乳腺癌播散腫瘤細胞檢測進展

賈靜

（福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院，福建 泉州362000）

?綜述及其他?

乳腺癌播散腫瘤細胞檢測進展

賈靜

（福建醫(yī)科大學附屬泉州第一醫(yī)院，福建 泉州362000）

本文通過文獻回顧的方式對關于乳腺癌播散腫瘤細胞檢測的方法及其進展進行了總結。免疫組化的方法因其特異性高而成為目前乳腺癌播散腫瘤細胞檢測中的金標準，但由于其靈敏度稍低，而且由于各檢測單位缺乏統(tǒng)一、標準的檢測流程，故其臨床的應用受到一定的限制。今后若能在大樣本量、隨機前瞻性研究的支持下，統(tǒng)一目前乳腺癌播散腫瘤細胞檢測中的分歧，必將對乳腺癌的診療起到極大的促進作用。

乳腺癌；播散腫瘤細胞；檢測

1 乳腺癌播散腫瘤細胞檢測的意義

乳腺癌是目前多見的女性惡性腫瘤之一。雖然其治療方法有了很大進步，但總體生存率并沒有明顯改善，有研究發(fā)現(xiàn)，有50%非進展期乳腺癌以及30%淋巴結陰性的乳腺癌患者在手術后5年內(nèi)出現(xiàn)遠處轉移，顯然，目前的乳腺癌TNM分期并不能準確預測患者對治療的反應以及預后等情況。目前，針對乳腺癌播散腫瘤細胞的檢測是乳腺癌診療中的熱點問題，Braun等[1]對4703例可手術的乳腺癌患者進行了5年的隨訪，結果證實，檢出播散腫瘤細胞是預測疾病早期復發(fā)和死亡的獨立指標。

2 可用于檢測的標本

目前針對乳腺癌播散腫瘤細胞的檢測主要是根據(jù)待檢組織和乳腺癌細胞的組織來源不同來進行鑒別。對于乳腺癌患者而言，一旦在以下組織中檢測出上皮來源的細胞，即被認為是乳腺癌細胞播散所致。

2．1 淋巴結

腋窩淋巴結以及內(nèi)乳淋巴結一直都是判斷乳腺癌預后好壞的重要因素。淋巴結連續(xù)切片被認為是檢測乳腺癌有無局部侵犯的金標準。

2．2 外周血

2．3 骨 髓

乳腺癌主要通過淋巴系統(tǒng)和血循環(huán)系統(tǒng)進行播散，而骨骼是乳腺癌經(jīng)血液播散后的常見定植器官。骨髓中檢出播散腫瘤細胞和乳腺癌患者的TNM分期以及疾病的復發(fā)、疾病相關死亡率之間都存在一定的相關性。

3 待檢標本的富集技術

相比于待檢標本中的正常細胞，播散腫瘤細胞所占的比例很小，因此，有必要對待檢標本進行富集、純化，以提高檢出率。目前常用的富集技術主要包括：

3．1 離心法

即利用離心機分離待檢標本中的單個核細胞，常用的方法包括Ficoll法以及OncoQuick法等。

3．2 免疫磁化富集技術

使用連有微小磁珠的特殊抗體篩選目的細胞。經(jīng)磁化富集之后的標本可進一步利用免疫學技術或分子生物學技術檢測其中的播散腫瘤細胞。

④廊道。廊道的震損檢查信息包括裂縫、剝落、排水孔、滲水、滲流量等。其中，裂縫信息包括裂縫的位置、長度、深度以及寬度等，剝落信息包括剝落位置和程度，排水孔信息包括位置和現(xiàn)象，滲水信息包括位置和程度等。

4 檢測乳腺癌播散腫瘤細胞的方法及其原理

4．1 細胞學水平

針對細胞水平的研究可以粗略的分為2大類：利用單克隆抗體＋形態(tài)學檢查和僅僅利用單克隆抗體檢測播散腫瘤細胞的方法。

4．1．1 基本原理 基于乳腺癌是來源于上皮組織的惡性腫瘤，而發(fā)源自內(nèi)胚層的造血組織在正常情況下是不能檢出上皮細胞，故一旦檢出，則認為所檢出的上皮細胞就是源自惡性組織播散。

4．1．2 檢測方法 （1）免疫組織化學技術／免疫細胞技術（IHC/ICC）：其原理主要是應用單克隆抗體與相應特異性的腫瘤標志物結合，在組織細胞原位對相應抗原進行定性、定位和定量的測量，該方法將免疫反應的特異性、組織化學的可見性結合起來，在細胞水平、亞細胞水平檢測各種抗原物質，包括蛋白質、

多肽、酶、癌基因和抑癌基因的產(chǎn)物、激素以及受體等。免疫組織化學技術可以同時集合免疫反應的高度敏感性和細胞形態(tài)學的高度特異性，一方面提高檢測的敏感度，同時，免疫組化技術還可以對分離出來的異常細胞進行形態(tài)學的觀察，進一步確定此類細胞是否真的來源于惡性組織，從而在一定程度上降低了假陽性的發(fā)生率。免疫組化技術是目前檢測播散腫瘤細胞的金標準，其檢測的敏感度可以達到1個上皮細胞/105-6個外周血單個核細胞。

（2）流氏細胞技術（flow cytometry）：利用單克隆抗體分離目的細胞，檢測速率較快，檢出率可疑達到1個陽性細胞/107血細胞。由于僅能檢測待檢標本中的細胞表面的特定表達產(chǎn)物，而不能對被檢出細胞進行形態(tài)學的觀察，因此存在一定的假陽性。

4．2 基因水平

4．2．1 基本原理 腫瘤細胞的基因結構（DNA）及其表達（mRNA）是不同于正常細胞的，轉移的惡性腫瘤細胞仍然表達具有起源組織特征的特異性標記。我們可以應用特殊的引物片斷擴增出待檢標本中的上皮細胞源性mRNA，通過逆轉錄技術獲得相應的上皮細胞源性cDNA，通過PCR的擴增而增加待檢標本中上皮細胞源性cDNA的含量，從而在理論上可以提高異常細胞檢出的敏感性。

4．2．2 具體方法 （1）逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）：RT-PCR技術通過監(jiān)測上皮特異性mRNA或腫瘤特異性mRNA來發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者骨髓、外周血或淋巴結中的播散腫瘤細胞。

（2）巢式（nested）PCR：先用一隊外引物對模板進行擴增，然后再用另一對內(nèi)引物擴增第一對引物擴增的產(chǎn)物。

（3）實時RT-PCR（real-time RT-PCR）：可以在PCR處于對數(shù)增長階段時進行計數(shù)，而不需要經(jīng)過固定的傳代次數(shù)再進行計數(shù)，而且不需要在PCR反應結束后再進行產(chǎn)物處理，從而避免了PCR反應產(chǎn)物可能造成的污染。

5 主要的檢測標記物

5．1 細胞角蛋白（CK）

細胞角蛋白是上皮細胞特有的中間細絲蛋白，細胞角蛋白家族至少包含20余種成員，每一種蛋白都由一種特異的基因所編碼。CK-19主要分布于單層上皮細胞，如腸上皮、乳腺、胰管、子宮內(nèi)膜等，當這些組織癌變后角蛋白的組成不變，但含量增加，從而被認為是檢測上皮細胞來源的癌細胞的普遍標志物。

5．2 Mammaglobin

絕大多數(shù)的研究均證實，Mammaglobin僅表達于乳腺癌患者的外周血中，而不表達于正常人和乳腺良性疾病患者中；L.Mercatali等[2]應用巢式RTPCR的方法檢測乳腺癌患者以及正常志愿者外周血中Mammaglobin mRNA的表達，結果7%的乳腺癌患者外周血中可以檢出Mammaglobin mRNA表達，而正常志愿者全部未能檢出，從而提示Mammaglobin作為檢測乳腺癌播散腫瘤細胞的標志之一，具有極高的特異性。

5．3 Maspin

Maspin屬于serpin蛋白酶家族，Maspin蛋白的表達可能與正常乳腺組織的癌變以及進展有關。I Bie`che等[3]利用實時定量RT-PCR技術檢測Mapsin在乳腺癌組織中的表達，并討論其與乳腺癌患者病理學特征以及預后之間的關系，結果發(fā)現(xiàn)Maspin的表達與患者ER表達呈負相關。

5．4 乳腺上皮粘蛋白（small beast epithelial mucin，SBEM）

乳腺上皮粘蛋白的表達具有高度的特異性，僅在乳腺和唾液腺中表達。楊華偉等[4]利用巢式PCR技術檢測67例乳腺癌、16例乳腺良性腫瘤以及20例健康志愿者外周靜脈血中SBEM mRNA的表達情況，結果67例乳腺癌患者外周血的表達率為50.7%（34/67），而良性腫瘤以及健康志愿者表達均為陰性，提示SBEM mNRA可作為檢測乳腺癌血行微小轉移的檢測指標。SBEM mRNA的陽性表達率與臨床分期、淋巴結受累情況明顯相關，而與腫瘤的大小、激素受體情況等無關。

［1］ Braun S,Vogl FD,Naume B,et al:Apooled analysis ofbone marrow micrometastasis in breast cancer.N Engl J Med 353:793-802, 2005.

［2］ L.Mercatali,V.Valenti,D.Calistri,et al.RT-PCR determination of maspin and mammaglobin B in peripheral blood of healthy donors and breast cancer patients.Annals ofOncology17:424–428,2006

［3］ I Bie`che,I Girault,J-C Sabourin,S Tozlu,K Driouch,MVidaud and R Lidereau.Prognostic value of maspin mRNA expression in ERa-positive postmenopausal breast carcinomas.British Journal of Cancer(2003)88,863–870.

［4］ YangHW,CaoJ,YangNW,et al.Expression ofsmall breast epithelial mucin mRNA in peripheral blood of breast cancer patients and its clinical significance.Ai Zheng,2005,24(7):842-845.