細菌群落組成對微囊藻水華分解過程的響應*

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07101-010)和淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室項目(2014FBZ02)聯(lián)合資助.2015-02-11收稿；2015-04-20

收修改稿.謝麗娟(1990～)，女，碩士研究生；E-mail：ncuskxielijuan@163.com。

謝麗娟1，2，余得昭1，2，曾　誠3，沈　宏1

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細菌群落組成對微囊藻水華分解過程的響應*

*國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07101-010)和淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室項目(2014FBZ02)聯(lián)合資助.2015-02-11收稿；2015-04-20

收修改稿.謝麗娟(1990～)，女，碩士研究生；E-mail：ncuskxielijuan@163.com。

謝麗娟1，2，余得昭1，2，曾誠3，沈宏1

(1：中國科學院水生生物研究所東湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)試驗站，武漢 430072)

(2：中國科學院大學，北京 100049)

(3：華中農(nóng)業(yè)大學，武漢 430070)

摘要：為探究細菌群落組成對微囊藻水華腐敗分解過程的響應，在太湖梅梁灣沿岸進行為期11d的原位圍隔實驗，模擬藍藻水華聚集分解過程，并監(jiān)測了此過程中水體環(huán)境因子和細菌群落組成.結果表明，水體理化因子和細菌群落組成在微囊藻水華分解的過程中發(fā)生了顯著變化.冗余分析顯示細菌的群落組成與水體氧化還原環(huán)境(溶解氧或氧化還原電位)、pH值、浮游植物生物量和營養(yǎng)鹽濃度(總磷、硝態(tài)氮濃度)密切相關.研究還發(fā)現(xiàn)了某些與微囊藻水華分解密切相關的特殊細菌類群，其中隸屬于黃桿菌科(擬桿菌門)的一個類群在微囊藻厭氧分解的階段占據(jù)顯著優(yōu)勢，其功能有待于進一步研究。

關鍵詞：細菌群落組成；微囊藻水華；腐敗分解；黃桿菌科；太湖

由于水體富營養(yǎng)化的加劇，藍藻水華成為世界水體所面臨的共同威脅[1-2].微囊藻是富營養(yǎng)化湖泊藍藻水華常見優(yōu)勢屬[3-4].微囊藻水華聚集腐爛會消耗水體中大量的氧氣，惡化水質(如pH值下降、營養(yǎng)鹽升高)，引起水生生物死亡[2，5].藍藻水華堆積腐敗過程還會產(chǎn)生惡臭異味，甚至導致誘發(fā)黑臭水體“湖泛”的產(chǎn)生[6-7].這些不僅影響環(huán)境美觀，還使水質安全面臨新的威脅。

對微囊藻水華腐敗過程中物質循環(huán)轉化進行研究能幫助我們更好地應對微囊藻水華對水體造成的威脅.在富營養(yǎng)湖泊中，細菌，尤其是非自養(yǎng)細菌，在水體的物質循環(huán)和能量轉化中起到至關重要的作用[8-10].因此，了解微囊藻水華腐敗過程中細菌群落組成的響應能為我們進一步了解其在湖泊物質循環(huán)中的作用提供理論基礎.有研究運用原位圍隔，向其中添加藍藻，模擬藍藻水華的發(fā)生，并研究圍隔中真核微生物群落和細菌群落短期內對藍藻腐敗分解過程的響應[5，11].Shao等[12]利用圍隔實驗研究了附著細菌群落對微囊藻水華降解的響應.盡管相關研究證實微囊藻水華會顯著影響水體微生物的組成[13-15]，但是仍然缺乏對微囊藻分解完整過程中細菌群落組成特征的研究。

太湖是我國典型的富營養(yǎng)化淺水湖泊，每年夏季都暴發(fā)嚴重的微囊藻水華[16].大量藍藻水華在東南季風或者水生植物阻留的情況下在西部或北部岸邊發(fā)生聚集腐敗[16].在太湖梅梁灣設置原位圍隔，通過添加大量微囊藻模擬藍藻聚集腐敗的過程，進而研究細菌群落組成對藍藻聚集腐敗的的響應和此過程中特殊細菌類群的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

于2013年8月21-31日在太湖梅梁灣沿岸進行原位圍隔實驗.實驗期間天氣情況為：8月21-25日有斷續(xù)小雨，微風；8月26日大雨；8月27-31日晴，微風.共設6個圍隔(2.0m×2.5m)，位于梅梁灣沿岸，平均水深0.8m.實驗前一天從梅梁湖孟灣藻水分離站收集微囊藻漿.8月21日進行圍隔水體本底理化指標測定(第0d)，8月22日向圍隔中添加微囊藻，添加后立即進行現(xiàn)場指標測定和樣品采集.實驗共設2個處理，C組(對照組)圍隔不添加藻漿，H組(實驗組)添加藻漿后葉綠素a(Chl.a)濃度達378μg/L，每組設置3個平行，實驗持續(xù)10d。

1.2 生物樣品采集

實驗期間每天采樣監(jiān)測(其中，第5d即8月26日，因下大雨未采樣)，水樣取自表層水以下0.5m.100～200ml水樣先經(jīng)5μm孔徑濾膜(47mm直徑，Millipore，Germany)過濾，然后過濾于0.2μm孔徑濾膜上，分別收集浮游細菌與附著細菌.濾膜保存于-80℃冰箱直至分析使用.采集1L水樣用1%魯哥試劑固定，用于浮游植物定性定量分析。

1.3 理化指標測定

1.4 浮游植物鑒定及計數(shù)

浮游植物樣品沉淀48h后，吸取上清液，濃縮至50ml保存.鑒定前，充分搖勻，取0.1ml至計數(shù)框，在10×40倍視野下進行種類鑒定和計數(shù).微囊藻群體經(jīng)超聲分離成單細胞后再計數(shù).浮游植物種類的鑒定主要參照文獻[18]，浮游植物生物量采用體積法進行估算，假定1mm3的浮游植物體積相當于1mg浮游植物鮮重。

1.5 細菌群落結構分析

1.5.1 DNA提取及PCR擴增方法參照細菌提取試劑盒(Omega，USA)的標準程序提取細菌的基因組DNA，之后使用帶40 bp GC夾的細菌特異性引物357F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和通用引物518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)[19]擴增模板DNA.采用50μl PCR體系，降落PCR方法，程序如下：94℃預變性5min；94℃變性1min，65℃退火1min，然后每個循環(huán)降低1℃進行10個循環(huán)；72℃延伸1min；55℃退火進行20個循環(huán)，72℃延伸10min.用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物量及擴增特異性。

1.5.2 DGGE及克隆測序基因組DNA擴增產(chǎn)物通過DGGE(Dcode system，BioRad)進行變性梯度凝膠電泳(8%(w/v)聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺=37.5∶1))，分析微生物群落多樣性.聚丙烯酰胺的變性梯度范圍為40%～60%，緩沖液為1×TAE，電泳參數(shù)為：60℃，150V，7h.電泳結束后用核酸染料GelRed(用1×TAE進行1∶10000稀釋)避光染色30min，然后用UV成像系統(tǒng)(Gene，Hongkong)成像、拍照。

對感興趣的條帶進行切膠測序.首先切膠回收DNA，以此為模板使用不帶GC夾的引物進行擴增，采用純化試劑盒(Omega，USA)對PCR產(chǎn)物進行純化回收，之后連接到pMD18-T載體(Takara，Japan)質粒上.連接產(chǎn)物轉化入感受態(tài)DH5α大腸桿菌，之后挑選陽性克隆進行測序.利用BLAST和FASTA進行序列信息比對.本研究得到的序列提交至DDBJ，序列號為LC018357~LC018398。

1.6 統(tǒng)計分析

DGGE圖譜聚類分析使用NTSYS軟件(版本2.10.e).通過記下每個條帶的有無(分別標記為1和0)建立二元矩陣.樣本之間的相似性系數(shù)計算公式為：SD=(2NAB)/(NA+NB)，其中NAB代表樣本A和B的公共條帶數(shù)，NA和NB分別代表樣本A和B的條帶數(shù).根據(jù)相似性系數(shù)，利用非加權組平均法(UPGMA)構建系統(tǒng)樹圖(SHAN法則)。

軟件CANOCO 4.5(Microcomputer，Ithaca，New York，USA)用來分析細菌群落組成與環(huán)境變量的關系.當趨勢對應分析(DCA)的第1長軸<2時，采用冗余分析(RDA)；當?shù)?長軸>2時，采用典范對應分析(CCA)[20-21].采用蒙特卡羅置換檢驗篩選與細菌群落組呈顯著相關的環(huán)境變量。

環(huán)境變量的統(tǒng)計分析均使用SPSS軟件(版本13.0)，顯著水平設定為0.05(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 環(huán)境變量分析

圖1 實驗期間主要環(huán)境因子的變化Fig.1 Temporal variations in the main environmental factors during the course of experiment

2.2 浮游植物生物量的變化

在第1d添加微囊藻后，H組圍隔浮游植物生物量達到60.84mg/L，Chl.a濃度達到378.1μg/L，其中微囊藻生物量為58.58mg/L，占浮游植物總生物量的95.7%，H組圍隔中微囊藻生物量相當于嚴重水華水平(圖2).H組在添加微囊藻后，1～5d內浮游植物生物量不斷下降，第6d直到實驗結束，H組圍隔的藻類生物量與C組無顯著差異(圖2a)，微囊藻生物量的變化規(guī)律相似(圖2b)；而H組圍隔Chl.a濃度則在添加藻后的第2d就迅速下降到與對照組相近的水平(圖2c)，這表明H組圍隔中的微囊藻在1～4d發(fā)生快速厭氧死亡。

2.3 細菌群落組成分析

DGGE圖譜顯示了兩組圍隔中浮游細菌與附著細菌群落組成的變化(圖3a、b).聚類分析結果(圖3c、d)顯示，浮游細菌的群落組成可聚為兩大類：其中C組所有樣品與添加微囊藻前和剛添加微囊藻后的H0和H1聚為一大類，而剩下的H組樣品聚為另一大類.其中H2單獨聚為一類，H3和H4聚為一類，第5d之后的樣品(H6～H10)聚為一類；而C組中0～6d的樣品與H0和H1聚為一類，7～10d的樣品聚為一類(圖3c).附著細菌的群落組成可聚為4類：H組添加微囊藻之前的樣品H0與C組0～4d的樣品(C0～C4)聚為一類，C組6～10 d的樣品與H組7～10 d的樣品聚為一類，H組中添加微囊藻后1～6 d的樣品聚為一類(圖3d)。

圖2 浮游植物生物量(a)、微囊藻生物量(b)和Chl.a濃度(c)隨時間的變化Fig.2 Temporal variations in biomass of phytoplankton (a)， biomass of Microcystis spp.(b) and Chl.a concentration (c)

圖3 DGGE圖譜：浮游細菌群落(a)和附著細菌群落(b)；UPGMA聚類分析結果：

圖3a和圖3b所示編號為已進行回收測序的條帶，與條帶序列同源性最高的序列信息列于右側.在浮游細菌群落中，H組出現(xiàn)多個隸屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae)(擬桿菌門)的條帶(條帶2、3、4、6)，且明顯占優(yōu)勢地位，而這些條帶未在C組中出現(xiàn).特別是條帶4(隸屬于黃桿菌科，與培養(yǎng)類群Cloacibacteriumnor-manense的相似度為100%)，在H組添加微囊藻后第2～10d的樣品中均占顯著優(yōu)勢.與條帶4隸屬于相同屬的分類單元條帶3出現(xiàn)在H1中，條帶2出現(xiàn)在H組2～10d的樣品中，隸屬于黃桿菌屬Flavobacterium(相似度99%)，而隸屬于同一屬的條帶6(與培養(yǎng)類群Flavobacteriumcucumis(T)的相似度為100%)在H組1～2d的樣品中占據(jù)優(yōu)勢地位.而在H組2～3d的樣品中占明顯優(yōu)勢的分類單元條帶5隸屬于β-變形菌門(Betaproteobacteria).而放線菌門(Actinobacteria)是C組樣品中的一個重要門類，在C組樣品中占明顯優(yōu)勢，如條帶8、13、21.在附著細菌群落中，所測條帶序列有一半隸屬于藍藻門，由于本研究的重點關注細菌，藍藻序列在此不做討論.在附著細菌中，我們發(fā)現(xiàn)，條帶3與浮游細菌群落中條帶4序列相同(與Cloacibacteriumnormanense的相似度為100%)，且在H組第2～4d的樣品中占絕對優(yōu)勢。

圖4 基于DGGE和環(huán)境變量的RDA分析結果：浮游細菌群落(a)；附著細菌群落(b)Fig.4 Biplots diagram of the redundancy analysis (RDA) on free-living bacterial community (a)， particle-attached bacterial community (b) (DGGE profiles of 16S rRNA genes) constrained by environmental variables

3 討論

3.1 微囊藻水華對水體環(huán)境的影響

有研究表明，當水體中出現(xiàn)藍藻水華堆積時，其厭氧分解過程便占主導地位，耗竭水體中的氧氣，危害其他生物生存[16].而微生物厭氧分解藍藻的過程會產(chǎn)生大量有機酸和CO2，使水體pH值降低[5].藍藻細胞內的N、P伴隨著其厭氧分解大量釋放到水中[22]，從本研究中可看出，整個實驗期間H組的TN、TP濃度都顯著高于對照組，至厭氧藍藻分解后仍持續(xù)維持較高的水平，此結果說明水體富營養(yǎng)化與藍藻水華暴發(fā)之間的物質循環(huán)過程是值得關注的科學問題。

3.2 細菌群落組成對藍藻水華分解的響應

3.3 微囊藻水華分解過程中影響細菌群落組成的重要理化因子

3.4 參與微囊藻水華分解過程的重要細菌群落

目前，有多個細菌類群被認為與微囊藻水華分解有關.Li等[11]通過藍藻堆積的圍隔模擬實驗研究細菌的早期響應，發(fā)現(xiàn)微球菌亞目可能與微囊藻降解有關.Xing等[35]在室內實驗中發(fā)現(xiàn)梭菌屬類群在微囊藻的厭氧分解中起著重要作用.而在本研究中最引起關注的是隸屬于黃桿菌科(擬桿菌門)的一個類群(浮游細菌條帶4和附著細菌條帶3，與培養(yǎng)類群Cloacibacteriunormanense的相似度為100%)，這個類群在微囊藻厭氧分解階斷占顯著優(yōu)勢.通過同源性比對發(fā)現(xiàn)，與其相似性100%的類群多出現(xiàn)在污水或厭氧污泥中，而Cloacibacteriumnormanense最早也是從污水中分離鑒定而來的，屬于兼性厭氧菌[36].對這類細菌進一步的分離、培養(yǎng)及其生態(tài)生理特性的研究將有助于闡明其在微囊藻降解過程中的確切作用。

4 結論

本研究通過原位圍隔實驗模擬微囊藻水華分解過程，研究了此過程中細菌群落組成的動態(tài)變化.結果表明，細菌群落組成隨著微囊藻分解的不同階段發(fā)生顯著變化.微囊藻厭氧分解過程伴隨著水體氧化還原環(huán)境的改變(DO濃度和Eh降低)，pH值、藻類生物量的下降和營養(yǎng)鹽(N、P)釋放，細菌群落組成與這些理化因子密切相關.研究中發(fā)現(xiàn)微囊藻分解階段的特殊細菌群落，其中隸屬于黃桿菌科(擬桿菌門)的類群在微囊藻厭氧分解階段占顯著優(yōu)勢，其功能有待于進一步研究。

致謝：感謝朱榮在圍隔實驗采樣中給予的幫助。

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J.LakeSci.(湖泊科學)， 2016， 28(1)： 22-30

?2016 byJournalofLakeSciences

The response of bacterial community composition to the decomposition ofMicrocystisblooms

XIE Lijuan1，2， YU Dezhao1，2， ZENG Cheng3& SHEN Hong1**

(1：DonghuExperimentalStationofLakeEcosystems，InstituteofHydrobiology，ChineseAcademyofSciences，Wuhan430072，P.R.China)

(2：UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，P.R.China)

(3：HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，P.R.China)

Abstract：To explore the response of bacterial community composition (BCC) to the decomposition of Microcystis blooms， we conducted an eleven-day in situ enclosure experiment to simulate the aggregation and decomposition of cyanobacterial bloom near the shoreline of Meiliang Bay， Lake Taihu. The water quality parameters and the BCC in enclosures were monitored. The results showed that the physicochemical factors and the BCC significantly changed during course of the decomposition of Microcystis blooms. Redundancy analyses induated that the redox state of environment (showed by dissolved oxygen or oxidation reduction potential)， pH， biomass of phytoplankton and nutrient elements (total phosphorus and nitrate nitrogen) were closely related to the variation of the BCC. We also found that specific taxons in response to the decomposition of Microcystis blooms appeared in our experiment. A taxon， which affiliated to Flavobacterium (Bacteroidetes)， significantly dominated during the period of anerobic decomposition of Microcystis blooms. The functions of the bacteria group need further exploration。

Keywords：Bacterial community composition； Microcystis blooms； decomposition； Flavobacterium； Lake Taihu

通信作者*；E-mail：hongshen@ihb.ac.cn。

DOI10.18307/2016.0103