用復(fù)合誘導(dǎo)型骨修復(fù)材料修復(fù)兔橈骨缺損的實驗研究

李 根 甄 平 成滿平 趙紅斌

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院，蘭州 730050)

用復(fù)合誘導(dǎo)型骨修復(fù)材料修復(fù)兔橈骨缺損的實驗研究

李 根 甄 平 成滿平 趙紅斌*

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院，蘭州 730050)

以不同的載藥方式構(gòu)建4種殼聚糖/聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯(PHBV)復(fù)合誘導(dǎo)型骨修復(fù)材料，檢測并比較4種支架材料對兔橈骨缺損的修復(fù)效果，篩選出最佳骨修復(fù)材料并確定最佳藥物控釋方式。以淫羊藿苷為誘導(dǎo)因子，采用兩相混合冷凍干燥技術(shù)以微球載藥、改性藥物微球(W/O法制得并表征)、改性藥物與材料共價結(jié)合等藥物添加方式及不加藥制得4種支架材料，并對其進行顯微結(jié)構(gòu)以及載藥支架藥物緩釋表征，后將4種材料分別植入兔橈骨缺損處，于1、3、6個月進行X射線及三維CT觀察支架材料對兔橈骨缺損的修復(fù)情況，HE，Masson染色觀察其誘導(dǎo)成骨效果。結(jié)果表明，支架材料呈網(wǎng)絡(luò)狀串珠狀的顯微結(jié)構(gòu)，載藥微球粒徑分布在3～11 μm，載藥支架材料有著良好的藥物緩釋，其中共價結(jié)合組藥物釋放峰值時間較其他組推遲，為72 h，且峰值后藥物緩釋量迅速平穩(wěn)為75 μg左右。X射線及三維CT觀察顯示，最終共價結(jié)合組支架材料骨缺損處連通，且骨密度高于其他3組。HE、Masson染色結(jié)果顯示，共價結(jié)合組成骨效果優(yōu)于其他組。共價結(jié)合的藥物添加方式能使支架具有良好的藥物緩釋效果，進而對兔橈骨缺損表現(xiàn)出良好的修復(fù)效果。

聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯；誘導(dǎo)；共價結(jié)合；骨修復(fù)

引言

骨損傷是臨床常見病，目前常采用自體骨、異體骨或組織工程骨移植等方法治療[1]。自體骨移植是骨缺損修復(fù)治療的金標準，但來源有限且給供骨區(qū)造成新傷，異體骨移植因免疫排異反應(yīng)失敗風(fēng)險大[2]，組織工程骨有較高的生物安全性，來源廣泛，因而對于骨缺損修復(fù)有著良好的前景[3]。

支架材料力學(xué)性能與宿主骨接近，既可對骨缺損部位起到一定的支撐作用，又能夠促進骨缺損的修復(fù)[4]。目前大部分骨組織工程材料力學(xué)性能均未能與骨本身匹配，天然高分子材料力學(xué)性能較差，合成高分子材料力學(xué)性能稍好，但降解性能較差，因此，將二者進行復(fù)合制備力學(xué)強度和生物降解性兼具的生物支架材料，在臨床應(yīng)用中具有一定的潛力。復(fù)合生物材料最接近人體骨的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)性能，有類似自然組織的構(gòu)型和功能[5]。第三代骨組織工程支架材料提出支架材料中添加誘導(dǎo)因子以促進缺損處骨修復(fù)，目前誘導(dǎo)因子主要以各種骨相關(guān)生長因子為主[6]，淫羊藿苷(icariin，Ica)是非常有效的生骨中藥，性質(zhì)穩(wěn)定，以某種形式添加至支架材料使之緩釋，能夠長效誘導(dǎo)骨缺損處新骨形成[7]。

本實驗以合成高分子材料PHBV和天然高分子材料殼聚糖為基礎(chǔ)材料制備了4種復(fù)合支架材料，一種作為空白對照，另外3種以不同形式添加以Ica。通過4種支架對青紫藍兔橈骨缺損進行修復(fù)，評價比較3種藥物添加方式所制支架材料各自在實驗兔體內(nèi)對橈骨骨缺損的修復(fù)效果，旨在從中篩選出1種骨修復(fù)效果最佳的支架材料及1種最佳的藥物添加方式，為將來臨床應(yīng)用提供動物實驗參考。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物：4月齡清潔級青紫藍兔36只，雌雄不限，體重2.0～3.0 kg(蘭州生物制品研究所提供，許可證號：(甘)SYXK2007-002)。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)要求。

淫羊藿苷(中國食品藥品檢定研究院)、羧甲基殼聚糖(粘均分子量9 000，南京森貝伽生物科技有限公司)、 殼聚糖(脫乙酰度≥85%，粘均分子量約300 000，濟南海得貝海洋生物工程有限公司)、六氟異丙醇(Sigma，美國)、PHBV(粘均分子量約360 000，寧波天安生物材料有限公司)、EDC(阿拉丁公司)、NHS(阿拉丁公司)。Masson染色試劑盒(北京博奧拓達科技有限公司)。

動物手術(shù)用聚光燈(江陰光電儀器有限公司)、ZT-12M2生物組織自動脫水機(湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)、TB-718E生物組織自動包埋機(湖北泰維醫(yī)療科技有限公司)、Rotary Microtome 820組織切片機(美國AO)、X線照射拍片系統(tǒng)(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院放射科提供)、640層螺旋CT(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院影像診斷科提供)。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖載藥微球的制備

殼聚糖作為緩釋材料，W/O法制備載藥微球：室溫下取200 mL液體石蠟于500 mL錐形瓶中，加1 mL的Span-80磁力攪拌混合均勻，制成油相；取40 mg Ica或Ica-NH2加入提前配好的40 mL 0.75%(W/V)的殼聚糖醋酸溶液中，充分混合溶解(醋酸濃度為1 %(V/V))制成水相。將水相緩慢(30 s/滴)滴入油相中，磁力攪拌乳化分散待微球全部固化，離心，石油醚洗滌2次，無水乙醇洗滌4次，冷凍干燥，即獲得Ica或Ica-NH2的殼聚糖微球(Ica-CSM或Ica-NH2-CSM)。

1.2.2 羧甲基殼聚糖與淫羊藿苷共價結(jié)合

首先用二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl pyrocarbonate，BOC)把氨基乙酸(glycine，GLY)中的氨基保護起來[8]，然后將Ica和被保護了氨基的GLY用二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC)/4-二甲氨基吡啶(4-dimethylamino pyridine，DMAP)縮合成酯[9]，脫掉BOC即得到氨基化產(chǎn)物[10]，最后利用EDC/NHS法把Ica-NH2中的氨基與材料中的羧甲基殼聚糖上的羧基通過縮合反應(yīng)連接起來[11]。

1.2.3 微球的掃描電鏡圖

取Ica-CSM、Ica-NH2-CSM各少量，將微球樣品均勻撒在粘有導(dǎo)電膠的硅片上，噴金，掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微球的表面形貌。

1.2.4 支架材料的構(gòu)建

本實驗共制備了4種支架材料，分別是空白對照組(PHBV 和CS)、Ica-CSM 組(PHBV、CS和Ica- CSM)、Ica-NH2-CSM組(PHBV、CS和Ica-NH2-CSM)和Ica-NH2共價組(PHBV、CS和氨基化淫羊藿苷羧甲基殼聚糖共價結(jié)合物)。

1.2.4.1 空白材料對照組支架材料的制備

將100 mL 20 %(W/V)的聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯(polyhydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate，PHBV)溶液(溶劑為二氯甲烷)倒入50 mL 5%(W/V)的CS醋酸溶液中，勻漿機11 000 r/min高速攪拌均勻后，靜置沉積脫泡，擠壓注入環(huán)形不銹鋼模具中(內(nèi)徑4 mm，外徑6 mm；長13 mm)成型，連同模具一同置于液氮中冷凍10 min，迅速取出，置4℃水中5～10 s后，脫模，冷凍干燥成型，得到直徑3.4～3.5 mm，長(12±1) mm的淡色圓柱狀支架材料。

1.2.4.2 Ica-CSM組支架材料的制備

將100 mL 20 %(W/V)的PHBV溶液(溶劑為二氯甲烷)倒入到50 mL 5 %(W/V)的混合有一定量Ica-CSM的5%(W/V)的CS醋酸溶液中(后續(xù)步驟與本文第2.4.1節(jié)相同)，所得支架材料外觀與本文第2.4.1節(jié)中空白材料對照組支架材料相同。

將 100 mL 20%(W/V)的 PHBV 溶液(溶劑為二氯甲烷)倒入到 50 mL 5%(W/V)的混合有一定量Ica-NH2-CSM的5 %(W/V)的CS醋酸溶液中(后續(xù)步驟與本文第2.4.1節(jié)相同)，所得支架材料外觀與本文第2.4.1節(jié)中空白材料對照組支架材料相同。

1.2.4.4 Ica-NH2共價鍵結(jié)合組支架材料的制備

將100 mL 20 %(W/V)的PHBV溶液(溶劑為二氯甲烷)倒入到50 mL 5%(W/V)的混合有Ica-NH2共價結(jié)合的羧甲基殼聚糖的5%(W/V)的CS醋酸溶液中(后續(xù)步驟與本文第2.4.1節(jié)相同)，所得支架材料外觀與本文第2.4.1節(jié)中空白材料對照組支架材料相同。

1.2.5 支架材料顯微結(jié)構(gòu)表征

骨修復(fù)材料斷面經(jīng)噴金后，掃描電子顯微鏡觀察材料的斷面形態(tài)。

1.2.6 3種載藥支架材料的藥物緩釋

3種載藥支架材料各取3塊，置于10 mL、0.01 M的PBS中，37℃，分別于1、2、4、8、12、24 h取緩釋液樣品，隨后隔24 h取樣直到336 h，每次取樣1 mL保存待測，并回補1 mL、0.01 M的PBS，全部取樣完畢，利用紫外分光光度計于270 nm處檢測不同時間點的吸光度，計算緩釋量并繪制藥物緩釋曲線。

固若金湯！那個狗日的胖子煤老板整日嘴上喋喋不休著說西山固若金湯！去他媽的固若金湯吧！西山成了我們這些窯黑子兄弟集體的墳?zāi)沽耍銋s用什么“固若金湯”來灌我們。你狗日的愚弄了我們啊！我要殺了你!不，我要掐死你！我要用牙齒咬斷你的喉管，讓它向外汩汩地冒血！我想你的血也一定是黑的，和西山的煤面兒一樣黑。

1.2.7 復(fù)制兔橈骨骨缺損模型

清潔級青紫藍兔36只，雌雄不拘，體重2.0～3.0 kg，隨機分為A、B、C、D等4組，每組9只。術(shù)前24 h禁食禁水。

手術(shù)流程：稱體重，3%(W/V)戊巴比妥鈉通過耳緣靜脈注射進行麻醉，劑量為1.0 mL/kg，采取俯臥位將實驗兔固定在手術(shù)臺上，實施手術(shù)的區(qū)域去毛備皮，碘伏涂抹消毒，鋪無菌洞巾，于兔左前臂平行于橈骨的方向從中間位置將皮割開，后小心分離肌肉、筋膜，直至橈骨手術(shù)段充分暴露，骨剪剪除橈骨1.2 cm骨段，并徹底刮除該段骨膜。

1.2.8 實驗分組及手術(shù)

A組為空白對照組，B組為Ica-NH2共價組，C組為Ica-NH2-CSM組，D組為Ica-CSM組。用支架材料修復(fù)骨缺損模型，植入的支架材料兩端跟橈骨兩斷端對齊，用醫(yī)用縫合線固定于腓骨上，逐層縫合傷口，涂抹碘伏，無菌紗布、繃帶包扎固定傷口。

1.2.9 術(shù)后處理

4組實驗動物術(shù)后持續(xù)觀察傷口情況，碘伏涂抹傷口。術(shù)后麻醉期間置保溫燈下保溫，待實驗兔蘇醒后分別將其置于飼養(yǎng)籠內(nèi)，連續(xù)3天青霉素肌肉注射，每只每天注射4萬單位，以預(yù)防傷口感染。分別于術(shù)后1、3、6個月取實驗兔空氣栓塞法處死，取骨缺損修復(fù)處及周邊組織，10%福爾馬林固定后待處理。

1.2.10 動物術(shù)后及大體標本觀察

術(shù)后3天內(nèi)觀察實驗兔飲食、運動、傷口恢復(fù)等情況，并記錄；分別于術(shù)后1、3、6個月空氣栓塞法處死，完全暴露骨缺損修復(fù)段，大體觀察骨缺損修復(fù)情況，拍照記錄。

1.2.11 X射線檢測

各組分別于術(shù)后1、3、6個月每組取3只實驗兔共12只，對骨缺損區(qū)行X射線檢查，垂直投照，距離40 cm，劑量1 500 mA，曝光時間2 s。

1.2.12 三維CT觀察

每組取3只實驗兔麻醉后固定于CT床上，掃描其左前臂骨缺損修復(fù)處。

1.2.13 組織學(xué)觀察

分別于術(shù)后1、3和6個月處死實驗兔，分離并完整取下橈腓骨骨段，10%的福爾馬林常溫下固定72 h后，于5 %的EDTA脫鈣液中進行常規(guī)脫鈣，每周更換一次EDTA，脫鈣完畢后取材，分別取橈骨腓骨橫截面及縱截面；自動脫水機脫水，石蠟包埋機包埋，切片機連續(xù)切片，厚度為5 μm，行HE及Masson等組織學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 SEM觀察微球及粒徑分布測定

圖1為殼聚糖微球SEM照片以及粒徑分析，可以看出，兩種微球均具有較好的成球性，表面光滑。Ica-CSM粒徑主要集中在3～11 μm范圍內(nèi)，以4～7 μm小球居多(見圖1(a))，而Ica-NH2-CSM微球粒徑主要集中在3～8 μm范圍內(nèi)，以3～5 μm小球居多，均勻性更好見(圖1(b))。

圖1(c)～(d)為動靜態(tài)多角度激光光散儀測定的3種微球的微球粒徑分布?？梢姡瑑煞N微球的粒徑主要集中在3～12、3～9 μm范圍內(nèi)。

圖1 微球SEM觀察與粒徑分析。(a)Ica-CSM的掃描電鏡觀察；(b) Ica-NH2-CSM的掃描電鏡觀察；(c)Ica-CSM的粒徑分析(d)Ica-NH2-CSM的粒徑分析Fig.1 SEM observation of the microsphere and its particle size analysis.(a) SEM scaning of Ica-CSM；(b)SEM scaning of Ica-NH2-CSM；(c)Particle size of Ica-CSM；(d)Particle size of Ica-NH2-CSM

2.2 支架材料及其顯微結(jié)構(gòu)

圖2為支架材料及其微觀結(jié)構(gòu)，支架材料為直徑3.4～3.5 mm、長(12±1)mm的淡色固體棒狀物(見圖2(a))，橫截面顯示中間留孔(見圖2(b))，顯微結(jié)構(gòu)呈網(wǎng)絡(luò)狀串珠狀的分布，PHBV 呈鏈接球狀(鏈球直徑約1 μm)，均勻分布在CS聚合物的網(wǎng)絡(luò)之間，整個斷面均勻分布著0.3～1.0 μm的微孔(見圖2(c))。

圖2 支架材料外觀及其顯微結(jié)構(gòu)(a)支架材料的外觀；(b)支架材料橫截面形貌；(c)支架材料的顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 The scaffold and its microstructure (a) Appearance of the scaffold; (b) Cross section of scaffold topography; (c) Microstructure of the scaffold

2.3 3 種載藥支架材料的藥物緩釋

圖3為3種載藥支架材料的藥物緩釋曲線，顯示，Ica-CSM組支架材料(見圖3(c))和Ica-NH2-CSM組支架材料(見圖3(b))的藥物釋放在48 h達到最大，均達到了225 μg 左右，48 h后，藥物緩釋緩慢減少，藥物釋放逐漸趨于平緩；而Ica-NH2共價組(見圖3(a))的藥物釋放在72 h達到最大，最大釋放量達到250 μg，72 h后藥物釋放并較快速地減小，隨后藥物釋放趨于平緩。

圖3 3種載藥支架材料的藥物緩釋。(a)Ica-NH2共價組；(b)Ica-NH2-CSM組；(c)Ica-CSM組Fig.3 The drug release of the three drug loaded scaffolds. (a) Ica-NH2 Covalent binding group; (b) Ica-NH2-CSM group; (c) Ica-CSM group

2.4 大體觀察結(jié)果

圖4為兔橈骨骨缺損模型，植入支架材料(見圖5)。術(shù)后實驗兔20 min左右蘇醒，當日即有飲食，活動量減少，周內(nèi)傷口無感染潰膿及紅、腫、熱、痛等現(xiàn)象，固定紗布自行脫落，術(shù)后兩周活動量恢復(fù)，走動未見瘸跛。

圖4 兔橈骨缺損模型Fig.4 The model of radius segmental defect of rabbits

圖5 支架材料植入兔橈骨缺損處Fig. 5 Scaffold materials implanted in the defect of rabbits radius segmental

圖6為1、3、6個月時取材作為標本觀察支架材料的大體狀況，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1個月周圍組織將支架材料完全包裹，支架材料棱角明顯；術(shù)后3個月支架材料與骨缺損截骨斷端相連；術(shù)后6個月支架材料被新生組織嚴密包裹，支架材料棱角消失，仔細觀察可見支架材料與骨缺損截骨斷端界線模糊，支架材料與截骨斷端有較好的結(jié)合。

圖6 不同時間段骨修復(fù)取材觀察。(a)1個月；(b)3個月；(c)6個月Fig. 6 Observation of bone repair for different times. (a) 1 month; (b) 3 months; (c) 6 months

2.5 兔橈骨缺損修復(fù)的影像學(xué)觀察

2.5.1 X射線觀察

圖7為兔左前腿X片。術(shù)后1個月：4組骨缺損修復(fù)處，Ica-NH2共價組在整個缺損區(qū)有不均勻影像顯示，密度低于正常骨密度，其他3組斷端處有模糊影像，密度較低。術(shù)后3個月：空白對照組缺損處有不規(guī)則影像顯示，密度較小且不均勻；Ica-NH2共價組缺損處顯示有較大面積均勻影像；Ica-NH2-CSM組在靠近尺骨的部位有部分影像；Ica-CSM組左截骨端處有模糊影像，密度較低。術(shù)后6個月：空白對照組缺損段中段不規(guī)則影像貫通缺損段，左邊部分有明顯缺口且整體影像密度不均勻；而Ica-NH2共價組缺損處可見均勻影像充滿缺損處，該處影像顯示仍呈凹陷狀，凹陷處邊緣影像顯示密度較高；Ica-NH2-CSM組和Ica-CSM組與3個月比較，影像密度差異不明顯。

圖7 4組支架材料分別在1(左)、3(中)和6(右)個月時骨修復(fù)效果X射線影像學(xué)觀察。(a)對照；(b)Ica-CSM；(c)Ica-NH2-CSM；(d)Ica-NH2Fig. 7 X - ray observation of bone repair effect for four groups of scaffold material at different periods (From left to right: 1,3,6 months). (a) Control; (b) Ica-CSM; (c) Ica-NH2-CSM; (d)Ica-NH2

2.5.2 三維CT重建圖片結(jié)果觀察

圖8為兔左前腿三維CT重建圖像。術(shù)后1個月：空白對照組顯示材料周圍有新骨形成，骨橋未連接；Ica-NH2共價組靠近尺骨側(cè)缺損處有骨橋建立，缺損處左右兩斷端均有突起的新生骨形成；Ica-NH2-CSM組與其他兩組一樣，斷端比較圓潤，新骨生成不明顯；Ica-CSM組修復(fù)情況與Ica-NH2-CSM組比較，效果相同。術(shù)后3個月：空白材料組缺損處缺口變小，新生骨逐漸將材料接近尺骨一側(cè)包裹；Ica-NH2共價組斷端突起顯著，并同時向中間伸長，材料靠近尺骨一側(cè)逐漸被新生骨組織包裹；Ica-NH2-CSM組和Ica-CSM組缺損修復(fù)不甚明顯，有一定的新生骨形成，但新骨形成較少。術(shù)后6個月：空白對照組缺損兩端部分已連接，支架材料被新生骨包裹；Ica-NH2共價組缺損兩斷端部分連接，兩端突起部分連續(xù)向中間伸長，修復(fù)效果與3個月比較有明顯增強；Ica-NH2-CSM組和Ica-CSM組骨缺損修復(fù)效果較3個月時有所改善，與Ica-NH2共價組比效果較差。

2.6 兔橈骨修復(fù)的組織學(xué)觀察

2.6.1 HE染色觀察

圖9為HE染色結(jié)果顯示，材料與組織邊界沒有炎癥瘢痕組織，說明支架材料與組織無明顯排斥反應(yīng)。

術(shù)后1個月:4種支架材料周圍均有大量新生細胞，空白對照組支架材料周邊有新生骨小梁形成，界面有纖維組織；Ica-NH2共價組支架材料周邊有大量新生骨組織；Ica-NH2-CSM組支架材料周邊有島狀類骨質(zhì)形成，新生骨量較少，成骨化水平低于Ica-NH2共價組；Ica-CSM組支架材料與新生組織緊密結(jié)合，支架材料周圍新生組織顯示為骨組織。術(shù)后3個月:空白對照組周圍仍有大量纖維組織，支架材料外層新生骨量較少；Ica-NH2共價組纖維組織減少，新生骨量較多，材料顯示部分降解，新生骨呈板層狀骨樣結(jié)構(gòu)，組織跟材料骨性結(jié)合；Ica-NH2-CSM組新生骨呈板層狀骨樣結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)松散；Ica-CSM組仍存在島狀類骨質(zhì)，且結(jié)構(gòu)松散。術(shù)后6個月:空白對照組材料界面以纖維組織為主，且新生骨呈現(xiàn)島狀類骨質(zhì)；Ica-NH2共價組纖維層基本消失，新生骨呈板層狀骨樣結(jié)構(gòu)；Ica-NH2-CSM組纖維層消失，新生骨呈板層狀骨樣結(jié)構(gòu)；Ica-CSM組組織與支架材料界面仍有纖維組織。

圖8 4組支架材料在不同時段骨修復(fù)效果的三維CT影像學(xué)觀察(從左至右分別為1、3、6月)。(a)對照；(b)Ica-CSM；(c)Ica-NH2-CSM；(d)Ica-NH2Fig.8 Three-Dimensional CT observation of bone repair effect for four groups of scaffold material at different periods (From left to right: 1,3,6 months). (a)Control; (b)Ica-CSM; (c)Ica-NH2-CSM; (d)Ica-NH2

圖9 不同時間點的HE染色觀察(100×)(從左至右分別為1、3、6個月；藍色箭頭指向材料，黑色箭頭指向新生骨組織)。(a)對照；(b)Ica-CSM；(c)Ica-NH2-CSM；(d)Ica-NH2Fig. 9 HE stained sections of four groups at different periods(100×) (From left to right: 1,3,6 months; The blue arrow points to the material, the black arrow points to the new bone tissue).(a)Control; (b)Ica-CSM; (c)Ica-NH2-CSM; (d)Ica-NH2

圖10 各組分別在1(左)、3(中)和6(右)個月Masson染色觀察(100×)(藍色箭頭指向材料，紅色箭頭指向新生骨組織，黃色箭頭指向纖維組織)。(a)對照；(b)Ica-CSM；(c)Ica-NH2-CSM；(d)Ica-NH2Fig.10 Masson stained sections of four groups at 1(left),3(middle) and 6(right) months (100x) (the blue arrow points to the material, the red arrow points to the new bone tissue, the yellow arrow points to fibrous tissue). (a)Control; (b)Ica-CSM; (c)Ica-NH2-CSM; (d)Ica-NH2

HE染色結(jié)果表明，Ica-NH2共價組能有效誘導(dǎo)骨形成，有利于支架材料與組織的骨性融合。

2.6.2 Masson染色觀察

圖10為Masson染色結(jié)果。術(shù)后1個月：空白對照組支架材料和新生骨之間被纖維組織隔開，出現(xiàn)新生骨小梁結(jié)構(gòu)；Ica-NH2共價組材料周圍纖維組織較少，新生骨量較多；Ica-NH2-CSM組，Ica-CSM組支架材料與新生骨組織界面有大量纖維組織，新生骨量較少。術(shù)后3個月：空白對照組新生骨面積增大；Ica-NH2共價組新生骨數(shù)量增加且面積增大；Ica-NH2-CSM組以大量纖維組織為主，新生骨面積與1個月比較增大了；Ica-CSM組主要以纖維組織為主。術(shù)后6個月：空白對照組材料與組織界面仍以大量纖維組織為主；Ica-NH2共價組新生骨組織與支架材料緊密結(jié)合，纖維組織消失，以新生骨為主；Ica-NH2-CSM組新生骨組織數(shù)量明顯增多，但其周圍仍以纖維組織為主，新生骨與支架材料未能有良好的骨性結(jié)合。Ica-CSM組新生骨組織與材料界面仍被纖維組織隔開，且纖維組織較多。

以上結(jié)果提示，Ica-NH2共價組具有良好的骨修復(fù)效果。

3 討論

PHBV 是一種具有良好的生物可降解性和組織相容性的材料[12]。Miao等發(fā)現(xiàn)，共混的方法能夠降低PHBV的結(jié)晶速率，增加PHBV的韌性[13]。將成骨細胞接種到PHBV支架在體外培養(yǎng)，細胞在支架上增殖良好并能分泌堿性磷酸酶和骨鈣素[14]。

殼聚糖有一定的抑菌作用，可塑性強，但力學(xué)強度不夠，常用于支架材料作為細胞生長因子的載體[15]，殼聚糖在液態(tài)介質(zhì)中可與帶負電荷的聚合物、大分子甚至一些聚陰離子如透明質(zhì)酸、明膠等相互作用，形成穩(wěn)定的聚電解質(zhì)復(fù)合物，促進細胞有絲分裂，誘導(dǎo)合成生長因子并延長其半衰期[16-17]。

PHBV與殼聚糖共混制備復(fù)合支架材料，既能增加材料的強度與韌性又能克服PHBV的脆性和疏水性，還有利于細胞，附和增殖，可作為一種良好的骨組織工程支架材料。

兩相混合急速冷凍/冷凍干燥成型形成網(wǎng)絡(luò)狀串珠狀的微結(jié)構(gòu)有利于細胞的黏附與增殖[18-19]。本研究所制備復(fù)合支架材料均勻分布著3～10 μm的微孔及串珠，能夠有效促進細胞的黏附與增殖。

誘導(dǎo)因子是骨組織工程研究非常重要的一個因素，組織工程中誘導(dǎo)因子持續(xù)的作用能夠顯著增強其組織誘導(dǎo)作用，微球控釋誘導(dǎo)因子是一種使誘導(dǎo)因子能夠持續(xù)釋放的控釋方式[20]。將誘導(dǎo)因子與可降解三維支架材料以某種方式結(jié)合，也是一種有效的誘導(dǎo)因子控釋方式?？梢酝ㄟ^誘導(dǎo)因子與支架材料間的作用實現(xiàn)，比如包埋、靜電吸附、氫鍵結(jié)合及表位親和等[21-22]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，具有促進成骨細胞成骨、加速成骨細胞堿性磷酸酶分泌、促進骨骼鈣化和骨形成等作用[23-24]。本研究以微球包載誘導(dǎo)因子Ica以及Ica-NH2與支架材料共價結(jié)合等方式作為組織工程支架材料的誘導(dǎo)因子控釋方式，通過比較支架材料對兔橈骨缺損的修復(fù)效果來得出較佳的誘導(dǎo)因子添加方式。

4 結(jié)論

通過3種載藥支架的藥物緩釋實驗結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)Ica-NH2共價組支架材料藥物突釋時間最短，藥物釋放量比其他兩組高，且其藥物釋放最先進入穩(wěn)定期，而且最接近淫羊藿苷的最佳作用濃度，這樣的藥物緩釋最有利于其發(fā)揮誘導(dǎo)作用。

大體觀察可見1、3、6個月時支架材料被新生組織包裹，支架材料棱角隨時間變模糊，與組織結(jié)合越來越緊密；支架材料較致密，生物降解性較差，未能與骨組織發(fā)生骨性結(jié)合。

X片結(jié)果結(jié)合CT結(jié)果顯示，Ica-NH2共價組新骨形成量高于其他3組，可能是由于支架材料對斷端骨組織的促進增殖及誘導(dǎo)作用，使得新生骨組織沿著材料生長，故三維CT重建圖上顯示有新骨突起的形成，而X片上顯示有密度小于正常骨的新生骨填充兔橈骨缺損處。Ica-NH2共價組支架材料，藥物以共價的方式與支架結(jié)合，這種藥物結(jié)合的方式使得有部分藥物裸露在支架材料表面，支架材料植入骨缺損處藥物與組織即發(fā)生接觸，從而對組織產(chǎn)生促進增殖及誘導(dǎo)的作用，且藥物濃度能夠長時間維持在一個穩(wěn)定的水平，故其誘導(dǎo)能力表現(xiàn)優(yōu)于其他組。HE和Masson染色結(jié)果同樣顯示支架材料周圍有大量新骨形成，且Ica-NH2共價組支架材料成骨效果最佳。

綜上所述，本研究證實Ica-NH2共價組支架材料是一種具有良好骨誘導(dǎo)性的支架材料，利用藥物與支架材料共價鍵結(jié)合實現(xiàn)藥物控釋，是一種良好有效的優(yōu)于微球包載藥物的藥物釋控方式。

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An Inducible Bone Repair Composite Material PHBV/CS: The Renovation of Rabbit Radius

Li Gen Zhen Ping Cheng Manping Zhao Hongbin*

(LanzhouGeneralHospitalofLanzhouCommand,Lanzhou730050,China)

In this work, four kinds of chitosan/poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate(PHBV)composite scaffold were fabricated by the method of two phase mixture freeze drying.The repair effects of the scaffoldswere investigated and compared to determine the optimal formula for guiding bone regeneration as well as drug releasing. The icariin (Ica) was used in this study as an osteoinductive factor, and Ica microspheres were fabricated by W/O method and covalent binding. Microstructures of the scaffolds and drug releasing behaviors were investigated.After that,the scaffolds were implanted in the radius defects of rabbits;X-ray and 3D CT were applied to observe the repair effect at 1, 3, and 6 months post surgery. The osteogenesis inducible effects were evaluated using HE and Masson staining. The scaffolds showed network-like microstructures with particles inside, the drug loaded particles was 3-11 μm in diameter. The scaffolds released Ica well, though the peak of drug release curve for the covalent binding group was delayed than the others. The peak appeared at 72 h after immersion and quickly reached a stabled level of 75 μg. The images of X-ray and 3-D CT showed the defect of the rabbit radius had connected and the bone mineral density was higher than the other three groups. HE and Masson stained sections of the radius segmental defect of rabbits implanted for 1, 3, and 6 months showed that the scaffold with covalently binding Ica had better repair effect than the others.

poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate (PHBV); inducible; covalent binding; bone repair

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 06.012

2015-12-03， 錄用日期:2016-08-30

甘肅省科技重大專項(1203FKDA036)

R318.08

A

0258-8021(2016) 06-0719-10

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: zhao761032@163.com