黍子的抗氧化活性及其與功能活性成分的關(guān)系

鄭楠楠 綦文濤 王春玲 允婷婷 幺 楊 任貴興

(1. 天津科技大學(xué)，天津 300222；2. 國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037；3. 中國科學(xué)研究院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

黍子的抗氧化活性及其與功能活性成分的關(guān)系

鄭楠楠1,2綦文濤2王春玲1允婷婷2幺 楊3任貴興3

(1. 天津科技大學(xué)，天津 300222；2. 國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037；3. 中國科學(xué)研究院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

通過建立C57BL/6肥胖小鼠模型，評價了黍子對小鼠肝臟抗氧化性能的影響。并在分析比較其多酚和黃酮含量的基礎(chǔ)上，利用抗氧化化學(xué)分析和細(xì)胞評價試驗，研究了黍子抗氧化活性與其主要功能活性物質(zhì)含量之間的關(guān)系。結(jié)果表明：高脂飲食削弱了小鼠肝臟的抗氧化性能，日糧中添加黍子后，高脂飲食小鼠肝臟的抗氧化能力得到了明顯的改善。不同黍子品種間多酚和黃酮的含量差異較大?？偠喾雍孔儺愊禂?shù)可達(dá)63.61%，變幅為0.78～3.44 mg/g。總黃酮含量變異系數(shù)可達(dá)68.46%，變幅為0.89～10.17 mg/g。不同品種黍子提取物的總抗氧化能力指數(shù)(ORAC)和細(xì)胞抗氧化活性(CAA)均存在顯著性差異，且黍子提取物的ORAC和CAA值與黃酮和多酚的總含量相關(guān)，均呈正向線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.811和 0.565。

黍子；抗氧化活性；黃酮；多酚；線性相關(guān)性

黍子是中國北方干旱或半干旱地區(qū)[1-2]主要的糧食作物，也是中國特色的小雜糧作物[3]。中國是目前世界上黍子栽培面積最大的國家，常年種植面積約為100萬hm2[4]。黍子有糯性和粳性之分。黍子中富含蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、維生素和礦物質(zhì)，近些年研究發(fā)現(xiàn)，黍子中還含有豐富的功能性天然活性物質(zhì)，如多酚[5]、黃酮[5]、生物堿[5-6]等。黍子酚類物質(zhì)能夠明顯地抑制血漿和肝臟中膽固醇含量上升，能誘導(dǎo)血管舒張，對降低冠心病、動脈粥樣硬化和中風(fēng)等常見心血管疾病的發(fā)病率[5]有重要的作用。另外，黍子多酚對多種細(xì)菌、真菌、酵母都能起到抑制作用，尤其能明顯抑制霍亂菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等常見致病細(xì)菌[7]。

目前，中國黍子的研究[6,8]主要集中在新品種選育上。同時，外來種質(zhì)收集整理和應(yīng)用也得到了有效開展[9-10]。而關(guān)于黍子品質(zhì)方面的研究較少，且主要集中在黍子蛋白提取、脫色工藝及代謝調(diào)節(jié)功能等方面[11-12]。而關(guān)于黍子抗氧化的研究還不多見，為數(shù)不多的報道[13-14]也只涉及體外抗氧化方面。基于此，本研究擬采集了中國黍子主產(chǎn)區(qū)的6種代表性黍子品種，其中糯性黍子4種，粳性黍子2種，通過建立高脂日糧C57BL/6雄性小鼠模型，評價了黍子對小鼠肝臟抗氧化性能的影響，并在分析比較其多酚和黃酮含量的基礎(chǔ)上，利用抗氧化化學(xué)分析和細(xì)胞評價試驗，研究了黍子抗氧化活性與其主要抗氧化功能活性物質(zhì)含量之間的關(guān)系，以期為黍子的合理加工和消費提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品制備：分別選取中國主要產(chǎn)區(qū)2015年產(chǎn)糯性黍子(4種)和粳性黍子(2種)共6個品種(見表1)，經(jīng)除雜、清洗、干燥、脫殼、粉碎(過60目篩)后得到黍子粉末進(jìn)行多酚、黃酮檢測及體內(nèi)、體外試驗備用；

表1 黍子品種及來源

試驗細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞HepG2，天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全實驗室饋贈；

試驗動物：5～6周齡健康SPF級C57BL/6雄性小鼠，體重14～16 g，共110只[許可證號：SCXK(京)2015-0001]，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗試劑與設(shè)備

Folin-Ciocalten試劑、DPPH(1,1-苯基- 2-苦肼基自由基)、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/HIGH GLUCOSE：美國Sigma公司；

碳酸鈉、香草醛、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、三氯乙酸、丙酮：分析純，北京化工廠；

苯酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、蘆?。?國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)：美國Sigma公司；

丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒：南京建成科技有限公司；

數(shù)顯示電熱恒溫水槽：HHS型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

電子分析天平：ME235S型，德國Sartorius 公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FD-2型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司公司；

分光光度計：751型，上海普天公司；

多功能振蕩器：WH-4型，天津市威化實驗儀器廠；

酶標(biāo)儀：SpectraMax Plus384型，美國Molecular Devices公司；

高速冷凍式離心機(jī)：Eppendorf5810R型，德國Eppend-orf公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE52-AA型，上海滬西分析儀器廠；

粉碎機(jī)：JFSD-100型，上海嘉定糧油儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚含量測定 采用分光光度法[15]。

1.3.2 黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al(NO)3比色法[16]。

1.3.3 黍子水提物和醇提物的制備

(1) 水提物：稱取50 g黍子粉末，按照1∶15(g/mL)的料液比溶于水中，振蕩器攪勻，置于50 ℃水浴鍋中浸提2 h，浸提過程中每隔15 min攪勻一次。取上清3 500 r/min離心10 min，50 ℃旋蒸濃縮后凍干。按式(1)計算其提取率：

(1)

式中：

v——提取率，%；

m1——水提物含量，g；

m2——黍子粉的重量，g；

a——水提物中水分含量，%；

b——黍子粉中水分含量，%。

(2) 醇提物：稱取50 g黍子粉末，按照1∶10(g/mL)的料液比溶于60%乙醇中，振蕩器攪勻，置于50 ℃水浴鍋中浸提2 h，浸提過程中每隔15 min攪勻一次。取上清3 500 r/min離心10 min，50 ℃旋蒸濃縮后凍干，計算其提取率。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 HepG2細(xì)胞在含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃，5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，2～3 d傳代1次。

1.3.5 總抗氧化能力的指數(shù)(ORAC)測定 根據(jù)文獻(xiàn)[17]修改如下：首先用75 mmol/L的磷酸緩沖液(pH=7.4)對黍子水提物和醇提物進(jìn)行稀釋，采用熒光96孔板進(jìn)行測定。每個孔中精確移取20 μL樣品提取物或者20 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)品(6.25～50.00 μmol/L)以及200 μL的fluorescein(熒光指示劑，0.96 μmol/L)，于37 ℃熒光酶標(biāo)儀中溫育20 min，然后每個孔再加入20 μL，119 mmol/L用磷酸緩沖液配置的偶氮類化合物ABAP(現(xiàn)用現(xiàn)配)。利用熒光酶標(biāo)儀在波長485 nm處激發(fā)，每5 min在波長520 nm處釋放測定，立即讀數(shù)，循環(huán)30次。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。試驗測得的各微孔不同時間點的絕對熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)與其初始時間的熒光強(qiáng)度相比，折算成相對熒光強(qiáng)度，相對熒光強(qiáng)度對時間求積分得到凈面積。待測樣品的ORAC值就是以μmol Trolox/g樣品表示，具體計算公式[18]：

(2)

式中：

ORAC——總抗氧化能力指數(shù)，μmol Trolox/g；

A1——時間—樣品熒光值曲線下完整面積；

A2——時間—Trolox光值曲線下完整面積；

A——時間—對照熒光值曲線下完整面積；

C1——Trolox摩爾濃度；

C2——樣品摩爾濃度。

除去空白值和初始熒光值后，每個黍子樣品對應(yīng)時間-熒光值曲線下的積分面積即樣品中抗氧化物質(zhì)的CAA值，黍子提取物的CAA值以每100 g干物質(zhì)相當(dāng)于槲皮素(QE)的毫摩爾當(dāng)量表示，計算公式：

(3)

式中：

CAA——細(xì)胞抗氧化活性，mmol QE/100 g；

Sa——時間—樣品熒光值曲線下完整面積；

Sb——時間—對照熒光值曲線下完整面積。

1.3.7 小鼠肝臟抗氧化活性檢測 建立與人類肥胖最為接近的C57L/6雄性小鼠，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由采食和飲水，隨機(jī)分為正常對照組(飼喂基礎(chǔ)飼料)、 模型對照組(飼喂高脂高膽固醇飼料，建立混合型高脂血癥動物模型)及6組試驗組(10%黍子粉+高脂飼料)，每組7只。連續(xù)飼喂高脂高膽固醇飼料或含黍子的高脂高膽固醇飼料12周，取小鼠肝組織并在冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干。稱取0.3 g肝組織放入勻漿管中，加入2.7 mL 0.86%冷生理鹽水，用組織搗碎機(jī)10 000 r/min制備10%勻漿，將制備好的10%勻漿用低溫離心機(jī)2 000 r/min，離心15 min取上清液，按照試劑盒說明測定小鼠肝臟的總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力，以及丙二醛(MDA)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各檢測指標(biāo)分別測定3次，取平均值，采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性方差分析，組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式為(mean±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黍子的抗氧化作用效果

高脂飲食已被證明能引起小鼠肝臟抗氧化機(jī)能的顯著降低[21]，因此可用來評價功能性食品或功能因子對肝臟抗氧化作用的影響。由表2可知，高脂日糧條件下，小鼠體重增長率和肝臟指數(shù)比對照組顯著提高，高脂日糧添加黍子后，小鼠體重增長率和肝臟指數(shù)總體上呈現(xiàn)降低趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。與對照組相比，高脂飲食組中小鼠肝臟的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力降低并不明顯(P>0.05)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力降低了10%左右(P>0.05)，而肝組織中丙二醛(MDA)含量則顯著提高了2.6倍(P<0.05)。這些結(jié)果表明了高脂飲食條件下，小鼠肝臟的抗氧化機(jī)能明顯降低。

在高脂日糧中添加黍子后，小鼠肝臟的抗氧化指標(biāo)因品種的不同而差異較大。與單純高脂日糧組相比，除了寧糜9號和晉黍5號組外，添加黍子組的T-SOD活性呈現(xiàn)增加趨勢，且黃糜子和寧糜11號組為顯著提高(P<0.05)。GSH-PX活性的增加趨勢更為明顯，且有寧糜9號、黃糜子、晉黍8號和晉黍5號4個黍子組的GSH-PX活性得到顯著提高(P<0.05)。黍子對小鼠肝臟MDA含量的降低效果不佳，差異也較大，只有黃糜子和紅糜子組的MDA濃度呈現(xiàn)降低趨勢，但降低程度不顯著(P>0.05)，說明黍子降低小鼠肝臟MDA含量的效果不佳。上述結(jié)果表明，黍子可通過影響T-SOD和GSH-PX活性，起到改善高脂飲食條件下小鼠肝臟抗氧化能力的作用，但這種影響作用會因為黍子不同的品種而差異較大，這種差異與不同的黍子品種，功能活性物質(zhì)的含量不同有關(guān)。

表2 黍子對高脂日糧C57 BL/6小鼠肝臟抗氧化性能的影響?

? 用Duncan法進(jìn)行多重比較。同列中肩部有相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)；標(biāo)有不同字母者代表組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 黍子的黃酮和多酚含量

作為一種全谷物食品，黍子功能活性物質(zhì)種類和含量復(fù)雜，其中黃酮和多酚是與其抗氧化活性相關(guān)的兩種主要功能物質(zhì)。Zhang Li-zhen等[22]曾分析了3個品種的黍子中所含的植物化學(xué)成分，表明黍子籽粒和殼粉均含有豐富的多酚類物質(zhì)，并提出黍子可以作為天然抗氧化劑的來源之一。本研究結(jié)果(圖1)表明不同品種黍子，其黃酮和多酚的含量均存在顯著性差異(P<0.05)，黃糜子多酚含量為(3.44±0.07) mg/g，比含量最低的晉黍8號(0.78±0.03) mg/g高出4倍，總多酚含量變異系數(shù)可達(dá)63.61%，變幅為0.78～3.44 mg/g?？傸S酮含量以晉黍5號最高為(10.17±0.45) mg/g，紅糜子含量最低為(0.89±0.08) mg/g，前者約為后者的11倍，變異系數(shù)可達(dá)68.46%，變幅為0.89～10.17 mg/g。圖1結(jié)果還表明，多酚含量高的黍子品種，其黃酮含量相對較低；而多酚含量低的黍子品種，其黃酮含量相對較高；即兩者存在某種程度的負(fù)相關(guān)。

不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 The flavonoids and polyphnols contents in different breeds of proso millets

2.3 黍子提取物的總抗氧化能力指數(shù)和細(xì)胞抗氧化活性分析

由于黃酮水溶性較差，而多酚的水溶性較好，因此本研究分別檢測了黍子水提物和醇提物的抗氧化能力指數(shù)(ORAC)。由表3可知，不同品種黍子提取物，其ORAC值差異顯著。紅糜子水提物的ORAC值高于或顯著高于其它黍子品種，而其醇提物抗氧化能力卻顯著較低。晉黍5號、晉黍8號及寧糜11號乙醇提取物的ORAC值顯著較高(P<0.05)?？侽RAC值以晉黍5號為最高，紅糜子最低，兩者相差達(dá)1.57倍。多酚含量較高，而黃酮含量較低的紅糜子水提物的ORAC值高于或顯著高于其它黍子品種，而其醇提物ORAC值卻最低；表明黍子水提物的抗氧化活性以多酚為主，而醇提物的抗氧化活性則以黃酮為主，而黍子總抗氧化能力則取決于多酚和黃酮的總含量。

本研究進(jìn)一步采用細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性試驗(CAA試驗)對不同品種黍子的抗氧化活性進(jìn)行了研究，由表4可知，所采集6種黍子水提物的細(xì)胞抗氧化能力依次為：晉黍5號>晉黍8號>寧糜11>寧糜9號>黃糜子>紅糜子，紅糜子和黃糜子CAA值顯著低于其他幾個品種(P<0.05)。6種黍子醇提物的細(xì)胞抗氧化能力依次為：晉黍8號>晉黍5號>寧糜子9號>寧糜11>紅糜子>黃糜子。黍子的總CAA值同樣以紅糜子和黃糜子最低(P<0.05)。且除紅糜子和黃糜子外，其他品種黍子，其水提物CAA值均低于醇提物。這與黍子的ORAC試驗得出的結(jié)論一致。

表3 不同品種黍子的ORAC值?

? 肩部有相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)；肩部不同字母代表兩者有顯著差異(P<0.05)。

表4 不同品種黍子的CAA值?

? 肩部有相同字母代表無顯著性差異(P>0.05)；肩部不同代表兩者有顯著差異(P<0.05)。

2.4 黍子抗氧化性能與其黃酮和多酚含量之間的關(guān)系

如何正確評價谷物的健康功效，一直是眾多消費者和研究人員感興趣的問題。谷物中功能活性物質(zhì)的含量常常被用作評價其具有某種健康功效重要依據(jù)，然而谷物健康功效往往是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，很難依據(jù)某個單一的組分進(jìn)行其功能的判定，必須通過體外、離體細(xì)胞和體內(nèi)等多種試驗，進(jìn)行結(jié)論的判定。本研究主要研究了基于ORAC和CAA法得到的黍子抗氧化活性與其主要抗氧化物質(zhì)黃酮和多酚含量之間的關(guān)系。由圖2可知，黍子粗提物，包括乙醇提取物和水提物的總抗氧化能力指數(shù)(ORAC)隨黃酮和多酚含量的增加而增加，且具有較高的線性相關(guān)性(R2=0.811)；黍子提取物的抗氧化活性隨黃酮和多酚含量的增加也呈線性增加的趨勢(R2=0.565)，但相關(guān)性不是很強(qiáng)。黍子的ORAC和CAA均與多酚和黃酮的總含量線性相關(guān)，而與單純的多酚和黃酮含量之間關(guān)系并不顯著(R2<0.5，圖省略)。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)粳性品種和糯性品種黍子在抗氧化活性和多酚及黃酮含量方面的規(guī)律性差異。

圖2 黃酮和多酚含量與黍子抗氧化性能之間的關(guān)系

3 結(jié)論

C57BL/6肥胖小鼠模型試驗表明，黍子的添加對小鼠肝臟的抗氧化能力起到了明顯的改善作用，且不同黍子品種影響的程度不同。不同黍子品種間多酚和黃酮的含量差異較大，尤其是黃酮含量的種間差異最大。ORAC 和CAA試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黍子的多酚和黃酮的總含量與其抗氧化活性線性相關(guān)，可作為黍子抗氧化能力的判定依據(jù)。黍子作為小雜糧品種，具有超強(qiáng)的抗逆性、較短的生長周期、低廉的價格及潛在的生理活性等特點，然而相對燕麥、蕎麥和大麥等雜糧品種，黍子并未受到應(yīng)有的重視。充分利用黍子資源開發(fā)各種功能性食品與保健食品應(yīng)是黍子開發(fā)的一個重要方向。

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The antioxidant activity and its relationship with the functional components in proso millet

ZHENG Nan-nan1,2QIWen-tao2WANGChun-ling1YUNTing-ting2YAOYang3RENGui-xing3

(1.TianjinUniversityofScience&Technology,Tianjin300222,China; 2.AcademyofStateAdministrationofGrain,Beijing100037,China; 3.InstituteofCropSciencesofCAAS,Beijing100081,China)

The effects of proso millets on the antioxidant activity of liver were evaluated by the high-fat diet C57BL/6 mice model, and the relationship of antioxidants with the contents of main bioactive compounds in proso millets were also studied based on the chemical and cellular analyses of the polyphenols and flavonoids contents. The results showed that the high-fat diet reduced the hepatic antioxidant capacity of liver, while the addition of proso millets could improve it significantly with a high-fat diet. The contents of both polyphenols and flavonoids were significantly different among different breeds of proso millets. The variation coefficient of total polyphenol was 63.61%, ranging from 0.78 to 3.44 mg/g, while that of the total flavonoid content was 68.46%, ranging from 0.89 to 10.17 mg/g. The Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and cellular antioxidant activity (CAA) of different breeds of proso millets were found different. Moreover, both of the ORAC and CAA of proso millet were correlated with the total contents of polyphenols and flavonoids, shown a positive linear relationship, and the linear coefficients (R2) were 0.81 and 0.57, respectively.

proso millet; antioxidant activity; polyphenols; flavonoids; linear relationship

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.030

糧食公益性行業(yè)科研專項(編號：201313006-5)

鄭楠楠，女，天津科技大學(xué)在讀碩士研究生。

綦文濤(1977—)，男，國家糧食局科學(xué)研究院副研究員，博士。E-mail:qwt@chinagrain.org

2016—11—28