細(xì)胞變大變圓，逐漸融合形成合胞體。

2.2中和試驗(yàn)（NT） NT是一種基于抗原抗體特異性的免疫學(xué)檢測方法，即可用已知的PPRV抗原檢測其相應(yīng)的抗體，也可用PPRV特異性抗體鑒定PPRV，通常是在原代羔羊細(xì)胞或Vero細(xì)胞上完成NT，是國際貿(mào)易中規(guī)定的PPRV診斷方法。NT方法的特異性強(qiáng)，可以用于PPRV和RPV的鑒別，也可以鑒別不同PPRV毒株之間的差異，缺點(diǎn)是檢測速度慢，很難實(shí)現(xiàn)較多樣品的檢測。

2.3凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）AGID在臨床中廣泛應(yīng)用，操作方法簡單，實(shí)驗(yàn)成本低，在野外和一般實(shí)驗(yàn)室均能操作，24h以內(nèi)可獲得結(jié)果。但是AGID試驗(yàn)的敏感性較低，當(dāng)抗原含量較低時(shí)，不容易將抗原檢測出來，所以一般不會作為診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.4對流免疫電泳（CIEP）CIEP是目前最快的一種檢測方法，由于抗原抗體在電場中做定向移動，減少了自由擴(kuò)散，在一定程度上增加了抗原抗體的濃度，使該方法具有較高的敏感性，可作為PPRV的臨床檢測的一種有用的篩選試驗(yàn)方法。但是CIEP試驗(yàn)特異性差，不能鑒別PPRV和RPV的感染。

2.5間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）Sumption等通過應(yīng)用PPRV的特異性單克隆抗體，建立了間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT），該方法可以將PPRV感染發(fā)病早期及晚期病料中的病毒抗原檢測出來，并能對PPR和RP進(jìn)行快速鑒別診斷。曲林茂等以重組的PPRV-F蛋白為抗原對家兔進(jìn)行免疫接種，制備出的多克隆抗體作為一抗用來捕獲病料中的抗原，二抗為羊抗兔的IgG，IFAT方法能夠特異性地將PPRV診斷出來。IFAT操作復(fù)雜，檢測時(shí)間長，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，因此不適用于對大量樣本進(jìn)行檢測。

2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

2.6.1競爭ELISA（c-ELISA）感染PPRV的動物的血清中有針對PPRV H蛋白和N蛋白的部分抗體，學(xué)者在其單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了競爭ELISA（c-ELISA）方法，該方法比于VNT方法方便快捷，可應(yīng)用于對大量野外樣品進(jìn)行迅速鑒定。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）指定c-ELISA為PPRV標(biāo)準(zhǔn)檢測方法之一，該方法用時(shí)較短且敏感性高，能實(shí)現(xiàn)檢測的大批量化。Choi等建立了一種快速競爭ELISA（rapid c-ELISA），用于PPR的檢測和監(jiān)控。

2.6.2夾心ELISA（s-ELISA） 夾心ELISA的原理是利用多克隆抗體能夠?qū)⑴R床樣品中的PPRV抗原捕獲，用針對PPRV-N蛋白的單克隆抗體可以對捕獲的抗原進(jìn)行檢測，基于單克隆抗體，建立了夾心ELISA方法。s-ELISA方法特異性強(qiáng)，操作方便，24h內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果，可以對臨床樣品進(jìn)行快速檢測，可用于PPR疫苗的質(zhì)量控制，但不能鑒別PPRV和RPV的感染。

2.6.3間接 ELISA（i-ELISA）由于 PPRV N蛋白的454-472位氨基酸序列具有非常強(qiáng)的免疫原性，是PPRV特有的，多肽抗體能夠特異性識別這一區(qū)域，于是Balamurugan等在多抗的基礎(chǔ)上建立了間接ELISA的方法，用c-ELISA、i-ELISA和VNT三種方法同時(shí)對1544份PPR病料進(jìn)行檢測，與c-ELISA相比，i-ELISA檢測樣品的特異性為95.09%，敏感性為90.81%；與VNT相比，i-ELISA檢測樣品的特異性和敏感性分別為100%和80%。上述研究試驗(yàn)的結(jié)果表明i-ELISA方法的特異性和敏感性比c-ELISA和VNT高，可用于PPRV的流行病學(xué)研究。

2.6.4雙抗夾心ELISA（DAS-ELISA）何紅菊等純化的PPRV單抗和多抗為基礎(chǔ)，通過棋盤法優(yōu)化條件，建立了雙抗夾心ELISA檢測方法，對臨床樣品檢測結(jié)果與RT-PCR進(jìn)行比較，驗(yàn)證了DAS-ELISA方法的特異性，靈敏性和高效性，其靈敏度為RT-PCR的1.2倍左右。DAS-ELISA方法對儀器設(shè)備要求低，通過利用特異性反應(yīng)比較高的親和素和生物素或者酶的三次放大，使該方法具有高靈敏度和特異性，可對大量臨床樣品進(jìn)行快速檢測。

2.7核酸探針雜交試驗(yàn)隨著基因在工程近年來的快速發(fā)展，PPRV的全部基因被克隆了出來，學(xué)者并在此基礎(chǔ)上建立了利用cDNA探針對核酸進(jìn)行標(biāo)記的核酸雜交方法。cDNA探針必須用32P或地高辛等進(jìn)行標(biāo)記，以檢測雙鏈復(fù)合體的PPRV基因序列。由于32P同位素的半衰期較短，放射性元素對人體危害較大和對設(shè)備防護(hù)條件要求較高等原因，使該方法不能廣泛應(yīng)用。

2.8RT-PCR方法RT-PCR是目前被廣泛應(yīng)用的一種檢測技術(shù)，特異性高，檢測所需樣品少，在短時(shí)間內(nèi)可以得到檢測結(jié)果。RT-PCR方法是1995年首次建立的，可快速鑒別PPRV和RPV。包靜月等建立了實(shí)時(shí)定量RT-PCR，可以采取病畜血液樣本進(jìn)行檢測，特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡單，且減少了PCR的污染。

2.9PCR-ELISA方法Saravanan等基于PPRV-N蛋白基因建立了一種高特異性和靈敏的PCR-ELISA檢測方法，利用RT-PCR方法擴(kuò)增地高辛標(biāo)記的336bp的產(chǎn)物，將生物素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的產(chǎn)物特異的雜交后，再用ELISA檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，可以檢測出特異性的N基因片段，該方法的靈敏度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng) PCR，敏感性也高于 s-ELISA，因此，PCR-ELISA更適用于對PPRV感染早期及后期病原的檢測，特異性高使其能夠有效鑒別PPRV和RPV。

2.10熒光抗體檢測技術(shù)蔣梅等選用PPRV Nigeria 75/1減毒疫苗株制備抗原，然后用制備出的抗原對試驗(yàn)山羊進(jìn)行免疫，以此制備出PPRV的高免血清，將免球蛋疫白（IgG）用硫酸銨鹽析法粗提出來，再用提取出的IgG制備異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的敏感性強(qiáng)，可檢測出1×106病毒稀釋度的細(xì)胞培養(yǎng)物，可在實(shí)驗(yàn)室條件下特異性鑒別PPRV和CDV，診斷過程可在24h內(nèi)完成。

2.11RT-LAMP方法李偉等建立了檢測PPRV的一步法反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）方法，該方法設(shè)計(jì)出針對PPRV-N基因的保守區(qū)域的4條引物，在Bst大片段聚合酶的作用下對DNA進(jìn)行梯狀等溫?cái)U(kuò)增。該方法的耗費(fèi)低，不需要使用PCR儀；反應(yīng)迅速，在1h內(nèi)可以完成反應(yīng)，其反應(yīng)結(jié)果易于觀察，可直接用肉眼觀察反應(yīng)管中的渾濁程度來判斷陽性與否；特異性強(qiáng)，可將PPRV和同屬的CDV鑒別出來；靈敏度比較高，最低可以將7個(gè)拷貝的病毒RNA模板檢測出來。

2.12免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA） IPMA方法的原理是通過將二抗用辣根過氧化物酶（HRP）進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記之后的二抗不僅具有與血清中的一抗特異性結(jié)合的特性，又具有酶的活性，當(dāng)二抗與一抗進(jìn)行孵育之后，再加入酶的底物，二抗上標(biāo)記的酶會與加入的底物發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生肉眼可識別的顏色。如加入的底物為3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）并產(chǎn)生紅棕色的不溶性產(chǎn)物，附著在細(xì)胞的表面，在光學(xué)顯微鏡下觀察即可判定結(jié)果并且可長期保存。

2.13PPR-LIPS法Berguido等建立了一種可以檢測PPR的熒光素酶免疫沉淀檢測方法（PPR-LIPS），該方法構(gòu)建一個(gè)將PPR-N蛋白420～525氨基酸片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞系，加入特定的熒光素酶和底物，酶與底物反應(yīng)后會產(chǎn)生熒光，熒光的強(qiáng)度與熒光素酶的活性相關(guān)。該方法具有較高的敏感性和特異性，僅需要1μL樣品即可進(jìn)行PPRV檢測，未來會是PPR血清學(xué)檢測的重要方法。

3　結(jié)　語

近年來小反芻獸疫疫情在我國許多省份不斷發(fā)生和流行，對我國及鄰近國家的動物安全和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅，因此加強(qiáng)小反芻獸疫診斷方法的研究，建立安全簡便，快速靈敏的診斷方法，對于該病的研究和預(yù)防控制都具有很重要的意義。

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10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.08.007

吳冉（1996～），河南省人，本科生，研究方向：傳染病的發(fā)生和流行