污水處理廠(chǎng)接種物的多樣性及對(duì)化學(xué)品生物降解的影響

林春駿,周林軍,劉濟(jì)寧,楊　倩,石利利①

(1.南京信息工程大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京　210044;2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京　210042)

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污水處理廠(chǎng)接種物的多樣性及對(duì)化學(xué)品生物降解的影響

林春駿1,2,周林軍2,劉濟(jì)寧2,楊倩2,石利利1,2①

(1.南京信息工程大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京210044;2.環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京210042)

摘要：生物降解是化學(xué)品在環(huán)境中的主要去除途徑,接種物來(lái)源和特性是快速生物降解性測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生差異的重要因素。從廣州和貴陽(yáng)市6家生活污水處理廠(chǎng)采集活性污泥和二級(jí)出水，分別培養(yǎng)得到64和52株細(xì)菌，共有菌屬為氣單胞菌(Aeromonas)、芽孢桿菌(Bacillus)和腸桿菌(Enterobacter)。變性梯度凝膠電泳結(jié)果顯示，廣州市3家污水處理廠(chǎng)活性污泥和二級(jí)出水條帶數(shù)量分別為53~58和38~43條；而貴陽(yáng)市3家污水處理廠(chǎng)分別為29~42和30~42條。6種來(lái)源的接種物對(duì)易降解的萘甲酸和難降解的4-硝基芐氯生物降解測(cè)試結(jié)果較一致，接種物來(lái)源差異對(duì)中等降解性的聯(lián)苯生物降解結(jié)果影響顯著，其接種物多樣性與生物降解性呈正相關(guān)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：活性污泥；接種物；化學(xué)品；生物降解；生物多樣性

持續(xù)地暴露在有毒化學(xué)品中,即使?jié)舛葮O低,也可能對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人類(lèi)健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。目前各國(guó)在新化學(xué)物質(zhì)登記時(shí)都要求提交生物降解性數(shù)據(jù),以評(píng)估化學(xué)品在環(huán)境中的降解性或持久性[3]?；瘜W(xué)品的生物降解性測(cè)試主要依據(jù)世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則301快速生物降解性測(cè)試方法[4]。在快速生物降解性測(cè)試方法中影響因素復(fù)雜多樣,如方法適用性、受試物濃度、接種物來(lái)源和種類(lèi)及測(cè)試條件等,其中接種物的影響尤為重要。301方法有6種,其中301F方法(呼吸計(jì)量法)[5]和301D方法(密閉瓶法)[6]的接種物分別要求采用國(guó)內(nèi)主要生活污水處理廠(chǎng)的好氧活性污泥或二級(jí)出水。

活性污泥和二級(jí)出水是一類(lèi)非常復(fù)雜的微生物體系,包含了眾多微生物菌屬,這些微生物通過(guò)生長(zhǎng)代謝和共代謝、自養(yǎng)和異氧、光能和化能、好氧和厭氧等一系列生化活動(dòng)影響化學(xué)品的生物降解[7]。由于我國(guó)不同區(qū)域的生活污水處理廠(chǎng)工藝、運(yùn)行工況、接種物不盡相同,不同地區(qū)的接種物對(duì)化學(xué)品的快速生物降解性影響較大。

筆者選擇廣州和貴陽(yáng)市6家生活污水處理廠(chǎng)的活性污泥和二級(jí)出水為研究對(duì)象,通過(guò)分析接種物構(gòu)成,研究其對(duì)不同特性化學(xué)品降解性的影響,分析化學(xué)品快速生物降解性測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生差異的原因,闡明化學(xué)品生物降解過(guò)程中微生物的作用機(jī)理,為規(guī)范化學(xué)品生物降解性測(cè)試提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

聯(lián)苯(分析純,北京百靈威科技有限公司)、4-硝基芐氯(分析純,北京百靈威科技有限公司)、磷酸氫二鉀(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)、二水合磷酸氫二鈉(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)、氯化銨(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)、無(wú)水氯化鈣(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)、七水合硫酸鎂(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)、六水合氯化鐵(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)、十二水合磷酸氫二鈉(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)、UltraClean TM Soil DNA Isolation試劑盒(美國(guó)Mo BIO Lab)、Taq DNA 聚合酶(美國(guó)REGEN BIOTEC公司)。

1.2主要儀器設(shè)備

Mini-Q超純水機(jī)(美國(guó)Miliipore公司)、分析天平(AG135,美國(guó)Mettler Toledo公司)、OM3100A生物降解系統(tǒng)(日本大倉(cāng))、Research Plus 單道可調(diào)量程移液器(德國(guó)Eppendorf公司)、變性梯度凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、溶解氧測(cè)定儀(HQ30d,美國(guó)哈希)。

1.3研究方法

1.3.1接種物采集

分別采集廣州市(DTS、LD、LR)和貴陽(yáng)市(XH、BY1、BY2)共6家市政污水處理廠(chǎng)的活性污泥和二級(jí)出水?；钚晕勰嗖勺云貧獬啬┒?二級(jí)出水取自相應(yīng)污水處理廠(chǎng)二沉池出口。所有樣品用滅菌玻璃瓶盛裝并于4 ℃條件下保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。一部分樣品用于化學(xué)品快速降解性試驗(yàn),一部分樣品保存在-20 ℃用于DNA提取。同時(shí)參照HJ 505—2009 《水質(zhì)五日生化需氧量(BOD5)的測(cè)定稀釋與接種法》、GB/T 11901—1989 《水質(zhì)懸浮物的測(cè)定重量法》和GB/T 5750.12—2006《生活飲用水檢驗(yàn)規(guī)范》測(cè)定活性污泥和二級(jí)出水固體懸浮物濃度、菌落總數(shù)和BOD5。

1.3.2生物降解性測(cè)定

活性污泥取回后用自來(lái)水沖洗,再用試驗(yàn)培養(yǎng)基清洗3次。取少量污泥離心、烘干后測(cè)定干污泥含量。然后按照干污泥含量,用試驗(yàn)培養(yǎng)基配制成ρ為4 g·L-1的接種物懸浮液備用。二級(jí)出水用粗濾紙過(guò)濾,棄去前200 mL濾液,取剩余濾液作為接種物。采用301D密閉瓶法試驗(yàn)和301F呼吸計(jì)量法試驗(yàn)進(jìn)行化學(xué)品生物降解性測(cè)試來(lái)確定所選化學(xué)品的生物降解能力。聯(lián)苯、萘甲酸、2,4-二氯苯和4-硝基卞氯4種化學(xué)品性質(zhì)及添加濃度見(jiàn)表1。

表14種化學(xué)品性質(zhì)及添加濃度

Table 1Properties and concentrations of the four chemicals added

化學(xué)品微生物抑制EC50/(mg·L-1)理論需氧量ThOD1)/(mg·mg-1)ρ(301D添加量)/(mg·L-1)ρ(301F添加量)/(mg·L-1)聯(lián)苯>10003.01230萘甲酸6542.233102,4-二氯苯49.71.183104-硝基芐氯29.41.21550

1)以 O2計(jì)。

301D試驗(yàn)中,二級(jí)出水接種物添加濃度為1 mL·L-1。在黑暗、恒溫〔(20±1) ℃〕下培養(yǎng),測(cè)定溶解氧并計(jì)算BOD5,最后用BOD5值除以理論耗氧量計(jì)算生物降解率。

301F試驗(yàn)中,接種物懸浮液添加濃度為30 mg·L-1,用BOD呼吸計(jì)量?jī)x(OM3100,日本大倉(cāng))恒溫下連續(xù)攪拌28 d,用與301D相似的方法計(jì)算生物降解率。當(dāng)生物降解耗氧量達(dá)到理論需氧量(ThOD)的60%時(shí),即認(rèn)為該化學(xué)品能夠快速生物降解[4]。

1.4DNA提取及PCR擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳

-20 ℃條件下保存的接種物樣品解凍后離心,沉淀部分使用UltraClean TM Soil DNA Isolation試劑盒提取DNA,然后用w為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。DNA的PCR擴(kuò)增體系均為50 μL體系:10×PCR 緩沖液5 μL,MgCl23.5 μL(20 mmol·L-1),dNTP 2 μL(10 mmol·L-1),上下游引物518R(5′-A￣T￣T￣A￣C￣C￣G￣C￣G￣G￣C￣T￣G￣C￣T￣G￣G-3′)和338F(5-C￣G￣C￣C￣C￣G￣C￣C￣G￣C￣G￣C￣G￣C￣G￣G￣C￣G￣G￣G￣C￣G￣G￣G￣G￣C￣G￣G￣G￣G￣G￣C￣A￣C￣G￣G￣G￣G￣G￣G￣G￣A￣C￣T￣C￣C￣T￣A￣C￣G￣G￣G￣A￣G￣G￣C￣A￣G￣C-3′)各1 μL(10 μmol·L-1),Taq DNA 聚合酶0.3 μL(1.5 U),DNA模板1 μL(15 ng),無(wú)菌超純水36 μL。PCR產(chǎn)物用w為1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。變性梯度凝膠電泳(DGGE)采用CBS-DGGE 電泳系統(tǒng)(美國(guó)CBS Scientific公司),聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%,變性梯度從35%至65%(100%的變性劑溶液含7 mol·L-1的尿素和40%甲酰胺)。電泳緩沖液為1×TAE,PCR 產(chǎn)物上樣量為500 ng,60 ℃,100 V 電泳12 h,EB 染色20 min,UVP 凝膠影像分析系統(tǒng)拍照。DGGE指紋圖譜采用GelcomparⅡ軟件分析。其中,聚類(lèi)分析使用非加權(quán)組平均法(UPGMA)。用于計(jì)算群落生物多樣性的指標(biāo)有:(1) 香農(nóng)(Shannon)指數(shù):H=-Σ(ni/N) ln (ni/N)。式中，ni為單一條帶峰面積;N 為所有峰的總面積。(2) 條帶數(shù)量S。

2結(jié)果與分析

2.1接種物基本性質(zhì)

6家污水處理廠(chǎng)活性污泥和二級(jí)出水理化性質(zhì)指標(biāo)和微生物學(xué)指標(biāo)見(jiàn)表2。ρ(固體懸浮物)為1.9～5.0 mg·L-1,介于OECD導(dǎo)則范圍(2～5 mg·L-1);二級(jí)出水中為8.7～18 mg·L-1,也達(dá)到GB/T 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中1級(jí)B標(biāo)準(zhǔn)。6家污水處理廠(chǎng)BOD5去除率都大于85%。

6家污水處理廠(chǎng)活性污泥菌落數(shù)(以CFU計(jì))為105～107mL-1,二級(jí)出水菌落數(shù)為104mL-1,活性污泥菌落數(shù)高于二級(jí)出水1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。OECD快速生物降解性測(cè)試方法要求301F和301D試驗(yàn)中細(xì)胞數(shù)(以CFU計(jì))分別達(dá)到106~108和104~106mL-1,該研究301F試驗(yàn)介質(zhì)中污泥添加濃度為0.03 g·L-1,301D試驗(yàn)介質(zhì)中二級(jí)出水添加濃度為1 mL·L-1。除了貴陽(yáng)BY1廠(chǎng)活性污泥細(xì)胞數(shù)未達(dá)到方法要求之外,其他污水處理廠(chǎng)試驗(yàn)介質(zhì)中細(xì)胞數(shù)均達(dá)到OECD化學(xué)品生物降解測(cè)試導(dǎo)則要求。

表2活性污泥和二級(jí)出水基本性質(zhì)及微生物指標(biāo)

Table 2Properties and microbiological indices of active sludge and secondary effluent

城市污水處理廠(chǎng)代號(hào)二級(jí)出水活性污泥BOD5去除率/%ρ(固體懸浮物)/(mg·L-1)菌落數(shù)1)/mL-1微生物種類(lèi)香農(nóng)指數(shù)ρ(固體懸浮物)/(g·L-1)菌落數(shù)1)/mL-1微生物種類(lèi)香農(nóng)指數(shù)廣州DTS93.4111.1×104113.392.73.2×106113.71LD95.4161.3×10493.321.92.6×106123.76LR86.99.42.0×104113.455.02.2×10693.81貴陽(yáng)BY189.78.72.8×10483.221.91.1×105133.48BY296.8131.4×10463.292.84.4×107103.19XH92.1181.9×10473.473.62.2×10693.40

1)以CFU計(jì)。

2.2可培養(yǎng)微生物菌落分析

6家污水處理廠(chǎng)活性污泥中培養(yǎng)得到64株細(xì)菌,二級(jí)出水中培養(yǎng)得到52株細(xì)菌。各污水處理廠(chǎng)活性污泥比二級(jí)出水多0～3株,廣州3家活性污泥菌株數(shù)與貴陽(yáng)持平,但是二級(jí)出水比貴陽(yáng)多10株,顯示出一定的差異。

使用系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)方法將6種不同來(lái)源的活性污泥和二級(jí)出水中微生物歸類(lèi)為8個(gè)菌屬(表3)。

表3可培養(yǎng)微生物菌屬

Table 3Genera of culturable bacteria

城市污水處理廠(chǎng)氣單胞菌芽孢桿菌腸桿菌不動(dòng)桿菌假單胞菌金黃桿菌微桿菌泛菌代號(hào)(Aeromonas)(Bacillus)(Enterobacter)(Acinetobacter)(Pseudomonas)(Chryseobacterium)(Exiguobacterium)(Pantoea)廣州DTS△○△○○○△○LD△○△○△○○△○○△LR△○△○△○○貴陽(yáng)BY1△○△○△○△△○△BY2△○△○○△XH△○△○△○○△△○

△指活性污泥中培養(yǎng)得到;○指二級(jí)出水中培養(yǎng)得到。

氣單胞菌(Aeromonas)、芽孢桿菌(Bacillus)和腸桿菌(Enterobacter)是接種物中普遍存在的菌屬,這3種菌屬幾乎同時(shí)存在于所有的活性污泥和二級(jí)出水中,該結(jié)果與南京市4家污水處理廠(chǎng)分離得到的常見(jiàn)菌株相同[8]。

鑒定得到的所屬菌種及對(duì)化學(xué)品降解的生物學(xué)意義如下:

氣單胞菌(Aeromonas)包括嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)和點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonaspunctata)。需氧或兼性厭氧,化能異養(yǎng),發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,可降解纖維素類(lèi)物質(zhì)(羧甲基纖維素鈉)為單糖。

芽孢桿菌(Bacillus)包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)和同溫層芽孢桿菌(Bacillusstratosphericus)。需氧或兼性厭氧,一些芽抱桿菌具有反硝化能力,可用于生物脫氮,還可用于農(nóng)藥、氯苯類(lèi)穩(wěn)定劑的降解,求甲基化及半纖維素分解[9]。

腸桿菌(Enterobacter)包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、變形桿菌(Proteussp.)、產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)和克雷伯氏菌(Klebsiella)。兼性厭氧,有呼吸和發(fā)酵2種類(lèi)型的代謝,化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng),有的能發(fā)酵和產(chǎn)氣。

不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)主要為瓊氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjunii)。專(zhuān)性好氧,不發(fā)酵糖類(lèi)，不還原硝酸鹽。不動(dòng)桿菌是除磷的優(yōu)勢(shì)良種,有些種可降解氯苯類(lèi)穩(wěn)定劑。

假單胞菌(Pseudomonas)主要為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。能以多種有機(jī)物為碳源和能源,利用有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮為氮源,嚴(yán)格有氧呼吸代謝,假單胞菌在環(huán)境治理過(guò)程中應(yīng)用較廣泛。

金黃桿菌(Chryseobacterium)可降解纖維素[10]以及苯并芘等多環(huán)芳烴[11],對(duì)烴類(lèi)等物質(zhì)具有廣泛的利用能力[12]。

微桿菌(Exiguobacterium)是兼性厭氧菌,具有氧化酶活性和硝酸鹽還原能力,可分解有機(jī)污染物(偶氮染料、農(nóng)藥、石油等),轉(zhuǎn)化重金屬[13]。

泛菌(Pantoea)兼性厭氧,可還原硝酸鹽，發(fā)酵D乳糖和麥芽糖等[14]。

總體而言,可培養(yǎng)微生物以好氧或者兼性厭氧為主,這些接種物對(duì)于碳、氮磷的去除都具有非常重要的意義。

2.3微生物多樣性分析

圖1為活性污泥和二級(jí)出水的DGGE圖譜,同一來(lái)源接種物產(chǎn)生的2塊凝膠板中的條帶非常相似,平行性較高。不同來(lái)源接種物中接種物種類(lèi)非常豐富,可以看出活性污泥中接種物種類(lèi)多于二級(jí)出水。廣州市3家污水處理廠(chǎng)活性污泥凝膠板中污泥條帶亮度較均勻,沒(méi)有特別明顯的優(yōu)勢(shì)種群,說(shuō)明接種物群落結(jié)構(gòu)比較合理。貴陽(yáng)市3家污水處理廠(chǎng)活性污泥凝膠板中污泥條帶位置非常接近,表明微生物種群相似度較接近。

圖1不同來(lái)源接種物16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜

Fig.1DGGE profiles of V3 fragments of 16S rDNA gene of the inocula different in source

香農(nóng)指數(shù)是衡量微生物多樣性的重要指標(biāo)。廣州DTS、LD和LR污水處理廠(chǎng)活性污泥香農(nóng)指數(shù)為3.71～3.81,二級(jí)出水為3.32～3.45,貴陽(yáng)市BY1、BY2和XH污水處理廠(chǎng)活性污泥為3.19～3.48,二級(jí)出水為3.22～3.47,廣州市高于貴陽(yáng)市,其中貴陽(yáng)市BY2污水處理廠(chǎng)最低?？傮w而言，6家污水處理廠(chǎng)香農(nóng)指數(shù)都高于JUANG等[15]對(duì)好氧顆粒污泥膜反應(yīng)器的研究結(jié)果(香農(nóng)指數(shù)為2.77～2.89)。

由圖2可知,廣州市3家污水處理廠(chǎng)活性污泥條帶數(shù)為53～58條,二級(jí)出水為38～43條;貴陽(yáng)市3家污水處理廠(chǎng)活性污泥條帶數(shù)為29～42條,二級(jí)出水為30～42條,廣州市污水處理廠(chǎng)接種物微生物多樣性明顯高于貴陽(yáng)市。

圖2DGGE圖譜凝膠條帶數(shù)

Fig.2Numbers of bands in DGGE profiles

2.4化學(xué)品生物降解性

301D和301F試驗(yàn)測(cè)定的4種化學(xué)品的生物降解曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。在301D試驗(yàn)中,只有廣州DTS廠(chǎng)生物降解率超過(guò)60%,其余皆未達(dá)到60%,6個(gè)污水處理廠(chǎng)生物降解率從高到低依次為DTS、LD、LR、XH、BY2、BY1,廣州市3家污水處理廠(chǎng)二級(jí)出水作為接種物時(shí)的生物降解率皆高于貴陽(yáng)市。301F試驗(yàn)中。BY1、LR、DTS、LD廠(chǎng)生物降解率達(dá)60%,XH、BY2廠(chǎng)分別為42%和30%。301F試驗(yàn)通過(guò)概率高于301D,主要是由于301F試驗(yàn)中微生物濃度比301D中微生物濃度高約2個(gè)數(shù)量級(jí)。BLOK等[16]研究結(jié)果也表明,301F試驗(yàn)對(duì)化學(xué)品的降解率通過(guò)水平(60%)的概率大于301D試驗(yàn)。萘甲酸在不同來(lái)源接種物中都發(fā)生降解。對(duì)于易降解化學(xué)品,接種物的差異對(duì)結(jié)果影響不大。另一方面,對(duì)于易降解化學(xué)品,不論采用301D方法還是301F方法,其測(cè)試結(jié)果都較一致。

圖中虛線(xiàn)為快速生物降解通過(guò)水平。

在所有二級(jí)出水中2,4-二氯苯酚降解率都達(dá)到60%。而在301F試驗(yàn)中,降解率達(dá)到60%的只有LR、BY1和DTS廠(chǎng)。2,4-二氯苯酚對(duì)其余3種接種物產(chǎn)生了抑制,使得氧消耗量低于接種物空白對(duì)照,從而得到表觀(guān)的負(fù)降解率,其實(shí)質(zhì)是2,4-二氯苯酚未發(fā)生降解。通過(guò)301F降解曲線(xiàn)可以看出,在降解初期，2,4-二氯苯酚對(duì)所有接種物都產(chǎn)生抑制,大約5 d后,LR、BY1和DTS廠(chǎng)這3種接種物中微生物適應(yīng)并開(kāi)始加速降解2,4-二氯苯酚,而直至試驗(yàn)結(jié)束,BY2、XH和LD廠(chǎng)的接種物也未適應(yīng)2,4-二氯苯酚。2,4-二氯苯酚對(duì)微生物有毒性,活性污泥呼吸抑制濃度ρ(EC50)為49.7 mg·L-1,301D和301F試驗(yàn)添加濃度ρ分別為3和10 mg·L-1,約為EC50的1/15和1/5,結(jié)合降解曲線(xiàn)可以得出,試驗(yàn)濃度ρ為EC50的1/15時(shí),對(duì)微生物無(wú)影響,而在ρ為EC50的1/5時(shí)微生物受到化學(xué)品抑制的可能性仍極大。

301D試驗(yàn)中,廣州DTS、LD和LR廠(chǎng)4-硝基芐氯降解率分別為9.0%、38%和30%,在貴陽(yáng)BY1、BY2和XH廠(chǎng)的降解率分別為-6.3%、-2.6%和2.0%,且在試驗(yàn)期間觀(guān)察到對(duì)貴陽(yáng)接種物有輕微抑制作用。在301F試驗(yàn)中,由于ρ(4-硝基芐氯)(50 mg·L-1)高于ρ(EC50)(29.4 mg·L-1),因此試驗(yàn)期間所有來(lái)源的活性污泥都受到抑制,未發(fā)生降解。

圖4為6家污水處理廠(chǎng)接種物對(duì)4種化學(xué)品生物降解性結(jié)果。對(duì)于無(wú)毒、易降解的化學(xué)品(萘甲酸),各種接種物(包括二級(jí)出水和活性污泥)皆能使其降解,且降解結(jié)果較一致。對(duì)于難降解的化學(xué)品(4-硝基芐氯),無(wú)論是廣州還是貴陽(yáng)市的二級(jí)出水和活性污泥都無(wú)法使其降解,降解結(jié)果也較一致。對(duì)于無(wú)毒、中等降解性化學(xué)品(聯(lián)苯),各地區(qū)接種物降解結(jié)果差異較大,301D試驗(yàn)降解率為21%～66%,301F試驗(yàn)降解率為31%～100%。各地區(qū)接種物中微生物群落的不同導(dǎo)致微生物利用化學(xué)品能力差別較大。

圖46家污水處理廠(chǎng)接種物對(duì)4種化學(xué)品的生物降解率

Fig.4Biodegradation rates of the 4 chemicals inoculated with inocula isolated from 6 different sewage treatment plants

3討論

3.1化學(xué)品性質(zhì)對(duì)生物降解結(jié)果差異的影響

在歐盟呼吸計(jì)量方法第2次校準(zhǔn)比對(duì)試驗(yàn)中[17],25個(gè)參加的GLP實(shí)驗(yàn)室使用當(dāng)?shù)氐慕臃N物對(duì)12個(gè)化學(xué)品進(jìn)行生物降解性結(jié)果比對(duì),結(jié)果表明4-硝基苯酚等5個(gè)化學(xué)品中大約只有2/3的實(shí)驗(yàn)室達(dá)到通過(guò)水平,主要原因?yàn)榻臃N物來(lái)源不同。NYHOLM[18]進(jìn)一步研究了4-硝基苯酚生物降解性結(jié)果差異性較大的原因,認(rèn)為與這類(lèi)化學(xué)品的毒性和降解途徑等有關(guān)。由于4-硝基苯酚降解性適中,28 d降解率達(dá)60%的快速生物降解性判別標(biāo)準(zhǔn)可能會(huì)產(chǎn)生較大的結(jié)果差異,此時(shí)可使用10 d觀(guān)察期的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。對(duì)于有毒化學(xué)品(2,4-二氯苯酚和4-硝基芐氯),301D方法因?yàn)闈舛仍O(shè)置較低,試驗(yàn)結(jié)果較合理,能客觀(guān)地反映其生物降解性。而301F方法由于精度的原因,化學(xué)品受試濃度較高,無(wú)法正確測(cè)試這類(lèi)化學(xué)品的生物降解性。

3.2接種物多樣性對(duì)生物降解結(jié)果差異的影響

接種物來(lái)源對(duì)化學(xué)品生物降解結(jié)果具有較大影響。無(wú)論是以活性污泥為接種物的301F試驗(yàn),還是以二級(jí)出水為接種物的301D試驗(yàn),廣州市3家污水處理廠(chǎng)接種物對(duì)聯(lián)苯的生物降解性都高于貴陽(yáng)市,接種物生物學(xué)指標(biāo)顯示廣州市3家接種物微生物多樣性比貴陽(yáng)市豐富,因此可以認(rèn)為微生物多樣性有利于化學(xué)品的生物降解。這種差異一方面可能是由于污水處理廠(chǎng)本身的工藝原因,廣州市3家污水處理廠(chǎng)皆為A2/O工藝,而貴陽(yáng)市3家污水處理廠(chǎng)皆為SBR工藝。廣州屬于亞熱帶季風(fēng)氣候,常年氣溫較高,年平均溫度約為22 ℃。而貴陽(yáng)屬于亞熱帶濕潤(rùn)性季風(fēng)氣候,常年氣溫較低,年平均溫度約為16 ℃。廣州潮熱的環(huán)境更利于微生物生長(zhǎng)。ANTONIO等[19]在烴類(lèi)物質(zhì)污染的沉積物生物修復(fù)試驗(yàn)中研究表明,溫度是影響微生物豐度、生物多樣性和降解的主要原因,在有氧條件下,35 ℃時(shí)微生物多樣性及均勻性相比于20 ℃時(shí)顯著增加,烴類(lèi)物質(zhì)的生物效率與微生物多樣性及均勻性呈正相關(guān)。

ANNA等[20]研究表明營(yíng)養(yǎng)成分的增加能提高微生物多樣性。根據(jù)2008年《第一次全國(guó)污染源普查城鎮(zhèn)生活源產(chǎn)排污系數(shù)手冊(cè)》,結(jié)合行政區(qū)域和地理環(huán)境因素、城市經(jīng)濟(jì)水平、氣候特點(diǎn)和生活習(xí)慣等將全國(guó)生活污水、生活垃圾的產(chǎn)生和排放系數(shù)劃分為不同的區(qū)域,廣州、貴陽(yáng)分屬于2區(qū)1類(lèi)和4區(qū)2類(lèi),2區(qū)1類(lèi)所列居民生活污水中產(chǎn)排污系數(shù),包括人均COD、BOD5、氨氮、總氮、總磷，都明顯高于4區(qū)2類(lèi),即廣州市生活污水能提供微生物生長(zhǎng)所需的更多能量,這也可能是廣州市微生物多樣性豐富的原因。

化學(xué)品在環(huán)境中的降解影響因素很多,降解過(guò)程也非常復(fù)雜。化學(xué)品分子結(jié)構(gòu)在由大到小的降解過(guò)程中會(huì)涉及氧化酶、還原酶、裂合酶、轉(zhuǎn)移酶、異構(gòu)酶、水解酶和合成酶等一系列酶或輔酶的相互作用,這些都需要多種微生物共同參與、協(xié)同降解化學(xué)品。JOHNSON等[21]認(rèn)為,理論上污水處理廠(chǎng)中微生物菌落的多樣性能包含更多的對(duì)生態(tài)系統(tǒng)功能有利的菌株,其對(duì)10個(gè)污水處理廠(chǎng)的菌落與微量污染物的生物轉(zhuǎn)化研究表明,微生物多樣性能夠促進(jìn)微量污染物的生物轉(zhuǎn)化。

微生物之間存在諸多相互作用,包括共生、互利共棲、互養(yǎng)共棲、協(xié)同共棲、偏離共棲、互生等，都有助于化學(xué)品的降解。YANAGITA等[22]研究表明環(huán)境中存在2種類(lèi)型的微生物:貧營(yíng)養(yǎng)微生物和富營(yíng)養(yǎng)微生物。高濃度化學(xué)品在環(huán)境中先由富營(yíng)養(yǎng)微生物降解,待化學(xué)品濃度較低后,再由貧營(yíng)養(yǎng)微生物降解?？傮w而言,生物多樣性能使多種微生物協(xié)同降解化學(xué)品。

3.3接種物馴化程度對(duì)生物降解結(jié)果差異的影響

廣州市DTS和LR廠(chǎng)的接種物對(duì)有毒化學(xué)品(2,4-二氯苯酚)具有一定的降解能力?？赡苁且?yàn)閺V州市化工行業(yè)發(fā)達(dá),微生物不斷地受到生活污水中各類(lèi)化學(xué)品的馴化,對(duì)有毒化學(xué)品適應(yīng)能力較強(qiáng),甚至于生長(zhǎng)了一些化學(xué)品降解優(yōu)勢(shì)種群。HOREL等[23]研究也表明,用烴類(lèi)化學(xué)品馴化的微生物,對(duì)柴油的生物降解性顯著提升,停滯期也從12～26 d縮短至5～8 d。

如果化學(xué)品能快速生物降解,表明其在環(huán)境中可被迅速并徹底地降解,因此快速生物降解性測(cè)試是一種篩選水平的測(cè)試,其主要用于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估目的,測(cè)試條件較苛刻,要求接種物不經(jīng)過(guò)化學(xué)品馴化,尤其是受試化學(xué)品的馴化。從這種角度來(lái)說(shuō),廣州市污水處理廠(chǎng)的接種物并不十分適合用于快速生物降解性測(cè)試,更適合用于固有生物降解性測(cè)試。

4結(jié)論

采集了廣州、貴陽(yáng)市共6家污水處理廠(chǎng)活性污泥和二級(jí)出水,使用變性梯度凝膠電泳等方法研究微生物種類(lèi)及生物多樣性指標(biāo),同時(shí)作為快速生物降解測(cè)試接種物,比較了接種物生物多樣性及來(lái)源等因素對(duì)4種不同性質(zhì)化學(xué)品快速生物降解性的影響,結(jié)果表明:

(1)從污泥中培養(yǎng)得到64株細(xì)菌,二級(jí)出水中培養(yǎng)得到52株細(xì)菌,所有微生物歸類(lèi)為8個(gè)菌屬,其中氣單胞菌(Aeromonas)、芽孢桿菌(Bacillus)和腸桿菌(Enterobacter)是接種物中普遍存在的菌屬。

(2)廣州市3家污水處理廠(chǎng)活性污泥條帶數(shù)為53～58條,二級(jí)出水為38～43條,貴陽(yáng)市3家污水處理廠(chǎng)活性污泥條帶數(shù)為29～42條,二級(jí)出水為30～42條,香農(nóng)指數(shù)也表明廣州市污水處理廠(chǎng)接種物微生物多樣性明顯多于貴陽(yáng)市。

(3)對(duì)于無(wú)毒、易降解的化學(xué)品(萘甲酸),各接種物降解結(jié)果較一致。對(duì)于難降解的化學(xué)品(4-硝基芐氯),所有來(lái)源接種物都無(wú)法使其降解。對(duì)于無(wú)毒、中等降解性化學(xué)品(聯(lián)苯),各地區(qū)接種物降解結(jié)果差異較大。生物降解性與微生物多樣性呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。對(duì)于有毒化學(xué)品(2,4-二氯苯酚和4-硝基芐氯),301D方法因?yàn)闈舛仍O(shè)置較低,試驗(yàn)結(jié)果較合理,能客觀(guān)反映其生物降解性。

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(責(zé)任編輯： 陳昕)

Diversification of Inocula and Its Effect on Biodegradation of Chemicals in Sewage Treatment Plant.

LINChun-jun1,2，ZHOULin-jun2，LIUJi-ning2，YANGQian2，SHILi-li1,2

(1.School of Environmental Science and Engineering, Nanjing University of Information Science & Technology, Nanjing 210044, China;2.Nanjing Institute of Environmental Sciences， Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China)

Abstract:Biodegradation is a major means to eliminate chemicals in environment. Sources and bio-characteristics of inocula are the major factors affecting biodegradability of chemicals. Activated sludge and secondary effluent was collected from 6 sewage treatment plants in Guangzhou and Guiyang City and cultivated for isolation of biodegrading bacteria. A total of 64 and 52 strains of bacteria were isolated from the sludge and effluent collected in Guangzhou and Guiyang City, respectively, Aeromonas, Bacillus, and Enterobacter were common strains included in the two groups. Polymerase chain reaction analysis shows that 53-58 and 38-43 bands were detected in the sludge and effluent, respectively, collected from the three sewage treatment plants in Guangzhou City, and 29-42 and 30-42 bands in the sludge and effluent, respectively, collected from the three sewage treatment plants in Guiyang City. They were used as inocula for biodegradation of chemicals. Test of the inocula from 6 different sources biodegrading readily degradable naphthoic acid and hardly degradable 4-nitro benzyl chloride show that they were more or less the same in degrading effect, but they varied in effect of degrading moderately degradable biphenyl and 2,4-dichlorophenol,which displayed inhibitory effects on the inocula. All the findings show that biodegradation of the pollutants is positively related to diversity of the inocula.

Key words:activated sludge;inoculum;chemicals;biodegradation;biodiversity

作者簡(jiǎn)介：林春駿(1990—),男,江蘇南京人,碩士生,主要從事化學(xué)品生態(tài)效應(yīng)測(cè)試方面的研究。E-mail: lincj@aliyun.com

通信作者①E-mail: sll@nies.org

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2013AA060A308);環(huán)保公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(2013467028);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)

收稿日期：2015-03-25

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.01.017

中圖分類(lèi)號(hào)：X703

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-4831(2016)01-0102-08