利用核-殼亞3微米填料色譜技術(shù)快速測(cè)定鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品中25種非法添加藥物

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(1. 廣東省藥品檢驗(yàn)所, 廣州 510180; 2. 廣東藥學(xué)院 藥科學(xué)院, 廣州 510006; 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué), 廣州 510006; 4. 廣東省食品檢驗(yàn)所, 廣州 510165)

近年來(lái),中成藥、保健食品及醫(yī)療器械等健康產(chǎn)品中非法添加現(xiàn)象層出不窮,其中,鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品已成為非法添加的重災(zāi)區(qū),一直是藥物分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-3]。由于解熱鎮(zhèn)痛抗炎及糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物具有抗炎、抗風(fēng)濕和解熱鎮(zhèn)痛等作用,具有起效迅速、療效顯著的特點(diǎn),該類(lèi)藥物已成為鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品中非法添加的主要成分[4-9]。目前,保健品或中成藥中非法添加有關(guān)解熱鎮(zhèn)痛類(lèi)化學(xué)成分的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法200925。該方法僅包含13種藥物成分,未能覆蓋目前文獻(xiàn)報(bào)道的已發(fā)現(xiàn)的非法添加成分[10-14]。另外,該補(bǔ)充檢驗(yàn)方法使用3個(gè)液相色譜體系對(duì)13種成分進(jìn)行分離,工作效率較低。因此,建立一套分析對(duì)象覆蓋面廣、通用性好的檢測(cè)方法,對(duì)鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品開(kāi)展非法添加篩查工作有著現(xiàn)實(shí)意義。

自高效液相色譜技術(shù)問(wèn)世以來(lái),追求更高效、更快速的色譜分離一直是液相色譜技術(shù)的發(fā)展方向。色譜柱的填料技術(shù)已經(jīng)歷了數(shù)十年的發(fā)展,從最初的薄膜大顆粒,演變成粒徑較小的全多孔形顆粒,最后發(fā)展為粒徑小于2微米的全多孔球形顆粒[15]。雖然粒徑極小的亞2微米填料的色譜柱大大提高了分析效率和分離柱效,但如此小的粒徑卻帶來(lái)了極高的系統(tǒng)壓力,只能應(yīng)用于超高效液相色譜儀,同時(shí)存在篩板容易堵塞的問(wèn)題。直到21世紀(jì)初,KIRKLAND將實(shí)心硅膠微球引入到聚合誘導(dǎo)膠體凝聚體系中,發(fā)明了一種核-殼型亞3微米硅膠微球的色譜柱填料[16]。與傳統(tǒng)全多孔填料相比,這種填料最大優(yōu)勢(shì)在于其實(shí)心的硅核減小了顆粒內(nèi)部擴(kuò)散路徑與傳質(zhì)阻抗,因此可以使用更短的色譜柱和較高的流量達(dá)到快速分離及較小的峰展寬,從而實(shí)現(xiàn)高通量分析,大大提高了分析效率。更重要的是,核-殼型亞3微米填料的色譜柱還能維持相對(duì)較低的壓力狀態(tài),柱壓僅相當(dāng)于亞2微米全多孔填料色譜柱的一半[17-19],能在常規(guī)高效液相色譜儀上實(shí)現(xiàn)超高效液相色譜儀的分析效果,成為色譜技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的突破。然而,對(duì)核-殼亞3微米填料色譜柱的方法學(xué)研究報(bào)道較多,國(guó)內(nèi)在實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道相對(duì)較少[8,20-21]。本工作以補(bǔ)充檢驗(yàn)方法200925包含的13種成分及其他文獻(xiàn)報(bào)道的12種成分為研究對(duì)象,采用核-殼亞3微米填料的色譜柱,建立了鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品中25種非法添加藥物的高效液相色譜快速檢測(cè)方法。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity型高液相色譜儀,配自動(dòng)進(jìn)樣器;G1315D型二極管陣列檢測(cè)器;PB-10型pH計(jì)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱(chēng)取26種藥物成分(包括阿司匹林水解產(chǎn)物水楊酸)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)20 mg,置于20 mL容量瓶中,用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度約為1 000 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(吡羅昔康溶液中加1滴氨水促溶)。臨用時(shí),取上述儲(chǔ)備溶液用初始比例流動(dòng)相稀釋配制成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

對(duì)乙酰氨基酚、阿司匹林、龍膽苦苷、甲氧芐啶、氨基比林、非那西丁、氫化可的松、酮洛芬、芬布芬、醋酸潑尼松、水楊酸、地塞米松、萘普生雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、醋酸地塞米松、布洛芬、磺胺甲噁唑、吡羅昔康、萘丁美酮、保泰松、潑尼松、舒林酸、異丙安替比林、奧沙普秦、甲基潑尼松龍標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

甲醇、乙腈、乙酸銨為色譜純。

1．2 色譜條件

Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.6 μm),柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm(除布洛芬外25種成分),220 nm(布洛芬);流動(dòng)相A為乙腈-甲醇(2+1)溶液,B為0.02 mol·L-1乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)節(jié)pH 4.2);流量1.0 mL·min-1。梯度洗脫程序:0～4 min時(shí),A由10%升至20%;4～6 min時(shí),A由20%升至42%;6～11 min時(shí),A由42%升至45%;11～14 min時(shí),A由45%升至50%;14～17 min時(shí),A由50%升至70%;17～17.5 min時(shí),A由70%降至10%,保持2.5 min。

1．3 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取固體樣品(丸劑與片劑需研細(xì),膠囊劑取內(nèi)容物) 0.300 0 g置于25 mL容量瓶中,加入甲醇15 mL,超聲15 min,冷卻至室溫,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。移取液體樣品5.00 mL置于25 mL容量瓶中,加入甲醇15 mL,超聲15 min,冷卻至室溫,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。以5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min后,移取上清液5.00 mL于10 mL容量瓶中,用初始流動(dòng)相定容至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液。在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件的選擇

2．1．1 色譜柱

26種藥物極性差異較大,補(bǔ)充檢驗(yàn)方法及文獻(xiàn)采用的以5微米全多孔硅膠顆粒為填料的色譜柱難以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)多種成分同時(shí)快速分離,分離時(shí)間一般在40 min以上[10]。在相同的流動(dòng)相體系下,試驗(yàn)分別采用Phenomenex Kinetex XB-C18(100 mm×4.6 mm,2.6 μm)和ACE C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)色譜柱對(duì)26種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,色譜圖見(jiàn)圖1。

(a) Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱

(b) ACE C18色譜柱 峰號(hào)1～26所對(duì)應(yīng)的化合物同表1圖1 26種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同色譜柱上的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the mixed standard solutions of 26 drugs on different columns

由圖1可知:采用Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.6 μm),26種成分在20 min內(nèi)完全分離,分離度均大于1.5;而使用分析性能優(yōu)秀的傳統(tǒng)5微米填料的色譜柱ACE C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm),26種成分在40 min內(nèi)未能完全分離。

核-殼亞3微米填料的色譜柱由于實(shí)心的硅核減小了傳質(zhì)阻力和流路擴(kuò)散,明顯改善了色譜峰形及分離度,可實(shí)現(xiàn)高通量快速分離。試驗(yàn)分別考察了Phenomenex Kinetex XB-C18(100 mm×4.6 mm,2.6 μm)、Thermo Accucore C18(100 mm×4.6 mm,2.8 μm)、Agilent Poroshell 120 EC C18(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)、Agilent Poroshell 120 SB C18(100 mm×4.6 mm,2.7 μm)等4種核-殼亞3微米填料色譜柱對(duì)26種藥物的分離效果,發(fā)現(xiàn)Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱的分離效果最好。因此,試驗(yàn)選擇Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱進(jìn)行分離。

2．1．2 流動(dòng)相

為了減少監(jiān)督檢驗(yàn)中使用的流動(dòng)相種類(lèi),提高工作效率,仍采用補(bǔ)充檢驗(yàn)方法2009025的“乙酸銨溶液-甲醇-乙腈”流動(dòng)相體系,并通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例和乙酸銨溶液的酸度實(shí)現(xiàn)26種藥物的分離。試驗(yàn)結(jié)果表明乙酸銨溶液的酸度對(duì)4種成分的分離效果影響較大。當(dāng)乙酸銨溶液的pH為4.1時(shí),奧沙普秦與萘丁美酮的分離度小于1.5;當(dāng)乙酸銨溶液的pH為4.3時(shí),氫化可的松與吡羅昔康、地塞米松與舒林酸、醋酸地塞米松與奧沙普秦的分離度小于1.5。只有當(dāng)乙酸銨溶液的pH為4.2±0.05時(shí),26種藥物能在最短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離。最佳分離條件見(jiàn)1.2節(jié),色譜圖見(jiàn)圖1。

2．1．3 柱溫

分別考察了30,35,40 ℃柱溫條件下的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí),氫化可的松與吡羅昔康分離度下降,分離度不足1.5;當(dāng)柱溫為30 ℃時(shí),雙氯芬酸鈉與保泰松分離度下降,分離度不足1.5;當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí),26種藥物能實(shí)現(xiàn)完全分離,峰形理想。因此,試驗(yàn)選擇柱溫為35 ℃。

2．2 線性關(guān)系和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用初始比例流動(dòng)相稀釋配制成質(zhì)量濃度為1.0,5.0,10,20,50,100 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按儀器工作條件進(jìn)樣,以峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性回歸,26種藥物的質(zhì)量濃度在1.0～100 mg·L-1內(nèi)呈線性,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

取陰性樣品提取液5 mL,置于10 mL容量瓶中,加入26種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用初始比例流動(dòng)相逐級(jí)稀釋,以3倍信噪比計(jì)算檢出限,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性參數(shù)與檢出限Tab. 1 Linearity parameters and detection limits

2．3 精密度與回收試驗(yàn)

選擇陰性膠囊制劑0.300 0 g作為基質(zhì),分別做高、中、低濃度水平的加標(biāo)試驗(yàn),平行配制6份,按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab. 2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

表2(續(xù))

由表2可知:3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率為90.6%～110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.42%～2.5%。

2．4 樣品分析

從互聯(lián)網(wǎng)、自制涼茶店搜集鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品共66批次,包括膠囊劑、顆粒劑、片劑、丸劑、軟膠囊劑、水劑等基質(zhì)的中成藥、保健食品和食品。按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)24批樣品非法添加解熱鎮(zhèn)痛抗炎類(lèi)藥物及糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物,不合格率為36%;檢出8種陽(yáng)性成分,分別為吡羅昔康、醋酸潑尼松、雙氯芬酸鈉、對(duì)乙酰氨基酚、吲哚美辛、布洛芬、萘普生、非那西丁。

典型陽(yáng)性樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3,色譜圖見(jiàn)圖2。

在不合格樣品中,最常檢出的成分為吡羅昔康、雙氯芬酸鈉、醋酸潑尼松和對(duì)乙酰氨基酚。其中,混合添加占非法添加樣品的75%,“吡羅昔康+醋酸潑尼松+雙氯芬酸鈉”為最常見(jiàn)的混合添加形式,同時(shí)混合添加多種藥物存在較高的安全隱患,可能引發(fā)的不良反應(yīng)值得關(guān)注。

表3 典型陽(yáng)性樣品的測(cè)定結(jié)果Tab. 3 Determination results of typical positive samples

峰號(hào)11,18,23所對(duì)應(yīng)的化合物同表1圖2 典型陽(yáng)性樣品的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of a typical positive sample

本工作針對(duì)目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品中非法添加的所有陽(yáng)性檢出成分進(jìn)行研究,采用核-殼亞3微米填料色譜柱建立了該類(lèi)健康產(chǎn)品中25種非法添加解熱鎮(zhèn)痛抗炎類(lèi)藥物及糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物的液相色譜分析方法。與傳統(tǒng)方法相比,該方法具有分析時(shí)間短、分析容量大等優(yōu)點(diǎn),能有效提高檢驗(yàn)效率,可為鎮(zhèn)痛類(lèi)健康產(chǎn)品中非法添加化學(xué)藥物的監(jiān)督檢驗(yàn)提供有力技術(shù)支撐。

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