分子標(biāo)記輔助選育抗稻瘟病水稻新品種中科鹽8號

宛柏杰， 張夢龍， 岳紅亮， 劉 凱， 趙紹路， 朱靜雯， 代金英， 嚴(yán)國紅， 王愛民， 朱國永， 唐紅生， 孫明法

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城 224000)

稻瘟病是水稻上的主要病害之一，近年來，其危害面積和程度呈現(xiàn)不斷上升趨勢，對水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)有嚴(yán)重的阻礙。由于稻瘟病菌不同生理小種的變化，品種抗性可能會隨著推廣時間的增加出現(xiàn)降低，因此，防治稻瘟病最經(jīng)濟有效的方法就是不斷地選育和利用抗病品種。目前已經(jīng)鑒定出100多個稻瘟病抗性基因，其中主效稻瘟病抗性基因約有24個，在水稻不同的染色體上均有分布。-位于水稻第12號染色體上，是最早被克隆的主效抗稻瘟病基因之一，編碼1個長度為928個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白。Bryan等研究發(fā)現(xiàn)，抗病基因-編碼的產(chǎn)物可以和稻瘟病菌中對應(yīng)無毒基因表達(dá)的產(chǎn)物相互作用，引發(fā)植物的抗病反應(yīng)，使水稻對稻瘟病菌產(chǎn)生抗病性，這符合基因?qū)虻募僬f。王軍等研究認(rèn)為，在江蘇省粳稻種植區(qū)域，稻瘟病抗性基因-和-具有良好的抗性表現(xiàn)和應(yīng)用價值，并且-基因已經(jīng)在稻瘟病抗性育種中得到應(yīng)用。鄒拓等研究發(fā)現(xiàn)，在冀東稻區(qū)水稻中含有抗稻瘟病基因-，對稻瘟病菌抗性也起到主效作用。王小秋等對江蘇省近年來育成的水稻新品種進(jìn)行稻瘟病抗性基因檢測發(fā)現(xiàn)，-基因在材料中的分布頻率在45%以上，并且含有“+-”基因組合的材料，稻瘟病抗性較好，對改良江蘇省粳稻稻瘟病抗性具有重要的育種應(yīng)用價值，并且還發(fā)現(xiàn)在檢測的品種中，其攜帶抗病基因數(shù)量與抗病性沒有達(dá)到顯著相關(guān)性，說明在水稻稻瘟病抗病育種中，需要應(yīng)用主效基因或組合，而不是簡單的增加抗病基因的數(shù)量。邢運高等對黃淮稻區(qū)早熟水稻品種(系)的稻瘟病抗性與抗性基因相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，攜帶抗性基因-的材料，2019、2020年抗性比例分別為42.6%、49.2%，說明抗性基因-在黃淮稻區(qū)有較好的應(yīng)用。在系譜選育過程中，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將主效抗稻瘟病基因?qū)氲揭粋€品種中，改良品種的稻瘟病抗性，可以增加品種對稻瘟病抗性的持久性。

本研究以大面積推廣品種徐稻3號為母本、水稻中間材料鹽99-77為父本進(jìn)行雜交育種。利用分子標(biāo)記輔助選擇改良徐稻3號水稻品種的抗病性，在后代中選育出抗稻瘟病、產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)的水稻新品種——中科鹽8號，于2021年通過國家品種審定委員會審定(審定編號：國審稻20210391)，創(chuàng)制了新的抗稻瘟病種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

徐稻3號為徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所水稻室育成的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)粳稻品種；鹽99-77(攜帶稻瘟病抗性基因-)為江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的水稻中間材料，以及徐稻3號/鹽99-77配置的雜交種，用于稻瘟病分子標(biāo)記檢測的F代家系編號為W1～W30。

1.2 稻瘟病抗性鑒定

由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供供試菌株，接種方法參照水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術(shù)規(guī)程，接種后30 d左右進(jìn)行病情調(diào)查，稻瘟病鑒定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 稻瘟病鑒定標(biāo)準(zhǔn)

1.3 Pi-ta的標(biāo)記檢測

參考朱勇良等的方法提取DNA?？沟疚敛』?引物設(shè)計參照陳鋒等的方法(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 稻瘟病抗病基因檢測引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因Pi-ta PCR擴增檢測

對F代選育的30個品系進(jìn)行稻瘟病抗性基因-PCR檢測。徐稻3號作為陰性對照，鹽 99-77 作為陽性對照。從圖1可以看出，其中有16個水稻株系成功擴增出1 042 bp的條帶，表明其中16個株系含有-抗病基因，14個水稻株系不含有-抗病基因，含有抗病基因的株系分別為 W1～W7、W16、W18～W20、W25～W29，抗病基因出現(xiàn)的頻率為53.3%。

2.2 稻瘟病接種鑒定

采用人工接種的方法，對親本徐稻3號、鹽 99-77 以及選育的30個水稻F株系進(jìn)行穗頸瘟人工接種鑒定，部分水稻株系接種稻瘟病菌后發(fā)病表現(xiàn)見圖2。由圖2、 表3可知， 徐稻3號表現(xiàn)為中感(病級為5級)，鹽99-77表現(xiàn)為中抗(病級為3級)，30份試驗材料中達(dá)到中抗的材料有8份、中感的材料有10份、感的材料有10份，高感的材料有2份。含有-抗病基因的材料，抗性等級都達(dá)到中感或中抗，達(dá)到中抗等級的材料，都含有-抗病基因。接種抗性表現(xiàn)為感病和高感的材料，都不含有-抗病基因。說明-抗病基因?qū)μ岣咚镜疚敛】剐云鸬揭欢ǖ姆e極作用。

表3 F7株系接種鑒定與基因檢測結(jié)果

2.3 中科鹽8號選育過程

2008年夏，在江蘇省鹽城市南洋試驗農(nóng)場用徐稻3號與鹽99-77雜交配組，獲雜交種35粒，后經(jīng)過鹽城市和海南省三亞市3年5代異地選擇，2012年在F代通過分子標(biāo)記輔助選擇和稻瘟病接種鑒定，篩選出優(yōu)良單株進(jìn)入鑒定圃，2015年鑒定的606號表現(xiàn)突出，2016進(jìn)入大區(qū)品比試驗，命名為鹽稻15606，2017—2018年進(jìn)行多點品比試驗，表現(xiàn)出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗等特點。2019—2020年以鹽稻15606名稱推薦參加國家黃淮海粳稻區(qū)域試驗和生產(chǎn)試驗，2021年報審國家品種審定委員會審定，定名為中科鹽8號。中科鹽8號系江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所合作，育成的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)多抗常規(guī)中粳稻新品種，選育過程見圖3。

2.4 抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)水稻新品種中科鹽8號的農(nóng)藝性狀

中科鹽8號于2019年推薦參加連云港農(nóng)業(yè)科學(xué)院組織的國家黃淮海粳稻區(qū)域試驗，全生育期155.2 d，比對照徐稻3號晚熟2.0 d，主要農(nóng)藝性狀2年區(qū)試綜合表現(xiàn)為有效穗數(shù)318.0萬穗/hm，株高100.2 cm，穗長16.8 cm，總粒數(shù)150.8 粒/穗，結(jié)實率 86.4%，千粒質(zhì)量 26.4 g。中科鹽8號成熟期田間抗病性表現(xiàn)見圖4。2019—2020年江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所稻瘟病鑒定(表4)，天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻瘟病鑒定(表5)，2年稻瘟病抗性平均綜合指數(shù)分別為2.0和3.5級，穗瘟損失率最高級3級。主要米質(zhì)指標(biāo)2年綜合表現(xiàn)：整精米率65.2%，堊白度3.2%，透明度1級，直鏈淀粉含量15.1%，膠稠度74 mm，堿消值7.0%，達(dá)到農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 593—2021《食用稻品種品質(zhì)》3級(表6)，米質(zhì)表現(xiàn)見圖5。2019年中科鹽8號參加試驗，

表4 中科鹽8號與對照稻瘟病抗性比較(南京)

表5 中科鹽8號 與對照稻瘟病抗性比較(天津)

表6 中科鹽8號 與對照品種稻米品質(zhì)比較

平均產(chǎn)量為10 250.55 kg/hm，比對照徐稻3號增產(chǎn)5.33%；2020年續(xù)試，平均產(chǎn)量10 152.30 kg/hm，比對照徐稻3號增產(chǎn)6.93%；2年區(qū)域試驗平均產(chǎn)量10 201.50 kg/hm，比對照徐稻3號增產(chǎn)6.12%；2020年生產(chǎn)試驗，平均產(chǎn)量10 189.65 kg/hm，比對照徐稻3號增產(chǎn)6.36%(表7)。

表7 中科鹽8號與對照品種產(chǎn)量比較

3 討論與結(jié)論

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，水稻育種將逐漸從常規(guī)田間經(jīng)驗育種向分子智慧育種轉(zhuǎn)變。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可以快速和準(zhǔn)確地篩選出含有目的基因的植株，加快育種的效率。通過常規(guī)雜交育種的方法，將含有抗病基因的材料與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種進(jìn)行雜交，得到的后代通過不斷地與改良親本進(jìn)行回交，在后代材料中篩選出與回交親本性狀相似的材料，再利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)檢測材料中是否含有抗病基因，就可以篩選到含有抗病基因的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻新材料。范方軍等利用水稻抗病基因-研究其與穗頸瘟的相關(guān)性，得到穗頸瘟的發(fā)病程度與稻瘟病抗性基因-存在顯著正相關(guān)。戴小軍等對水稻資源中抗性基因、、以及的分布進(jìn)行研究，并對含有不同抗性基因材料的抗性反應(yīng)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，當(dāng)材料中含有主效基因，并且同時含有-，其稻瘟病抗性表現(xiàn)為抗病。王軍等利用標(biāo)記輔助選擇并結(jié)合多年田間選育和抗性鑒定，成功將3個抗病基因?qū)氲礁弋a(chǎn)品種中。

由于稻瘟病病菌生理小種會不斷的發(fā)生變異，抗病品種會隨著稻瘟病生理小種的變化，抗性逐漸減退，甚至可能喪失。因此，廣譜抗稻瘟病基因的挖掘越來越重要，近年來，從水稻品種谷梅四號中成功克隆到廣譜抗稻瘟病基因，并且基因已經(jīng)在水稻抗病育種中得到應(yīng)用。Li等研究發(fā)現(xiàn)，在水稻地方品種地谷中含有廣譜抗稻瘟病基因，其抗病機制是通過抑制相關(guān)基因的表達(dá)，增加水稻細(xì)胞中HO的富集，來提高水稻的抗稻瘟病能力。除了挖掘和利用廣譜抗稻瘟病單基因外，通過基因聚合育種實現(xiàn)水稻品種持久抗病也是目前關(guān)注的重點。陳紅旗將稻瘟病抗性基因、和，通過多次回交與標(biāo)記選擇聚合在一起，以此來提高材料抗稻瘟病的持久性。柳武革等將和基因?qū)氲饺挡挥禈s豐A中，選育出的新不育系和不同恢復(fù)系配組，其后代均表現(xiàn)出良好的稻瘟病抗性和豐產(chǎn)性。本研究利用攜帶稻瘟病抗性基因-的水稻中間材料鹽99-77為父本，與大面積推廣品種徐稻3號為母本進(jìn)行雜交育種，改良徐稻3號水稻品種的抗病性，將抗病基因-成功導(dǎo)入到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種徐稻3號中，選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病新品種中科鹽8號。雖然本研究僅僅利用了一個抗稻瘟病基因-，但由于-是主效抗病基因，在后代含有-基因的材料抗病性都表現(xiàn)不會太差，也有可能后代抗性表現(xiàn)好的材料，同時含有其他的未被檢測的抗病基因。綜上所述，通過在傳統(tǒng)育種過程中，利用主效抗病基因改良稻瘟病抗性，可以快速選育出抗病品種。