RegⅣ在胃癌及胃非癌組織中的表達(dá)及意義

葉震世　高雅玲　巴亞斯古楞　任建林

【摘要】 目的 檢測(cè)再生基因4（RegⅣ）在各種胃癌及胃非癌組織中的表達(dá)情況， 并探討其可能臨床意義。方法 運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)73例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本和90例胃癌及癌旁非癌組織芯片標(biāo)本中RegⅣ蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 RegⅣ在胃黏膜腸化生杯狀細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性染色。腸型胃癌、胃印戒細(xì)胞癌、粘液腺癌的癌細(xì)胞中呈頻繁免疫反應(yīng)性[分別為100.0%（3/3）、93.3%（14/15）和90.9%（10/11）]。RegⅣ的表達(dá)與胃癌的組織分型相關(guān)（P<0.05）， 與胃癌的侵襲參數(shù)（主要包括腫瘤浸潤(rùn)深度、是否轉(zhuǎn)移及TNM分期等）無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。RegⅣ在胃印戒細(xì)胞癌和粘液腺癌中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為40.0%（12/30）和43.3%（13/30）。結(jié)論 RegⅣ在胃黏膜腸化生杯狀細(xì)胞、胃印戒細(xì)胞癌及粘液腺癌中顯示頻繁的免疫反應(yīng)性， 提示RegⅣ可能參與胃腺癌的“腸”途徑發(fā)生機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 胃癌；再生基因4；免疫組化；組織芯片

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.05.016

胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤， 是影響和威脅人類(lèi)健康的重要疾病之一；胃癌的發(fā)生、發(fā)展受機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境等多種因素的影響， 一般經(jīng)歷萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生、腺癌的發(fā)展階段。

再生基因家族是近期研究的熱點(diǎn)之一， 是一群主要在消化系統(tǒng)發(fā)揮作用的小分子分泌蛋白， 它們?cè)诮M織損傷、炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮多種功能[1]。2001年研究學(xué)者首先從炎癥性腸病庫(kù)中分離出再生基因4（regenerating islet-derived family member 4， RegⅣ）， 其選擇性表達(dá)于胃腸道上皮細(xì)胞和胰腺組織， 可能與組織炎癥和腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2]。L等[3]發(fā)現(xiàn)RegⅣ在結(jié)直腸腺瘤的分化起始中扮演重要角色。Li等[4]推測(cè)RegⅣ的過(guò)表達(dá)可能是結(jié)直腸癌的早期事件， 且與MUC2和EGFR的磷酸化正相關(guān)。因此， 探討RegⅣ的表達(dá)情況及介導(dǎo)的信號(hào)通路可能是攻克人類(lèi)胃腸道腺癌的有效措施之一。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集2007年6月～2009年6月廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科胃癌切除術(shù)后組織蠟塊標(biāo)本共73例， 其中男58例， 女15例， 年齡28～84歲， 中位年齡59歲。所有標(biāo)本按Lauren分型劃分：腸型胃癌31例， 彌漫型胃癌42例；按WHO組織病理分型劃分：管狀腺癌23例， 乳頭狀腺癌3例， 低分化腺癌15例， 印戒細(xì)胞癌15例， 粘液腺癌11例， 類(lèi)癌6例；按TNM分期劃分：Ⅰ期4例、Ⅱ期13例、Ⅲ期32例、Ⅳ期24例。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)， 且術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放、化療和免疫治療。

另90例胃癌組織芯片（每例含平均直徑2 mm的2個(gè)組織芯， 分別為癌灶及癌旁非癌組織）， 由上海芯超生物科技有限公司合成， 各組織類(lèi)型均經(jīng)病理證實(shí)， 未予放、化療等特殊治療。

1. 2 免疫組織化學(xué)染色方法 本院標(biāo)本經(jīng)常規(guī)固定脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片；組織芯片由上海芯超生物科技有限公司合成。RegⅣ抗體（SANTA CRUZ公司）工作濃度按1∶30稀釋?zhuān)?突觸素（Synaptophysin， Syn）和嗜鉻粒蛋白A（Chromogranin A， CgA）抗體均為即用型抗體。EDTA修復(fù)液及檸檬酸修復(fù)液分別修復(fù)RegⅣ抗原和Syn、CgA抗原。滴加3% H2O2， 后滴加即用型非免疫正常山羊血清。滴加稀釋后的RegⅣ抗體及Syn、CgA抗體， 置于4℃冰箱孵育過(guò)夜。最后與顯色試劑盒反應(yīng)， 出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中均設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照及石蠟切片蘇木精-伊紅（HE）染色。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。WHO組織分型和Laurens分型間比較分別用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)和Mann-whitney U 檢驗(yàn)， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05；不同臨床病理學(xué)特征間陽(yáng)性率采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法或Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 胃癌與胃非癌組織中RegⅣ的表達(dá) RegⅣ在腸型胃癌（杯狀細(xì)胞可見(jiàn)圖1）、粘液腺癌、胃印戒細(xì)胞癌的癌細(xì)胞中呈頻繁的胞漿染色陽(yáng)性[分別為100.0%（3/3）、90.9%（10/11）和93.3%（14/15）]。6例胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌無(wú)一例見(jiàn)RegⅣ表達(dá)。而RegⅣ在胃黏膜腸化生上皮細(xì)胞呈穩(wěn)定的胞漿染色強(qiáng)陽(yáng)性（陽(yáng)性率100%）。

圖1 RegⅣ在腸型胃腺癌中的表達(dá)

注：A：RegⅣ在胃中分化管狀腺癌的癌細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（×200）； B：為對(duì)照（HE染色， ×200）

2. 2 不同胃癌組織分型中RegⅣ的表達(dá) 相對(duì)于乳頭狀、管狀腺癌， RegⅣ在彌漫浸潤(rùn)型胃癌（粘液腺癌、印戒細(xì)胞癌）中顯示更頻繁的免疫反應(yīng)性， 提示RegⅣ的表達(dá)與胃癌的組織分型相關(guān)（P<0.05）。但通過(guò)對(duì)比胃癌的侵襲、浸潤(rùn)參數(shù)等數(shù)據(jù)， 發(fā)現(xiàn)RegⅣ的表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移及TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。

2. 3 胃黏膜組織芯片中RegⅣ的表達(dá) 所有癌旁胃黏膜腸化生杯狀細(xì)胞均顯示RegⅣ強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（陽(yáng)性率100%）（見(jiàn)圖2A、B）， RegⅣ在胃印戒細(xì)胞癌和胃粘液腺癌中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為40.0%（12/30）和43.3%（13/30）（見(jiàn)圖2C、D）， 30例胃管狀腺癌無(wú)一例出現(xiàn)RegⅣ表達(dá)（無(wú)一例可見(jiàn)杯狀細(xì)胞， 陽(yáng)性率0）。

圖2 RegⅣ在胃癌組織芯片的表達(dá)

注：A， B：癌旁萎縮性胃炎：重度腸化生上皮細(xì)胞呈RegⅣ強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（×50， ×100）；C， D：胃粘液腺癌：癌細(xì)胞呈RegⅣ陽(yáng)性表達(dá)（×50， ×100）；G， H：（×400）

3 討論

本次研究中， RegⅣ在胃癌前病變（腸上皮化生、不典型增生）呈穩(wěn)定的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)， 而在胃上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化（粘液腺癌、印戒細(xì)胞癌）表達(dá)有所減弱；結(jié)合其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)在胃、結(jié)腸腺瘤中RegⅣ的表達(dá)上調(diào)， 推測(cè)RegⅣ可能為胃腸道癌前病變及腺瘤的良好生物學(xué)標(biāo)志物。在3例可見(jiàn)杯狀細(xì)胞的高至中分化腸型胃腺癌中， 其癌細(xì)胞均呈RegⅣ陽(yáng)性表達(dá)；杯狀細(xì)胞未見(jiàn)的腸型胃腺癌中無(wú)一例呈RegⅣ陽(yáng)性表達(dá)；結(jié)合來(lái)源腸粘蛋白表型的胃腺癌與異位表達(dá)的CDX2有關(guān)， 及CDX2通過(guò)與RegⅣ基因的5端直接作用而啟動(dòng)RegIV的轉(zhuǎn)錄[5]， 可以推測(cè)RegⅣ與胃腺癌的腸表型密切相關(guān)。雖然其作用機(jī)制至今未明， 相關(guān)學(xué)者總結(jié)RegⅣ可能作為一種生長(zhǎng)因子、抗凋亡因子而參與調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化[6]。

研究顯示RegⅣ在不同分化類(lèi)型的胃腺癌中的表達(dá)差異顯著：RegⅣ在粘液腺癌、印戒細(xì)胞癌等低分化腺癌中的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于中至高分化的腸型胃腺癌， RegⅣ的表達(dá)與胃癌的分化程度有關(guān)。腸上皮化生向杯狀不典型增生的轉(zhuǎn)化與印戒細(xì)胞癌的發(fā)生關(guān)系密切， 作者發(fā)現(xiàn)RegⅣ在這些組織細(xì)胞中呈頻繁的胞漿染色陽(yáng)性， 故推測(cè)RegⅣ蛋白可能是一種粘液分泌性癌瘤的良好生物學(xué)標(biāo)志物。

在本次免疫組織化學(xué)染色研究中， 通過(guò)探討RegⅣ在各種胃癌、胃非癌組織中的表達(dá)情況及規(guī)律， 作者發(fā)現(xiàn)RegⅣ頻繁表達(dá)于胃黏膜腸化生上皮、腸型胃腺癌（杯狀細(xì)胞可見(jiàn)）及低分化腺癌中（雖然經(jīng)歷先上調(diào)后輕微下調(diào)的變化趨勢(shì)）， 從而推測(cè)RegⅣ可能通過(guò)“腸”途徑參與胃腺癌的發(fā)生機(jī)制， 其可能成為胃腸道癌前病變和粘液性癌瘤的良好生物學(xué)標(biāo)志物。因此， 進(jìn)一步探討RegⅣ所介導(dǎo)的胃腸道腫瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制將為腫瘤的診斷和治療帶來(lái)重大而深遠(yuǎn)的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Zhang YW， Ding LS， Lai MD. Reg gene family and human diseases. World J Gastroenterol， 2003， 9（12）：2635-2641.

[2] Hartupee JC， Zhang H， Bonaldo MF， et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding a novel member of the human regenerating protein family： RegⅣ. Biochim Biophys Acta， 2001， 1518（3）：287-293.

[3] L B， Xu J， Zhu Y， et al. Systemic analysis of the differential gene expression profile in a colonic adenoma-normal SSH library. Clin Chim Acta， 2007， 378（1-2）：42-47.

[4] Li XH， Zheng Y， Zheng HC， et al. REGⅣ overexpression in an early stage of colorectal carcinogenesis： an immunohistochemical study. Histol Histopathol， 2010， 25（4）：473-484.

[5] Naito Y， Oue N， Hinoi T， et al. RegⅣ is a direct target of intestinal transcriptional factor CDX2 in gastric cancer. PLoS ONE， 2012， 7（11）：e47545.

[6] Numata M， Oshima T. Significance of regenerating islet-derived typeⅣ gene expression in gastroenterological cancers. World J Gastroenterol， 2012， 18（27）：3502-3510.

[收稿日期：2015-10-23]