豬精液冷凍保護劑的研究進展

高秀麗，黨燕娜，翟曉紅，胡建宏

(1.白水縣畜牧獸醫(yī)局，陜西 白水 715600；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院)

豬精液冷凍保護劑的研究進展

高秀麗1，黨燕娜2，翟曉紅2，胡建宏2

(1.白水縣畜牧獸醫(yī)局，陜西 白水 715600；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院)

摘要：冷凍保護劑是豬精液冷凍稀釋液的關(guān)鍵組分，能有效緩解冷凍及復(fù)蘇過程中對精子造成的損傷，是決定豬精液冷凍效果的重要因素。因此，研究新型冷凍保護劑，是提高豬精液冷凍保存效果的有力措施。本文就近年來國內(nèi)外抗氧化性物質(zhì)、糖類等新型冷凍保護劑的研究與應(yīng)用進展進行綜述，以期進一步提高豬冷凍精液的質(zhì)量，發(fā)揮良種的種用價值。

關(guān)鍵詞：冷凍保護劑；豬精液；研究進展

冷凍保護劑是豬精液冷凍稀釋液的關(guān)鍵組分，能有效緩解冷凍及復(fù)蘇過程中對精子造成的損傷，是決定豬精液冷凍效果的重要因素，研發(fā)新型冷凍保護劑是提高豬精液冷凍保存效果的有力措施。傳統(tǒng)的冷凍保護劑為卵黃、牛奶、甘油、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)等。隨著研究的不斷深入，抗氧化性物質(zhì)、糖類等也作為冷凍保護劑添加應(yīng)用并取得了一定的效果。本文就近年來國內(nèi)外抗氧化性物質(zhì)、糖類等新型冷凍保護劑的研究與應(yīng)用進展進行綜述，以期為進一步提高豬精液冷凍效果奠定基礎(chǔ)。

1抗氧化性物質(zhì)

豬的精子更易遭到有氧代謝過程產(chǎn)生的活性氧類(ROS)攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而致使大量的精子膜損傷，例如細胞膜的選擇通透性降低，細胞內(nèi)酶發(fā)生泄漏，精子的呼吸等生命活動受到抑制等，因而豬精子對超低溫冷凍比較敏感?；诖?，可以推測在冷凍稀釋劑中添加抗氧化性物質(zhì)可起到保護精子的作用，并且近年來的研究證明，保護液中添加抗氧化性物質(zhì)可提高豬精液冷凍保存效果。李芳等研究了四種抗氧化劑對豬精液冷凍保存效果的影響，表明單獨或復(fù)合添加6 mg/mL的維生素C和0.8 mg/mL的生物類黃酮均可提高豬精液冷凍效果；添加4%的多不飽和脂肪酸(PUFA)或添加0.6 mg/ml的維生素E均能顯著提高豬精子冷凍-解凍后的質(zhì)量；聯(lián)合添加4%的PUFA和0.6 mg/ml維生素E時，豬精液冷凍效果明顯優(yōu)于單因子組。

α-硫辛酸是一種功能多、活性強的抗氧化劑。胡曉辰等研究表明，單獨添加6.0 mg/L的α-硫辛酸能提高凍后精子的頂體完整率、精子活率、線粒體活性和質(zhì)膜完整率等各項指標，且聯(lián)合添加4.0 mg/L的α-硫辛酸和600 mg/L維生素C效果優(yōu)于單獨添加α-硫辛酸；單獨添20 mg/L的β-胡蘿卜素和600 mg/L的維生素E均能顯著提高冷凍精液品質(zhì)，二者聯(lián)合添加效果更佳，且最佳配伍濃度為20 mg/L的β-胡蘿卜素和400 mg/L維生素E。淫羊藿多糖具有較強的免疫活性和抗氧化活性，對羥基自由基體系和超氧陰離子自由基體系均有不同程度的清除作用。李軍偉等研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加4 mg/mL的淫羊藿多糖可以提高豬精液的凍后品質(zhì)。

諸多研究結(jié)果均證明了抗氧化性物質(zhì)在精液冷凍保存過程中發(fā)揮的積極作用，且大多數(shù)抗氧化物質(zhì)之間存在互作。因此，兩種或兩種以上抗氧化劑的合理搭配添加，是冷凍保護劑的研究重點之一。

2糖類

在精子的冷凍保護劑中，甘油是一種常用的滲透性冷凍保護劑，可以在冷凍過程中滲透進入精細胞膜，降低細胞內(nèi)水分含量，從而緩解冰晶化對精子造成的損傷但精子作為活細胞，對甘油具有一定的耐受范圍，高濃度的甘油會對精子產(chǎn)生毒害作用。Zeng等研究發(fā)現(xiàn)，僅2%～3%的甘油適于豬精子的冷凍保存，隨著甘油濃度增加，可能促使精子的凋亡。糖類可通過保護精子質(zhì)膜而發(fā)揮作用，糖類的羥基可以與精子膜磷脂的磷酸根結(jié)合，從而置換周圍的水分子，防止冷凍時冰晶化對精子的危害。除此之外，多糖無法進入精子胞質(zhì)膜內(nèi)，可提高細胞外滲透壓，使細胞內(nèi)的水分在冷凍過程中向細胞外滲出，引起細胞脫水皺縮，進一步減少細胞內(nèi)冰晶形成，從而保護精子免受破壞。因此，某些多糖可部分代替甘油，緩解甘油對精子的毒害作用，提高冷凍精液的品質(zhì)。

李青旺等發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖和絞股藍多糖能提高豬精子的凍后活率，枸杞多糖對豬精子活率沒有影響。三種多糖在高濃度添加時均能提高精子的凍后質(zhì)膜完整率；紅景天多糖可保護豬精子凍后頂體完整性和頂體獲能樣變化；絞股藍多糖和無保護作用，這可能與紅景天的生長環(huán)境和多糖組成成分有關(guān)。

劉穎等研究表明，糖類與甘油互作能夠有效提高豬精子凍后品質(zhì)，添加0.06 mg/ml的茯苓多糖可以有效降低甘油的添加量，但不能完全替代甘油用作抗凍保護劑來使用；當(dāng)濃度為 2.4%的甘油與0.06mg/mL的茯苓多糖聯(lián)合使用時效果較好。潘紅梅等研究了不同雙糖組合對豬精子冷凍保存效果的影響，將不同雙糖以不同比例組合添加于豬精液冷凍保護液后，以33.3%的乳糖和66.7%的蔗糖的組合對豬精液冷凍保存的效果最好。

3其他物質(zhì)

禽類卵黃常被用作冷凍保護劑，卵黃作為禽類卵細胞的主要營養(yǎng)部分，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，其各個組分在冷凍過程中發(fā)揮的作用有所差異。Lamia等研究表明，禽類卵黃中的高密度脂蛋白在冷凍過程中會對精子造成一定的損傷，而LDL可參與降低冷凍對精子的傷害過程；用LDL完全替代蛋黃后，不僅可以維持冷凍后的精子頂體完整率、質(zhì)膜完整性和體外受精后囊胚發(fā)育率，而且可顯著提高凍后精子的活力及體外受精后的卵裂率。因此，用LDL替代卵黃可得到更好的保存效果。呂瑞凱等提取了雞、鴨、鵪鶉、鴿子和鴕鳥等5種不同禽類的卵黃LDL，比對分析不同質(zhì)量分數(shù)、不同來源的LDL對豬精子冷凍保存效果的影響，研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分數(shù)為9%的鴿蛋卵黃LDL對凍后精子活率、頂體完整性和質(zhì)膜完整性均有顯著優(yōu)化作用，為LDL在豬精液冷凍保存中的應(yīng)用提供了寶貴的經(jīng)驗。

豬精液冷凍技術(shù)克服了精液長期保存和長途運輸?shù)膯栴}，使精液使用不受時間和地域的限制，不僅降低了種群維持、引種等成本，更為保護豬種質(zhì)資源、建立針對人類健康與疾病的遺傳改良動物模型基因庫等提供了新的方法與思路，在實驗動物領(lǐng)域，用動物細胞(冷凍精子)替動物整體(種公豬)，也是實驗動物倫理學(xué)核心內(nèi)容“3R”原則：替代(replacement)、減少 (reduction)、優(yōu)化(refinement)的重要內(nèi)容之一。隨著對豬精子冷凍機理的深入研究，新的冷凍保存劑不斷被發(fā)現(xiàn)，除了上述抗氧化性物質(zhì)、糖類、LDL之外，中藥提取物的添加也取得了較好的效果，勢必會研發(fā)出更有效、更安全的新型冷凍保存稀釋液，使豬精液冷凍技術(shù)技術(shù)日臻完善和成熟，并在實踐中得到廣泛的推廣應(yīng)用。

參考文獻:

[1]Alireza F,Willem JH,Cheng FP et al. Acrosome-intact boar spermatozoa initiate binding to the homologous zona pellucida in vitro [J]. Biology of Reproduction, 1997,56: 430-438.

[2]李芳.四種抗氧化劑對豬精液冷凍保存效果的影響[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)院碩士學(xué)位論文，2012.

[3]胡曉辰.α-硫辛酸、β-胡蘿卜素及兩種維生素對豬精子冷凍保存效果的影響[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013.

[4]李軍偉.淫羊藿多糖對豬精液冷凍保存的影響[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013.

[5]Zeng C,Tang K,He L,et al.Effects of glycerol on apoptotic signaling pathways during boar spermatozoa cryopreservation[J]. Cryobiology,2014,68(3):395-404.

[6]劉穎.茯苓多糖、黃芪多糖和銀杏葉黃酮對豬精子冷凍保存效果的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014.

[7]潘紅梅，張亮，藍靜，等.不同雙糖組合對豬精子冷凍保存效果的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2015，31(2)：35-39.

Research Progress on Boar Semen Cryoprotectants

GAO Xiu-li1,DANG Yan-na2,ZHAI Xiao-hong2,HU jian-hong2

(1.LivestockandveterinarybureauofBaishui,BaishuiShaanxi715600,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity)

Abstract:As an important additive of cryopreservation dilution,cryoprotectants can remit the damage to the sperm caused by freezing and recovery . Cryoprotectants is the key factor influencing the effectiveness of freezing semen,and therefore,researching new cryoprotectants is a good measure to maximize the impact of freezing semen. The research advancement of new cryoprotectants such as antioxidant and saccharides are reviewed in this paper.

Key words:cryoprotectant;boar semen;research progress

[收稿日期]2015-10-18

[基金項目]國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-36)；楊凌示范區(qū)科技計劃項目(2014NY-22)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗示范站(基地)科技成果推廣項目(TGZX2015-18)。

[作者簡介]高秀麗(1977-)，女，陜西白水人，大專，助理畜牧師，主要從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。

[中圖分類號]S 814.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1004-6704(2016)02-0062-02