1MTA2基因沉默對人乳腺癌MCF-7/ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

嚴梅娣

浙江省寧波市第七醫(yī)院普外科，浙江寧波 315202

1MTA2基因沉默對人乳腺癌MCF-7/ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

嚴梅娣

浙江省寧波市第七醫(yī)院普外科，浙江寧波 315202

目的乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，本研究探討MTA2對乳腺癌耐藥的作用及機制。方法CCK-8檢測MCF-7/ADR和MCF-7細胞株對阿霉素的耐藥情況。體外化學(xué)合成MTA2序列特異性的shRNA，經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞系，Western blot檢測慢病毒介導(dǎo)的MTA2敲減效率以及PI3K/AKT/ NF-κB信號通路蛋白。Annexin V-FITC和DAPI染色檢測細胞凋亡情況。結(jié)果MCF-7/ADR細胞中MTA2表達量顯著高于MCF-7細胞株，慢病毒介導(dǎo)的基因沉默顯著的敲減了MCF-7/ADR細胞中的MTA2。敲除MTA2逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細胞的耐藥作用并促進細胞凋亡。敲除MTA2通過抑制PI3K/AKT通路抑制下游NF-κB通路活化，并下調(diào)p-gp蛋白表達而逆轉(zhuǎn)耐藥性。結(jié)論敲除MTA2可以逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細胞的耐藥作用，表明MTA2可能參與調(diào)節(jié)乳腺癌多藥耐藥作用。

MTA2；乳腺癌；耐藥

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，化療是乳腺癌重要的治療手段，然而化療過程乳腺癌容易對藥物產(chǎn)生耐受，嚴重影響了乳腺癌化療的效果。隨著近年來對腫瘤分子生物學(xué)和基因功能學(xué)研究的深入，人們逐漸認識到某些腫瘤產(chǎn)生耐藥的內(nèi)在原因。因此，尋找調(diào)控乳腺癌耐藥的關(guān)鍵基因，明確其在乳腺癌耐藥機制產(chǎn)生過程中的病理機制，是乳腺癌治療領(lǐng)域重要的研究方向。

MTA2基因存在于大多數(shù)人體組織和器官，特別是在腦組織中的含量，肝臟和睪丸豐富[2-6]。目前研究發(fā)現(xiàn)MTA2主要是通過調(diào)節(jié)雌激素通路，細胞凋亡和細胞骨架形成，共同促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程[2，7，8]。相關(guān)的研究表明組織中MTA2過表達與人類惡性腫瘤的發(fā)展有密切關(guān)系，如在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、食管癌、胃癌等腫瘤中[9-15]，MTA2均成過度表達。然而MTA2與腫瘤耐藥的相關(guān)研究較少，本研究擬通過檢測耐藥細胞株MCF-7/ADR中MTA2的表達情況以及沉默MTA2后MCF-7/ ADR對阿霉素的耐藥情況，探討MTA2在乳腺癌耐藥中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MCF-7購自于中科院細胞庫，MCF-7/ADR購自于上海博谷生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2，含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基（培養(yǎng)基和血清均購于Gibco）。兔抗AKT、P-AKT、g-pg抗體（Epitomics），鼠抗I κBα、NF-κB、cleaved-caspased-3、GAPDH抗體（ProteinTech），羊抗兔HRP抗體，羊抗鼠HRP抗體（Santa Cruz Biotechnology），CCK-8試劑盒購自Dojindo，Annexin V/PI凋亡試劑盒購自Invitrogen。MTA2敲減慢病毒購自上海ji'man吉滿生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白免疫印跡雜交（Western blot） 乳腺癌細胞用阿霉素處理48h后，收集細胞沉淀，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，每個樣品上樣40g，進行蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜（美國MiLLipore公司）上，5%牛奶封閉后順序加一抗（1∶1000），二抗（1∶5000），進行雜交，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國MiLLipore公司）檢測雜交信號。

1.2.2 細胞活性實驗 將MCF-7和MCF-7/ADR細胞消化后，分別以每孔10 000個細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每個時間點做5個平行樣本，將培養(yǎng)板在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。12h細胞加入阿霉素（0、20、40、80、160μg/mL），處理48h，向每孔加入10μL CCK-8檢測試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h。用酶標儀測定在450nm處的吸光度，計算每5孔的吸光度值的平均值和標準差，計算細胞的活性。

1.2.3 慢病毒感染乳腺癌細胞沉默MTA2 乳腺癌細胞MCF-7/ADR鋪于6孔板，24h后等細胞貼壁后，加入慢病毒5μL MOI為10，同時加入4μg PB。4h后換成新鮮的完全培養(yǎng)基。48h后收集細胞，Western blot檢測MTA2敲減效率，并進行后續(xù)試驗。

1.2.4 細胞周期與凋亡檢測 阿霉素處理48h后的細胞，用胰酶消化收集細胞（培養(yǎng)基上清一起收集），1000rpm，5min離心，然后，細胞用預(yù)冷的PBS洗兩遍。用1倍結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度到1×106Cells/mL。接著，加入5μL Annexin V-FITC及1μL 100μg/mL的PI工作液，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min。最后加入1倍結(jié)合緩沖液400L，輕輕混勻，用流式細胞檢測儀器（貝克曼）檢測細胞凋亡。

1.2.5 DAPI染色 MCF-7/ADR細胞用阿霉素處理48h收，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定15min，再用PBS清洗3遍，DAPI染液染色5min，PBS清洗3遍，熒光顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)目。

2 實驗結(jié)果

2.1 多耐藥乳腺癌細胞株MCF-7/ADR中的MTA2表達顯著高于MCF-7

首先用不同濃度的阿霉素處理MCF-7和 MCF-7/ADR細胞，檢測兩組細胞的耐藥情況，結(jié)果顯示，不同濃度的阿霉素對兩組細胞的活性均有抑制作用，且呈濃度依賴性（圖1A）。其中阿霉素對MCF-7/ADR的IC50為（1567±45）μg/mL，MCF-7為（120±5）μg/mL。耐藥倍數(shù)為13倍，說明該耐藥株MCF-7/ADR的耐藥作用顯著。Western blot檢測MCF-7和MCF-7/ADR細胞中MTA2表達情況，發(fā)現(xiàn)MCF-7/ADR細胞中MTA2表達顯著高于MCF-7細胞株（圖1B）。

圖1 MCF-7/ADR中的MTA2表達顯著高于MCF-7

2.2 慢病毒介導(dǎo)的shRNA顯著的下調(diào)了乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR中MTA2

分別用對照組病毒（NC）和MTA2敲減病毒（shRNA）感染MCF-7/ADR細胞，48h后在熒光顯微鏡下觀察：計數(shù)100個細胞，其中有綠色熒光的占90%以上，如圖2A。同時收集細胞沉淀，提取總蛋白，進行Western blot檢測。Western blot結(jié)果顯示，shRNA組的MTA2水平顯著低于對照組(圖2B)。由此可見，MTA2在人乳腺癌細胞MCF-7/ ADR細胞內(nèi)被成功敲除。

圖2 慢病毒敲減乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR中MTA2

2.3 敲除MTA2逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細胞的耐藥作用并促進細胞凋亡

通過慢病毒介導(dǎo)的MTA2基因敲除后，MCF-7/ADR細胞對阿霉素的耐藥作用大大降低，IC50為（120±21）μg/mL，在同樣阿霉素濃度處理下，敲除MTA2的MCF-7/ADR細胞活性顯著低于MCF-7/ADR對照組細胞。同時在基因沉默MTA2的MCF-7/ADR細胞中加入阿霉素處理48h可以顯著促進MCF-7/ADR細胞的凋亡（圖3B，C）。

圖3 敲除MTA2逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細胞的耐藥作用并促進細胞凋亡A MCF-7/ADR細胞中MTA2被敲除后，耐藥性下降。B，C 敲除MTA2后，加入阿霉素處理細胞48h，Annexin V-FITC和DAPI檢測細胞凋亡qing’l情況

2.4 敲除MTA2通過抑制PI3K/AKT通路抑制下游NF-κB通路活化，并下調(diào)p-gp蛋白表達而逆轉(zhuǎn)耐藥性

Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，敲除MTA2后，MCF-7/ADR細胞中的p-AKT水平下調(diào)，IκBα表達上調(diào)，NF-κB表達下調(diào)，p-gp蛋白在耐藥時處于高表達狀態(tài)，當敲除MTA2后，其表達水平下降，同時，細胞凋亡蛋白cleaved-caspase-3表達水平也顯著增加。

圖4 western blot檢測敲除MTA2后MCF-7/ADR細胞中AKT，IκBα，NF-κB，p-gp，cleaved-caspase-3蛋白表達情況

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國位居女性惡性腫瘤發(fā)生率的首位。近年來，女性乳腺癌的患病率顯著上升，并趨于年輕化。目前，化療是治療乳腺癌的重要手段，但是乳腺癌細胞多耐藥性的發(fā)生是導(dǎo)致化療失敗的主要原因[16]。腫瘤細胞多耐藥性產(chǎn)生的原因可能有以下幾種：p-pg介導(dǎo)的經(jīng)典多耐藥；多耐藥相關(guān)蛋白（MRP）產(chǎn)生的耐藥機制[17]；拓撲異構(gòu)酶Ⅱ表達水平下降，使腫瘤對抗腫瘤藥物敏感性下降，引起耐藥[18]。

MTA2基因存在于人體內(nèi)的大部分組織及器官中，尤其是在腦組織、肝臟及睪丸中的含量較為豐富[13，19]。目前經(jīng)張順等分析認為，MTA2主要是通過調(diào)節(jié)雌激素的通路、細胞凋亡及細胞骨架等路徑來共同加速腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程。相關(guān)研究現(xiàn)已明確MTA1在組織中的過度表達與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、食道癌以及肝細胞肝癌[7，12，20-22]等。然而MTA2與乳腺癌耐藥相關(guān)研究未見報道，本研究利用MCF-7/ADR和MCF-7兩株細胞，發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株MCF-7/ADR中的MTA2表達水平顯著高于MCF-7細胞。通過慢病毒介導(dǎo)的MTA2基因敲除可以逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細胞的耐藥作用并促進細胞凋亡。

PI3K/AKT通路參與許多腫瘤耐藥的調(diào)控，隨著PI3K/AKT信號通路與腫瘤耐藥性之間的研究越來越多，PI3K/AKT信號通路的激活被認為使腫瘤耐藥產(chǎn)生的新機制。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-7/ADR細胞中敲除MTA2后，P-AKT表達顯著下調(diào)。同時NF-κB，g-gp表達也相應(yīng)的下調(diào)。NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，非激活狀態(tài)下與它的抑制蛋白形成復(fù)合物，PI3K/AKT可以通過磷酸化IκB解除對NF-κB的抑制。NF-κB作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核，調(diào)節(jié)p-gp的表達，從而影響細胞的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)MTA2可以通過PI3K/AKT/ NF-κ通路影響乳腺癌細胞的耐藥性。因此通過基因沉默技術(shù)敲除MTA2來影響PI3K/AKT/NF-κ通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌的多耐藥性，為乳腺癌化療中多見的多藥耐藥問題提供一個新的治理思路。

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The reversal effect of MAT2 silencing on multidrug-resistant breast cancer cell MCF-7/ADR

YAN Meidi
Department of General Surgery,the Seventh Hospital of Ningbo,Ningbo 315202,China

ObjectiveBreast cancer is the most common malignant tumor in women.To investigate the effect and mechanism of MTA2 on breast cancer drug resistance.MethodsCCK-8 was used to detect the drug resistance of MCF-7/ADR and MCF-7 cells to adriamycin.MTA2 sequence specific shRNA was synthesized in vitro and transfected into human breast cancer cell line by lentivirus.Knockdown efficiency of lentivirus mediated MTA2 and the signaling pathway protein,such as PI3K,AKT and NF-κB,were detected by Western blot.Apoptosis was detected by Annexin V-FITC and DAPI staining.ResultsMTA2 expression in MCF-7/ADR cells was significantly higher than that in MCF-7 cell line.Lentivirus-mediated gene silencing significant knockdown MTA2 in MCF-7/ADR cells.Knockdown of MTA2 inhibited the activation of the downstream NF- kappa B pathway by inhibiting the PI3K or AKT pathway,and reversed the resistance to P-gp protein expression.ConclusionKnockout MTA2 can reverse the MCF-7/ADR cells drug resistant effect and these suggest MTA2 may be involved in regulating the role of breast cancer multidrug resistance.

MTA2;Breast cancer;Drug resistant

R737.9

A

2095-0616（2016）22-22-04

2016-09-11）

浙江省寧波市醫(yī)學(xué)科技計劃項目（2014A39）。