循環(huán)腫瘤細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌診療中的應(yīng)用進(jìn)展

干爭光綜述，羅　以審校（.南華大學(xué)，湖南衡陽4200；2.湖南省腫瘤醫(yī)院老干頭頸內(nèi)科，長沙40005）

循環(huán)腫瘤細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌診療中的應(yīng)用進(jìn)展

干爭光1綜述，羅以2△審校
（1.南華大學(xué)，湖南衡陽421001；2.湖南省腫瘤醫(yī)院老干頭頸內(nèi)科，長沙410005）

肺腫瘤；癌，非小細(xì)胞肺；血液循環(huán)；綜述

肺癌的發(fā)病率逐年升高，發(fā)病率及病死率均居于惡性腫瘤首位，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的85%左右［1］。因肺癌早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已晚期，5年生存率僅15%［2］。因此，亟待一種行之有效的方法來提高早期診斷率、預(yù)測轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，并實(shí)時(shí)監(jiān)測療效，以提高總體治愈水平。眾所周知，惡性腫瘤的一個(gè)重要特征是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，在腫瘤轉(zhuǎn)移的環(huán)節(jié)中有極其重要的作用。因此，對肺癌患者檢測CTCs具有重要價(jià)值。本文對NSCLC診療中CTCs的應(yīng)用作如下綜述。

1　CTCs概述

1869年，Thomas Ashwoah首次提出CTCs的概念［3］。目前，人們將CTCs定義來源于實(shí)體瘤本身或轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞，通過不同途徑釋放進(jìn)入血液循環(huán)，自發(fā)產(chǎn)生或診療操作所致［4］。來源于惡性腫瘤原發(fā)部位的腫瘤細(xì)胞，通過細(xì)胞周期不斷增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［5］，發(fā)生一系列分子表型改變，極具侵襲性，從而容易進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，CTCs聚集成團(tuán)形成微小癌栓，定植于不同的組織器官中，在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。CTCs具有以下特點(diǎn)：（1）CTCs數(shù)量少，機(jī)體免疫機(jī)制等因素使得進(jìn)入血液循環(huán)中的CTCs被大量吞噬、滅活；105～107個(gè)外周血單核細(xì)胞大約僅存在一個(gè)CTC［6］，在疾病的早期階段甚至更低。（2）CTCs源于實(shí)體腫瘤，腫瘤具有異質(zhì)性的特點(diǎn)：①遺傳上具有異質(zhì)性，CTCs雖然與原發(fā)腫瘤具有基因組同源性，但與腫瘤原發(fā)部位細(xì)胞存在著異質(zhì)性；②CTCs在標(biāo)記基因的表達(dá)上存在差異，因EMT等原因的存在，使CTCs在不同程度上具有間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞2種細(xì)胞的特征；③CTCs在形態(tài)學(xué)上具有差異性，CTCs屬于腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞具有形態(tài)上的異質(zhì)性。（3）因細(xì)胞親和力的存在，多個(gè)CTCs有聚集成團(tuán)的傾向，容易形成循環(huán)腫瘤微栓（CTM），這多見于 NSCLC［7］。因?yàn)镃TCs具有上述特點(diǎn)，導(dǎo)致了檢測CTCs存在較大困難，CTCs的研究進(jìn)展緩慢。伴隨著檢測技術(shù)的進(jìn)步及人們對CTCs了解的不斷加深，CTCs逐漸成為研究熱點(diǎn)。

2　CTCs的檢測方法

CTCs罕見于腫瘤患者外周血液中，檢測要求敏感性極高、精確性高，能對CTCs準(zhǔn)確定量。目前CTCs檢測有較多的方法，一般以以下幾種檢測方法最常見。

2.1基于腫瘤免疫學(xué)原理的分離、檢測方法這種方法基于抗原-抗體反應(yīng)的原理，是目前檢測方法使用最普遍的一種。因CTCs是來源于上皮源性原發(fā)腫瘤或其轉(zhuǎn)移灶，具有上皮細(xì)胞的特征。上皮特異性細(xì)胞黏附分子（EpCAM）在上皮組織表面廣泛表達(dá)，因此常被用作CTCs的檢測標(biāo)志。目前最常見的CellSearch系統(tǒng)，由美國食品藥物管理署批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，用來預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌患者的無疾病進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）和總生存時(shí)間（OS）。在該系統(tǒng)的檢測試劑盒中，含有一種基于鐵磁流體的捕獲試劑盒免疫熒光試劑，在磁芯的聚合層上涂有針對EpCAM抗原的抗體，以捕獲CTCs。該檢測方法具有高敏感性及高效性的特點(diǎn)，但因?yàn)槟[瘤細(xì)胞EMT的存在，癌細(xì)胞部分丟失了上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物（如EpCAM等），并部分具有間質(zhì)細(xì)胞的特征，如表達(dá)鈣黏附素等［7］，并且不是所有上皮細(xì)胞腫瘤中EpCAM都有表達(dá)（如惡性黑色素瘤），因此常存在漏檢的可能，且設(shè)備昂貴，不利于廣泛應(yīng)用。

2.2基于細(xì)胞大小的分離、富集方法（ISET）該檢測方法基于細(xì)胞物理學(xué)及形態(tài)學(xué)特性來區(qū)分腫瘤細(xì)胞，CTCs形態(tài)較正常血細(xì)胞偏大。因此，使ISET分離富集成為可能。該方法原理簡單，易于操作，對設(shè)備要求不高，并可避免基于依靠EpCAM標(biāo)記檢出率低的缺陷，使檢出率大大提高［8］。但由于借助細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行細(xì)胞分離，因此篩選不具特異性［9］，且很大限度上依賴病理學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)，有一定局限性。

2.3流式細(xì)胞術(shù)（FCM）FCM是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種基于免疫學(xué)原理的方法，將腫瘤細(xì)胞特異標(biāo)志與攜帶熒光物質(zhì)的抗體進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記，然后將標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀來進(jìn)行鑒定分析，可以快速測量腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分析和分選，但FCM也存在效率及敏感性較低的不足。

2.4通過核酸來檢測CTCs目前，最常用的核酸檢測方法是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。因正常的血細(xì)胞中不存在腫瘤細(xì)胞的某些基因或表達(dá)的信使RNA，因此血液中檢測出這些DNA或RNA可間接提示CTCs的存在［10］。但由于mRNA易降解、受擴(kuò)增效率和非特異性擴(kuò)增的影響，易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。且該方法檢測是用核酸來推測CTCs的存在，可能造成檢測量與CTCs實(shí)際水平存在差距［11］。

3　CTCs與NSCLC

3.1CTCs與早期NSCLC診斷治療NSCLC的診斷時(shí)期決定了治療方法及患者的預(yù)后，早期診斷是治愈患者的關(guān)鍵。目前NSCLC早期診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，但對直徑小于5 mm的腫塊難以發(fā)現(xiàn)。Bevilacqua等［12］表明，通過影像學(xué)檢查診斷為Ⅰ期肺癌患者，其血液中檢測到了CTCs，說明腫瘤細(xì)胞的播散在疾病早期可能就已經(jīng)發(fā)生。Kurusu等［13］也在早期肺癌患者中檢測到了CTCs，并發(fā)現(xiàn)部分手術(shù)患者的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移在短時(shí)間內(nèi)就出現(xiàn)，提示遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移病灶可能已經(jīng)存在。據(jù)統(tǒng)計(jì)，經(jīng)手術(shù)根治治療的Ⅰ期NSCLC患者，其5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率超過30%［14］，且多為全身性播散轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步提示以影像學(xué)為基礎(chǔ)分期的早期肺癌可能已經(jīng)存在遠(yuǎn)處瘤細(xì)胞微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。從某種程度上來說，在NSCLC早期診斷中CTCs敏感性可能更高。

3.2CTCs與NSCLC的分期目前實(shí)體瘤的分期仍依據(jù)TNM分期來進(jìn)行，主要包括腫塊大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，主要通過影像學(xué)來指導(dǎo)腫瘤的分期。現(xiàn)有研究認(rèn)為，腫瘤的TNM分期與CTCs的檢出具有一定相關(guān)性，CTCs數(shù)量水平與實(shí)體瘤TNM分期有較高的一致性。Kerbs等［15］選取了Ⅲ期和Ⅳ期NSCLC患者行CTCs計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)Ⅳ期患者CTCs數(shù)量為0～146個(gè)，明顯高于ⅢB期（0～3個(gè)）和ⅢA期（0個(gè)）。陳燕等［16］研究了不同分期的NSCLC，發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量在Ⅲ、Ⅳ期明顯高于Ⅰ、Ⅱ期。目前廣泛應(yīng)用影像學(xué)檢查顯示的腫塊大小，在某些情況下不能完全反映腫瘤的浸潤能力。因此，CTCs在一定程度上可以彌補(bǔ)影像學(xué)的不足，并與影像學(xué)緊密結(jié)合以指導(dǎo)腫瘤分期，為患者制訂切實(shí)可行的治療方案提供依據(jù)。有研究表明，術(shù)前或者術(shù)后血液中CTCs水平較高的患者，術(shù)后的遠(yuǎn)期生存率就比較差，提示臨床上一些按常規(guī)影像學(xué)數(shù)據(jù)來判定為早期肺癌患者，實(shí)際上并非為早期［13］。目前按早期肺癌患者所采取的常規(guī)治療措施，可能嚴(yán)重影響早期肺癌的治療效果及預(yù)后。因此，通過CTCs的檢測，可以在某些早期肺癌術(shù)后患者中，采取術(shù)后輔助化療或者靶向治療，以提高療效及遠(yuǎn)期生存率。

3.3CTCs與NSCLC的療效評價(jià)由于肺癌患者早期無明顯癥狀和體征，目前絕大多數(shù)NSCLC診斷明確時(shí)已處于晚期，喪失了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。而化療、放療及分子靶向綜合治療成為主要治療手段。目前肺癌患者療效評價(jià)仍采用實(shí)體瘤RECIST評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）及進(jìn)展（PD）。研究表明，臨床上療效評價(jià)為CR、PR的患者，外周血CTCs較化療前下降，提示CTCs的變化與實(shí)體瘤評價(jià)存在較高的一致性，治療期間CTCs數(shù)量的變化與治療應(yīng)答相關(guān)。李晶等［17］選取中晚期NSCLC患者分別于化療前、2周期化療后檢測CTCs，每2個(gè)周期行療效評估，結(jié)果提示CTCs數(shù)目評價(jià)與RECIST評價(jià)療效比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯示2種評價(jià)方法有較高的吻合度。Punnoose等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在化療后產(chǎn)生應(yīng)答，PET/CT提示腫塊縮小，腫瘤代謝減低，同時(shí)檢測化療前、后患者的CTCs水平，治療有效應(yīng)答的患者其CTCs水平較化療前下降，表明CTCs檢測與PET/CT相吻合，且這部分患者PFS較長。通過CTCs的變化，來明確治療的有效性，指導(dǎo)治療方案的實(shí)施，提高療效。同時(shí)，CTCs檢測具有易于操作性和可重復(fù)性的特點(diǎn)，具有動(dòng)態(tài)性及實(shí)時(shí)性的優(yōu)點(diǎn)。

3.4CTCs與NSCLC預(yù)后腫瘤的預(yù)后，由多種因素決定，但研究表明，患者預(yù)后與CTCs有著密切關(guān)系［19］。Hofman等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性NSCLC中，化療前檢測出CTCs數(shù)量多的患者，其PFS及OS均明顯縮短。Hou等［21］研究發(fā)現(xiàn)，化療前、后CTCs的變化對患者的PFS 及OS有較強(qiáng)預(yù)測作用。Hofman等［22］進(jìn)一步研究表明，CTCs可以作為可手術(shù)的NSCLC預(yù)后評價(jià)指標(biāo)，說明可手術(shù)治療的NSCLC預(yù)后與術(shù)前CTCs計(jì)數(shù)相關(guān)，提示術(shù)前檢測患者CTCs對預(yù)測預(yù)后有著一定的價(jià)值。Rolle等［23］發(fā)現(xiàn)，已手術(shù)治療的肺癌患者，其預(yù)后也與術(shù)后CTCs數(shù)量變化相關(guān)，術(shù)后CTCs增加的患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。對肺癌患者來說，CTCs數(shù)目的增加，提示腫瘤的復(fù)發(fā)進(jìn)展或轉(zhuǎn)移風(fēng)的上升，預(yù)示患者的預(yù)后較差。

3.5CTCs與NSCLC分子靶向治療隨著個(gè)體化治療研究深入，肺癌治療進(jìn)入了基于腫瘤分子標(biāo)志物指導(dǎo)下的化療、靶向綜合治療的新時(shí)代。表皮生長因子受體（EGFR）成為目前研究的熱點(diǎn)，但是部分患者不易獲得組織標(biāo)本，從而使EGFR檢測受到一定的限制。CTCs的存在，為這些患者行相關(guān)基因檢測，提供了另外一條可能途徑，就是從這些患者的CTCs中提取相關(guān)基因，來檢測是否存在基因突變，再根據(jù)基因突變的情況，來指導(dǎo)進(jìn)一步的治療。Kimura等［24］使用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)方法提取患者血清中的DNA，并檢測了EGFR突變情況，提示與原發(fā)組織中EGFR突變之間存在較高的一致性（72.7%），說明血清DNA檢測EGFR突變具有可操作性，為進(jìn)一步使用CTCs檢測基因突變成為可能。Maheswaran等［25］選擇了12例存在EGFR突變的NSCLC，檢測CTCs所攜帶的EGFR情況，結(jié)果顯示有11例同樣存在EGFR基因突變，與組織中EGFR突變有著很高的一致性。研究表明，在靶向治療的過程中，基因的突變或者表達(dá)可能發(fā)生改變產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，例如對酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）有良好治療反應(yīng)的NSCLC患者，在治療開始后的10～12個(gè)月內(nèi)，對TKIs制劑（如吉非替尼）不再有效，其中EGFR20號(hào)外顯子突變（T790M）的存在是EGFR-TKIs耐藥主要原因之一［25］。Sequist等［26］研究發(fā)現(xiàn)，在對EGFR-TKIs耐藥的患者中，同樣存在CTCs的T790M突變，提示CTCs的基因突變與原發(fā)組織存在高度的一致性，并證明了T790M突變明顯降低了患者PFS。Gasch等［27］同樣證實(shí)在CTCs表面存在EGFR突變，并進(jìn)一步證實(shí)CTCs標(biāo)記的EGFR與患者原發(fā)病灶之間存在異質(zhì)性。這說明了EGFR-TKIs制劑對不同患者存在療效差異的原因，也是表面分子靶向治療存在原發(fā)耐藥的原因之一。Pailler等［28］選取了18例存在間變性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排的NSCLC，研究者提取CTCs 的ALK基因檢測，顯示ALK基因重排同樣存在，從而可以指導(dǎo)ALK抑制劑克唑替尼在NSCLC的治療。Ilie等［29］對NSCLC中ALK基因重排的研究中，也得到了同樣的結(jié)論。隨著基因個(gè)體治療研究的不斷深入，肺癌中越來越多的靶基因被發(fā)現(xiàn)，它們?yōu)榉伟┑姆肿影邢蛑委熖峁└訌V闊的前景，同樣，這些生物標(biāo)記也可以從肺癌CTCs提取出來，來對個(gè)體化治療進(jìn)行優(yōu)化。研究表明，核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1（ERCC1）在NSCLC中存在，其表達(dá)水平高的患者，對鉑類藥物化療反應(yīng)差，表達(dá)水平低的患者，含鉑方案化療療效較好；進(jìn)一步研究提示，ERCC1的表達(dá)水平與患者的生存呈負(fù)相關(guān)［30］。Das等［31］檢測了17例轉(zhuǎn)移性NSCLC患者CTCs的ERCC1的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)同樣顯示ERCCl表達(dá)水平與患者的PFS呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。ERCC1無表達(dá)的患者的PFS明顯長于高表達(dá)的患者（172、226 d，P＜0.05）。

CTCs的檢測可為腫瘤的個(gè)體化治療提供最有效、最實(shí)時(shí)的依據(jù)。對腫瘤治療療效的提高提供有力的支持。

4　展　望

隨著人們對CTCs的認(rèn)識(shí)不斷加深及檢測技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步，CTCs重要性及其價(jià)值越來越被人們認(rèn)可。CTCs檢測具有無創(chuàng)性及可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，CTCs檢測在肺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷及評估預(yù)后方面具有重要意義。其可以作為目前影像學(xué)檢查的有益補(bǔ)充，以評估治療療效，并可以指導(dǎo)分子靶向藥物的應(yīng)用，進(jìn)一步促進(jìn)個(gè)體化治療的發(fā)展。目前CTCs檢測方法處于飛速發(fā)展階段，但仍有以下問題需要解決：（1）需進(jìn)一步改進(jìn)檢測技術(shù)及設(shè)備，使其CTCs檢測特異性及敏感性有待進(jìn)一步提高；（2）進(jìn)一步從分子水平上深化肺癌及其他腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機(jī)制，促進(jìn)CTCs在臨床上的應(yīng)用；（3）需開發(fā)簡單有效的檢測設(shè)備，降低檢測相關(guān)費(fèi)用。

總之，隨著人們對CTCs研究的持續(xù)發(fā)展，必將使CTCs更加利于NSCLC的診療。期待CTCs的檢測在不久的將來給廣大NSCLC患者帶來更大的福音。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.026

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1009-5519（2016）05-0710-04

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（2015-12-23）