基于黏蛋白1的非小細胞肺癌基因疫苗的構建及免疫原性評價

岳紅紅 趙 亮 姜 威

(武警總醫(yī)院1 過敏反應科，2 醫(yī)務部，北京市 100039，E-mail：cctv201166@126.com)

論著·基礎研究

基于黏蛋白1的非小細胞肺癌基因疫苗的構建及免疫原性評價

岳紅紅1趙 亮2姜 威2

(武警總醫(yī)院1 過敏反應科，2 醫(yī)務部，北京市 100039，E-mail：cctv201166@126.com)

目的 構建基于黏蛋白1(MUC1)的非小細胞肺癌基因疫苗，并對其免疫原性進行評價。方法 利用弗林蛋白酶(furin)/2A序列將MUC1基因與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因進行連接，克隆入真核表達載體pVAX1，構建基因疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF。對基因疫苗進行鑒定后將該疫苗體外轉染COS7細胞，利用流式細胞術和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分別對MUC1、GM-CSF的表達情況進行檢測。將32只Balb/c小鼠分為空白對照組、空質粒pVAX1組、pVAX1-MUC1組和pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組，每組8只。除空白對照組外，其余實驗組每只小鼠肌肉注射相應質粒100 μg，并進行電穿孔刺激，末次免疫后14 d采用ELISA和酶聯(lián)免疫斑點法分別檢測其誘導的體液免疫和細胞免疫反應。結果 成功克隆并構建了非小細胞肺癌基因疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF，流式細胞檢測結果顯示MUC1在COS7細胞中的陽性表達率為10%，ELISA檢測結果顯示pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組GM-CSF表達水平高于空載體pVAX1組(P<0.05)。將疫苗免疫接種小鼠模型后，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組誘導的MUC1抗體水平高于pVAX1-MUC1組(P<0.05)，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組的小鼠脾細胞分泌干擾素-γ的斑點數多于pVAX1-MUC1組(P<0.05)。結論 pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF能夠同時誘導較高的體液免疫和細胞免疫反應。

非小細胞肺癌；基因疫苗；黏蛋白1；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；體液免疫；細胞免疫

非小細胞肺癌約占肺癌的80%，惡性程度高，轉移早而廣泛，對化療、放療敏感，初治緩解率雖高，但極易發(fā)生繼發(fā)性耐藥，容易復發(fā)，其治療以全身化療為主?；熞詡鹘y(tǒng)化療藥物為主，包括依托泊苷、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿霉素、伊立替康、紫杉醇、多西他賽等。研發(fā)其新型有效的治療方法和手段是目前的當務之急。基因疫苗作為主動的免疫治療方式，由于其能夠誘導強烈的細胞免疫應答而成為腫瘤免疫治療研究的熱點之一[1-2]。

在免疫治療中，靶抗原的選擇對治療的特異性和有效性具有重要的作用。黏蛋白1(mucin 1，MUC1)是一種跨膜糖蛋白，通常表達于乳腺導管上皮細胞的頂端表面[3]。而乳腺、前列腺、肺、結腸上皮腺癌表達異常形態(tài)的MUC1[1-2]。因此，靶向腫瘤表達的MUC1抗原的主動免疫治療可能有很大的治療價值。此外，一種編碼人類黏蛋白1(human mucin 1，hMUC1)的DNA疫苗已經在高表達MUC1的上皮癌中進行嘗試，其證明能夠有效抑制表達MUC1腫瘤的生長[4]。本研究將MUC1基因與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)基因構建于同一個真核表達載體，并對其誘導的體液和細胞免疫反應進行初步評價。

1 材料和方法

1.1 基因疫苗的構建和鑒定 將MUC1[GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)序列號：X80761.1]的胞外段編碼區(qū)和GM-CSF(GenBank序列號：M11220.1)的編碼區(qū)基因之間以弗林蛋白酶(furin)/2A序列進行連接，構成融合基因MUC1-F2A-GM-CSF，融合基因的上、下游分別引入酶切位點HindⅢ和 XboⅠ。融合基因在Invitrogen公司進行全基因合成，然后將其克隆至基因疫苗常用真核表達載體pVAX1，獲得基因疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF。利用限制性內切酶的酶切和基因測序對基因疫苗進行鑒定，主要步驟：利用NEB公司的內切酶HindⅢ(R0104V)和 XboⅠ(R0146V)，對獲得的基因疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF進行酶切，能夠切下與目的基因MUC1-F2A-GM-CSF大小一致的條帶，即為構建成功。

1.2 基因疫苗的真核表達 為了驗證pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF的真核表達情況，利用脂質體2000轉染試劑(Invitrogen公司，貨號：11668019)將其轉染至COS7細胞(購于中科院上海細胞庫)，以空載體pVAX1作為陰性對照，檢測GM-CSF表達時同時設立pVAX1-MUC1組，分別收集細胞培養(yǎng)上清液和六孔板中的細胞進行檢測，操作嚴格按照說明書步驟進行。轉染簡要步驟如下：轉染前1 d，將對數生長期的COS 7細胞接種于6孔培養(yǎng)板，轉染時細胞匯合度應達到80%左右；利用無血清培養(yǎng)基分別配置轉染A液和B液，A液含有10 μl的轉染試劑，B液含有4 μg的轉染級質粒，A和B液在室溫下放置5 min后，將A液加入到B液中，此為C液，輕柔混勻，室溫放置20 min。將C液小心加入含有2 ml培養(yǎng)基和80%匯合度細胞的6孔培養(yǎng)板中，輕柔混勻，置于細胞培養(yǎng)箱孵育5 h。孵育結束后，用新鮮培養(yǎng)基洗滌6孔板中的細胞，最后加入2 ml新鮮的完全培養(yǎng)基。轉染48 h后，進行檢測。

由于MUC1是細胞膜表達，將收集的轉染細胞洗滌后，分別采用鼠源抗人MUC1抗體(Abcam公司，貨號：ab28081)和藻紅蛋白標記的山羊抗小鼠IgG(Abcam公司，貨號：ab97024)為一抗和二抗，并分別孵育30 min后，上流式細胞儀(BD公司，型號：BD AccuriTMC6)檢測MUC1的陽性表達率(紅色熒光表示)。GM-CSF是分泌表達，所以將轉染細胞培養(yǎng)上清液包被于96孔微板中，采用鼠源的抗人GM-CSF單克隆抗體(Abcam公司，貨號：ab54429)作為一抗，二抗為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術公司，貨號：ZDR-5307)，顯色并終止反應后，酶標儀(美國伯樂公司，型號：Bio-Rad iMark)檢測波長在450 nm處的吸光度(A)值，樣品孔數值大于等于陰性孔數值2倍以上為陽性。

1.3 實驗動物分組和免疫接種 雌性Balb/c小鼠32只，購于北京維通利華實驗動物技術公司，4～6周齡，體重20～25 g，實驗動物的喂養(yǎng)按照實驗動物的護理和使用指南[5]。采用配對比較法隨機分組法將小鼠分為空白對照組、空質粒pVAX1組，pVAX1-MUC1組和pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組，每組8只。除空白對照組外，其余實驗組每只小鼠肌肉注射相應質粒100 μg，并進行電穿孔刺激[6]，分別在一免后的第7天和第14天加強免疫，并進行電穿孔刺激。末次免疫后的第14天，處死小鼠后內進行免疫原性檢測。

1.4 抗體滴度檢測和酶聯(lián)免疫斑點法檢測

1.4.1 抗體滴度檢測：末次免疫后14 d，小鼠眼眶取血約100 μl左右，室溫下自然沉淀2～3 h，然后1 500 r/min離心5 min，分離血清，檢測小鼠血清中的抗體滴度。將10 μg重組MUC1抗原(Abcam公司，貨號：ab80082)包被于96孔微板中，然后加入系列稀釋的各實驗組小鼠血清，孵育洗滌后，加入HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體，孵育洗滌后，3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺溶液顯色，反應終止后，使用酶標儀在450 nm波長處讀取數值。實驗組A450的數值≥陰性對照2倍為陽性。

1.4.2 酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme-linked immunospot assay，ELISpot)：末次免疫后14 d，無菌分離各個實驗組小鼠脾細胞，利用預先以抗干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)抗體包被的聚偏氟乙烯板，將分離的各組小鼠脾細胞分別加入到相應的包被孔中。其中，加入MUC1蛋白作為刺激物的板孔為ELISpot檢測的實驗組孔，不加刺激抗原的板孔稱為陰性對照孔；同時，還要設立陽性對照孔，即加入佛波酯的板孔。詳細操作過程參照ELISpot試劑盒(達科為生物技術有限公司，貨號：DKW22-2000-500)說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計學分析，計量資料以(x±s)表示，比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基因疫苗的構建和抗原表達檢測 基因疫苗構建進行測序鑒定正確；將其轉染COS7細胞，孵育后流式細胞術檢測結果顯示，可以檢測到MUC1在COS7細胞中的表達，陽性表達率為10%，見圖1。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測結果顯示，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組GM-CSF水平明顯高于空載體pVAX1組(P=44.57，P<0.001)，見表1。

圖1 流式細胞術檢測重組質粒中MUC1蛋白的表達

組別nA值pVAX1組30.02±0.03pVAX1-MUC1組31.07±0.21*pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組30.97±0.15*

注：與pVAX1組比較，*P<0.05。

2.2 ELISA檢測疫苗誘導的體液免疫應答 單獨抗原pVAX1-MUC1組和融合抗原pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組都能產生一定強度MUC1的抗體反應，見圖2；但pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組誘導的MUC1抗體水平高于單獨抗原pVAX1-MUC1組(F=67.12，P<0.001)，見表2。

圖2 各實驗組抗體滴度比較

組別n抗MUC1抗體滴度水平pVAX1組424.4±16.7pVAX1-MUC1組42140.0±207.4*pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組43460.0±792.5*#

注：與pVAX1組比較，*P<0.05；與pVAX1-MUC1組比較，#P<0.05。

2.3 ELISPOT法檢測疫苗誘導的細胞免疫應答 與對照組相比，無論是單獨抗原pVAX1-MUC1組還是融合抗原pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組免疫小鼠后的脾臟淋巴細胞，經特異性抗原MUC1刺激后，均能產生IFN-γ分泌的斑點，見圖3。融合抗原疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組的小鼠脾細胞分泌IFN-γ的斑點數多于單獨抗原pVAX1-MUC1組(F=85.13，P<0.001)，見表3。

圖3 具有代表性的各實驗組ELISpot檢測斑點圖

組別n斑點數pVAX1組85.00±4.6pVAX1-MUC1組8152.0±45.0*pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組8232.0±41.0*#

注：與pVAX1組比較，*P<0.05；與pVAX1-MUC1組比較，#P<0.05。

3 討 論

當前的免疫治療方法包括被動免疫和主動免疫兩大類：被動免疫常用方式就是單克隆抗體或者一些具有免疫活性的細胞因子等；而主動免疫就是疫苗類的制劑，諸如蛋白疫苗、樹突狀細胞疫苗以及基因疫苗等。雖然抗體免疫反應和細胞免疫反應對于腫瘤的治療都具有相應的作用，但是輔助性T細胞1(helper T cell 1，Th1)類細胞免疫反應，特別是細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反應以及由此產生的一系列相關的細胞因子，如IFN-γ、腫瘤壞死因子-α及白細胞介素-2(interleukin，IL-2)[7]，可能是最終抑制和消除腫瘤的關鍵因素。因此理想的抗腫瘤疫苗必須既有能力誘導體液免疫反應，又有能力誘導細胞免疫反應，特別是Th1和CTL反應。

在眾多不同類型的疫苗中，基因疫苗由于能夠以模擬病毒感染的自然過程的方式進行抗原遞呈，也就是主要組織相容性復合體-Ⅰ類分子遞呈途徑，因此其能夠誘導高效的細胞免疫反應，特別是Th1類免疫應答和 CTL反應[8]。另外由于基因疫苗制備簡便，易于運輸與儲存，成本低廉等優(yōu)勢，成為近年來腫瘤免疫和感染免疫方面研究的熱點[9]。多年來，由于基因疫苗的免疫原性較低，其研究和發(fā)展受到了一定的限制，曾經一度出現停滯不前的現象。但是，自從在體電脈沖轉染這種高效的基因疫苗遞送方式用于基因疫苗的免疫接種后，其發(fā)展非常迅速[3]。當然，提高基因疫苗效果的方法很多，將具有免疫刺激和調節(jié)功能的細胞因子以分子內佐劑的方式與腫瘤抗原融合是研究熱點之一。當前研究最為成熟的免疫刺激分子之一是GM-CSF。它能夠刺激多種免疫細胞，例如DC細胞、巨噬細胞等發(fā)育和活化；它和IL-12及IL-2一樣，都是具有非常重要免疫調節(jié)作用的細胞因子；GM-CSF目前已經發(fā)展成為蛋白藥物，臨床上用于腫瘤的輔助治療[10-11]。具有重要的免疫調節(jié)功能。此外，很多學者將其以輔助分子或者分子內佐劑的方式加以應用，這些都體現了其良好的抗腫瘤或者提高抑瘤效果的能力[12-13]。

近年來，肺癌的發(fā)病率在逐年提高，非小細胞肺癌更是難防難治，但其免疫治療手段卻取得了一些重要的突破性進展。MUC1是當前肺癌靶向治療中研究較多的一個靶抗原，以MUC1為靶點的肺癌疫苗已經進行到Ⅲ期臨床試驗，且取得了較為理想的效果，因此，MUC1被看做是肺癌免疫治療的潛在理想靶抗原之一[14-15]。

本研究將具有重要免疫調節(jié)功能的分子GM-CSF與非小細胞肺癌高表達抗原MUC1進行融合，經抗原表達檢測，可以檢測到MUC1在COS7細胞中的表達，且GM-CSF表達水平檢測結果顯示，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組A值明顯高于空載體pVAX1組(P<0.05)，提示GM-CSF在COS7細胞內能夠有效分泌表達，成功構建了肺癌基因疫苗。將疫苗免疫接種小鼠模型后，ELISA檢測結果顯示，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組誘導的抗體水平高于單獨抗原pVAX1-MUC1組(P<0.05)，提示將MUC1抗原與GM-CSF融合表達，能夠顯著提高MUC1誘導的特異性抗體的產生，增強了體液免疫反應；此外，融合抗原疫苗pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF組的小鼠脾細胞分泌IFN-γ的斑點數多于單獨抗原pVAX1-MUC1組(P<0.05)，提示與單獨抗原pVAX1-MUC1組相比，pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF能夠誘導產生較強細胞免疫反應，說明GM-CSF作為分子內佐劑，能夠顯著提高抗原誘導特異性免疫應答的能力。在后續(xù)實驗中，我們將深入研究該疫苗抑制腫瘤的效果，同時將利用其他肺癌靶抗原和成熟的佐劑分子，進一步提高優(yōu)化和改善疫苗的效果，以期獲得一個良好的非小細胞肺癌基因疫苗候選品種。

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Construction and immunogenicity evaluation of non-small cell lung cancer gene vaccine based on mucin 1

YUEHong-hong1,ZHAOLiang2,JIANGWei2

(1DepartmentofAllergicReaction,2DepartmentofMedicalAffairs,GeneralHospitalofArmedPoliceForces,Beijing100039,China)

Objective To construct the non-small cell lung cancer gene vaccine based on mucin 1(MUC1),and to evaluate its immunogenicity.Methods MUC1 gene was fused with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) by furin/2A sequence,and the fused gene was cloned into pVAX1 to construct the gene vaccine pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF.The gene vaccine was transfected into COS7 cells after identification,and then the expressions of MUC1 and GM-CS were detected by flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) respectively.Thirty-two Balb/c mice were divided into blank control group,pVAX1 group,pVAX1-MUC1 group and pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF group,with 8 mice in each group.Except the blank control group,the corresponding plasmids(100 μg) were injected into the mice of the experimental groups and electroporation stimulation was also performed in each mice.After 14 days of last immunization,the induced humoral immune and cellular immune responses were detected by ELISA and enzyme-linked immunospot assay respectively.Results Non-small cell lung cancer gene vaccine pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF was successfully cloned and constructed.The result of flow cytometry detection showed that MUC1 expressed in COS7 cell and the positive expression rate was 10%.And the result of ELISA showed that the GM-CSF expression level of pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF group was higher than that of pVAX1 group(P<0.05).After the mice models injected with the vaccine,the expression of MUC1 antigen induced by pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF group was higher than that induced by pVAX1-MUC1 group(P<0.05),and the spots of interferon-γ secreted by mice splenocytes in the pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF group was more than that in the pVAX1-MUC1 group(P<0.05).Conclusion The pVAX1-MUC1-F2A-GM-CSF can induce either high humoral immune response or cellular immune response. 【Key words】 Non-small cell lung cancer,Gene vaccine,Mucin 1,Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,Humoral immunity,Cellular immunity

岳紅紅(1975～)，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向：過敏反應學。

姜威(1972～)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸內科危重癥救治及肺癌的相關基礎研究，E-mail：wuweiwenzhang07@sohu.com。

R 392.11

A

0253-4304(2016)09-1197-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.03

2016-05-09

2016-06-29)