膠體金法和平板及試管凝集檢測(cè)羊布魯氏菌病的比較

何彥春，李克生，賀奮義，杜慧芬 ，錢振波，許菲菲

(1.張掖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 張掖 734000；2.蘭州雅華生物技術(shù)有限公司；3.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心)

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膠體金法和平板及試管凝集檢測(cè)羊布魯氏菌病的比較

何彥春1，李克生2，賀奮義3，*，杜慧芬2，錢振波1，許菲菲2

(1.張掖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 張掖 734000；2.蘭州雅華生物技術(shù)有限公司；3.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心)

為了驗(yàn)證免疫膠體金法(ICG)在羊布魯氏菌病檢測(cè)中的應(yīng)用效果，選擇經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)檢測(cè)出的羊陽(yáng)性和陰性血清各15份、經(jīng)試管凝集試驗(yàn)(SAT)確定的陽(yáng)性羊現(xiàn)場(chǎng)采集的耳尖全血15份，用膠體金法進(jìn)行復(fù)檢。結(jié)果表明，平板凝集檢出的15份陽(yáng)性血清用膠體金法檢出陽(yáng)性13份，符合率86.7%；平板凝集檢出的15份陰性血清用膠體金法檢出陰性15份，符合率100%；試管凝集檢出的15份陽(yáng)性樣品，現(xiàn)場(chǎng)采集耳尖血用膠體金法檢出陽(yáng)性15份，符合率100%。初步表明膠體金法具有操作簡(jiǎn)便、快速、微量等特點(diǎn), 適合于羊布魯氏菌病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

免疫膠體金法；平板凝集試驗(yàn)；試管凝集試驗(yàn)；羊布魯氏桿菌病

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人畜共患的細(xì)菌性傳染病。布魯氏菌具有高度傳染性，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類動(dòng)物疫病。該病屬自然疫源性傳染病，在世界各地分布廣泛，嚴(yán)重威脅著人和多種動(dòng)物的生命健康。近年來(lái)，我國(guó)各地動(dòng)物布病疫情反彈非常明顯，動(dòng)物布病檢測(cè)數(shù)量越來(lái)越大。動(dòng)物布病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要采用虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)2種免疫學(xué)方法。這種免疫學(xué)方法在布病監(jiān)測(cè)中起到了重要的作用，由于這2種免疫學(xué)方法均存在抗原、血清用量大, 操作步驟復(fù)雜等缺點(diǎn), 且(SAT)檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，24 h后才能出結(jié)果，不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。理想的檢測(cè)方法應(yīng)具有簡(jiǎn)便、快速、微量、敏感、特異、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。蘭州雅華生物技術(shù)有限公司研制生產(chǎn)的用作布病檢測(cè)的免疫膠體金技術(shù)(ICG)具有良好敏感性、特異性和穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證膠體金(ICG)法和虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)在動(dòng)物布病檢測(cè)中的符合情況，張掖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心聯(lián)合蘭州雅華公司開(kāi)展了本試驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1被檢樣品

2015年11月份采自甘肅省肅南縣康樂(lè)鄉(xiāng)青臺(tái)子村張某某的羊群。張某某飼養(yǎng)綿羊207只，經(jīng)虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)，檢出陽(yáng)性67只，后經(jīng)試管凝集試驗(yàn)最終確定陽(yáng)性64只，陽(yáng)性率 30.9%。試驗(yàn)用的陽(yáng)性血清、陰性血清、陽(yáng)性羊的全血，均采此該羊群。

1.2檢測(cè)試劑

布氏桿菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)，批號(hào)：201501；布氏桿菌病試管抗原、陽(yáng)性血清、陰性血清，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：201502；羊布病抗體IgG檢測(cè)試劑盒(膠體金法)，蘭州雅華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20150601。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)按照動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)(GB/ T 18646-2002)規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)。在玻片上加0.03 mL被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03mL，搖勻或用牙簽混勻，在4 min內(nèi)判定結(jié)果。

1.3.2試管凝集試驗(yàn)(SAT)按照動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)(GB/ T 18646-2002)規(guī)定的方法進(jìn)行操作，血清凝集滴度(價(jià))在在1∶50以上為陽(yáng)性，1∶25為可疑。

1.3.3免疫膠體金法(ICG)①虎紅平板凝集試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性血清用膠體金法復(fù)檢。隨機(jī)選擇15份虎紅平板凝集試驗(yàn)檢出的羊陽(yáng)性血清和陰性血清各15份用作被檢血清。羊布病抗體IgG檢測(cè)試劑盒從冰箱取出恢復(fù)至室溫，試劑盒撕開(kāi)鋁膜袋取出測(cè)試板平放，在檢測(cè)板加樣孔中加10 μL被檢血清，然后加入100 μL(2滴)樣品稀釋液。3～5 min內(nèi)觀察檢測(cè)卡中部檢視窗的結(jié)果，10 min內(nèi)結(jié)果有效。若樣品中存在布氏桿菌抗體IgG，則布氏桿菌抗體IgG與樣品吸附墊中的膠體金-抗羊IgG單抗結(jié)合物形成復(fù)合物，復(fù)合物沿硝酸纖維素膜移動(dòng)到檢測(cè)區(qū)，與檢測(cè)線上包被的布氏桿菌特異性抗原結(jié)合，多余的未被結(jié)合的結(jié)合物繼續(xù)移動(dòng)到質(zhì)控區(qū)，與質(zhì)控線上包被的羊抗鼠IgG抗體結(jié)合，反應(yīng)膜上出現(xiàn)1條紅色的檢測(cè)線和1條紅色的質(zhì)控線。即陽(yáng)性樣品在觀察窗T、C處各出現(xiàn)一條紅色線。若樣本中不存在布魯氏桿菌IgG抗體，則反應(yīng)膜只出現(xiàn)一條控制線。即陰性樣品僅在觀察窗C處出現(xiàn)一條紅色線，T區(qū)不出現(xiàn)顯色線；②試管凝集試驗(yàn)陽(yáng)性羊現(xiàn)場(chǎng)采集全血用膠體金法復(fù)檢:隨機(jī)選擇15份試管凝集試驗(yàn)陽(yáng)性樣品，根據(jù)樣品編號(hào)在羊群里找見(jiàn)對(duì)應(yīng)的羊只，現(xiàn)場(chǎng)采集耳尖血，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。除被檢樣品為耳尖鮮血10 μL外，其余過(guò)程同①。

2　結(jié)果與分析

檢測(cè)結(jié)果表明，虎紅平板凝集試驗(yàn)檢出的15份陽(yáng)性樣品，用膠體金法檢出陽(yáng)性13份，符合率86.7%；虎紅平板試驗(yàn)檢出的15份陰性樣品，用膠體金法檢出陰性15份，符合率100%；試管凝集試驗(yàn)檢出的15份陽(yáng)性樣品，現(xiàn)場(chǎng)采集耳尖血用膠體金法檢出陽(yáng)性15份，符合率100%。

3　討論

本次試驗(yàn)表明，用膠體金法檢測(cè)羊血清樣品和平板凝集試驗(yàn)的結(jié)果相近，用膠體金法檢測(cè)羊全血樣品和試管凝集試驗(yàn)的結(jié)果相同。但膠體金法可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，可以彌補(bǔ)平板凝集和試管凝集不能開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的缺陷。由于本次對(duì)比試驗(yàn)采用的樣本數(shù)較少，大群體使用效果有待近一步驗(yàn)證。如果膠體金法經(jīng)改進(jìn)后進(jìn)一步提高準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高反應(yīng)速度，進(jìn)一步降低成本，并能作為國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)審定發(fā)布，將會(huì)大大減輕布病檢測(cè)凈化工作強(qiáng)度，將為羊布病檢測(cè)凈化工作開(kāi)創(chuàng)新局面。

面對(duì)布病反彈趨勢(shì)，廣大獸醫(yī)工作者承擔(dān)的檢疫凈化任務(wù)非常繁重，迫切需要快速、簡(jiǎn)便，能夠現(xiàn)場(chǎng)檢疫、現(xiàn)場(chǎng)出結(jié)果的檢測(cè)方法。虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)操作簡(jiǎn)易、檢測(cè)快速，成本低廉，但必須用血清作為被檢樣品，且準(zhǔn)確性易受溫度和凝集時(shí)間的影響，抗原的標(biāo)準(zhǔn)化也可影響其敏感性。試管凝集試驗(yàn)(SAT)可以定量，因而在判定反應(yīng)強(qiáng)度上比虎紅平板凝集試驗(yàn)更精確。1998年，我國(guó)將其列入國(guó)標(biāo)作為診斷布病的正式法定試驗(yàn)并沿用至今。該實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣，需37 ℃條件下孵育過(guò)夜，較費(fèi)時(shí)，不適于現(xiàn)場(chǎng)檢疫和基層采用。免疫膠體金技術(shù)(ICG)是一種常見(jiàn)的標(biāo)記技術(shù) , 它是以膠體金為標(biāo)記物 , 示蹤特異性抗原抗體反應(yīng)的標(biāo)記技術(shù)。它是繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶 ) 后發(fā)展起來(lái)的固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法,因其快速簡(jiǎn)便、特異敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)已在獸醫(yī)臨床上的得到廣泛應(yīng)用。

Comparison of Detecting Sheep Brucellosis among Immune Colloidal Gold Method, Rose Bengal Precipitation Test and Serum Agglutination Test

HE Yan-chun1, LI Ke-sheng2, HE Fen-yi3,*, DU Hui-fen2, QIAN Zhen-bo1, XU Fei-fei2

(1.ZhangyeAnimalDiseasePreventionandControlCenter,ZhangyeGansu734000China; 2.LanzhouYahuaBiologicalTechnologyCo.,Ltd;. 3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterinGansuProvince)

In order to confirm the application result of immune colloidal gold method (ICG) on sheep brucellosis, and this study selected the rose bengal precipitation test (RBPT) to detect the 15 sets of positive and negative serum of sheep. The serum agglutination test (SAT) was used to determine 15 sets of positive ear blood of sheep, then the re-inspection was implemented using colloidal gold method. The results showed that positive serum detection by RBPT obtained 15 sets and 13 sets by SAT, and coincidence rate was 86.7 %; the negative serum detection by RBPT and SAT obtained the same 15 sets, and coincidence rate was 100 %. Samples of 15 sets of positive serum were detected by SAT, which was same as colloidal gold method, and coincidence rate was 100 %. This study preliminarily showed that colloidal gold method has the characteristics of simple, rapid operation, quick, trace and so on. Therefore, the colloidal gold method is suitable for the spot detection of sheep brucellosis.

Immune colloidal gold method; rose bengal precipitation test; serum agglutination test; sheep brucellosis

2016-03-24

甘肅省科技重大專項(xiàng)(1203NK1)A017。

何彥春(1966-),男,甘肅天水人,本科,農(nóng)業(yè)推廣研究員,主要從事動(dòng)物疫病防控與研究工作。

賀奮義(1962-),男,甘肅山丹人,研究員,主要從事動(dòng)物疫病預(yù)防控制的研究及應(yīng)用工作。

S 852.5+3

C

1004-6704(2016)05-0100-02