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    烏司他丁拮抗炎性因子致血管內(nèi)皮細胞凋亡的實驗研究▲

    2016-02-17 05:26:35黃衛(wèi)民陳相宜佘佐亞夏紅衛(wèi)趙艷瓊
    廣西醫(yī)學(xué) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:子癇內(nèi)皮細胞線粒體

    黃衛(wèi)民 陳相宜 蔡 捷 佘佐亞 譚 淇 夏紅衛(wèi) 趙艷瓊

    (1 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科,南寧市 530003,E-mail:878206776@qq.com;廣西醫(yī)科大學(xué)2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,3 醫(yī)學(xué)實驗中心,4 護理學(xué)院,5 公共衛(wèi)生學(xué)院,南寧市 530021)

    論著·基礎(chǔ)研究

    烏司他丁拮抗炎性因子致血管內(nèi)皮細胞凋亡的實驗研究▲

    黃衛(wèi)民1陳相宜2蔡 捷3佘佐亞4譚 淇3夏紅衛(wèi)1趙艷瓊5

    (1 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科,南寧市 530003,E-mail:878206776@qq.com;廣西醫(yī)科大學(xué)2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,3 醫(yī)學(xué)實驗中心,4 護理學(xué)院,5 公共衛(wèi)生學(xué)院,南寧市 530021)

    目的 探討烏司他丁(UTI)拮抗重度子癇前期血清及其腫瘤壞死因子-α(TNF-α)對血管內(nèi)皮細胞損傷的效應(yīng)及機制,為UTI治療重度子癇前期提供依據(jù)。方法 重度子癇前期孕婦10例,均留取血清冷藏備用。人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)后分組:(1)空白對照組:不給予干預(yù);(2)5%、10%、15%、20%血清組:血管內(nèi)皮細胞中分別加入5%、10%、15%、20%重度子癇前期患者血清;(3)100 U/ml、200 U/ml TNF-α組:在血管內(nèi)皮細胞中分別加入100 U/ml、200 U/ml TNF-α;(4)UTI聯(lián)合血清組(UTI+血清組):在20%血清組中分別加入50 U/ml、100 U/ml、500 U/ml、1 000 U/mlUTI;(5)UTI聯(lián)合TNF-α組(UTI+TNF-α組):在200 U/ml TNF-α組中分別加入50 U/ml、100 U/ml、500 U/ml和1 000 U/ml UTI。每組設(shè)6個復(fù)孔,分別干預(yù)12、24 h。采用噻唑藍比色法檢測血管內(nèi)皮細胞增殖活性;采用流式細胞術(shù)檢測血管內(nèi)皮細胞凋亡及線粒體跨膜電位的變化。結(jié)果 (1)血管內(nèi)皮細胞增殖活性:干預(yù)12 h、24 h時,15%、20%血清組OD值均低于空白組(P<0.05);干預(yù)24 h時,100 U/ml TNF-α組、200 U/ml TNF-α組的OD值均低于空白組(P<0.05)。(2)血管內(nèi)皮細胞凋亡:干預(yù)12 h、24 h時,20%血清組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率均高于空白組(P<0.05);干預(yù)24 h時,500 U/ml、1 000 U/ml UTI組細胞早期凋亡率、晚期凋亡率均低于20%血清組(P<0.05)。50 U/ml、100 U/ml UTI聯(lián)合TNF-α組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率與200 U/ml TNF-α組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI聯(lián)合TNF-α組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率低于200 U/ml TNF-α組(P<0.05)。(3)血管內(nèi)皮細胞線粒體跨膜電位:50 U/ml、100 U/ml UTI干預(yù)組的細胞凋亡率與20%血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI組的細胞凋亡率低于20%血清組(P<0.05);50 U/ml、100 U/ml UTI聯(lián)合TNF-α組的細胞凋亡率與200 U/ml TNF-α組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI聯(lián)合TNF-α組的細胞凋亡率低于200 U/ml TNF-α組(P<0.05)。結(jié)論 烏司他丁可降低TNF-α和重度子癇前期患者血清導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞凋亡率,可能與其維持線粒體的跨膜電位平衡有關(guān),提示UTI可作為拮抗妊娠期高血壓疾病炎性反應(yīng)的候選藥物。

    重度子癇前期;烏司他?。荒[瘤壞死因子-α;血管內(nèi)皮細胞;凋亡

    子癇前期的發(fā)病中心環(huán)節(jié)之一是廣泛血管內(nèi)皮損傷,其機制是子癇前期的過度炎癥激活,主要由胎盤釋放一系列炎性細胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素等[1-2]。由于妊娠期的特殊性,目前對于子癇前期臨床尚不能應(yīng)用抗炎藥物治療。有學(xué)者報告[3]應(yīng)用烏司他丁(Ulinastatin,UTI)可預(yù)防白細胞介素-8等炎癥因子引發(fā)的宮內(nèi)炎癥,以延長孕周、預(yù)防早產(chǎn),提示UTI有抗炎作用。鑒于臨床尚未將UTI用于治療子癇前期引發(fā)的炎癥反應(yīng),本研究在建立體外重度子癇前期血清和TNF-α損傷血管內(nèi)皮細胞模型的基礎(chǔ)上,觀察UTI的體外抗炎效果,探討其保護血管內(nèi)皮細胞的機制,為UTI應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 選擇廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院收治的重度子癇前期孕婦10例,年齡(27.5±3.1)歲,孕周(36.1±2.6)周。重度子癇前期的診斷標準符合《婦產(chǎn)科學(xué)》標準[4]。入選孕婦均無感染、原發(fā)性高血壓、心臟病、糖尿病、肝腎疾病及胎膜早破病史。

    1.2 主要試劑與設(shè)備 人臍靜脈內(nèi)皮細胞由武漢細胞中心提供;胎牛血清(美國Hyclone公司),DMEM培養(yǎng)基、6孔細胞培養(yǎng)板(美國Gibco公司),流式細胞儀(美國Backman Coulter公司),Annexin V/PI染色試劑盒(美國Roche公司),線粒體膜電位檢測試劑盒(聯(lián)科生物)。

    1.3 方法 重度子癇前期患者血清采集:抽取重度子癇前期患者靜脈血置入干燥管,2 500 r/min離心10 min,收集血清。誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡的細胞模型與實驗分組:(1)血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng):人臍靜脈內(nèi)皮細胞復(fù)蘇后,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2和95%空氣飽和濕度,當細胞匯集接近滿瓶時,用0.25%胰蛋白酶消化,離心收集細胞,接種于6孔培養(yǎng)板。(2)分組:收集對數(shù)生長期的內(nèi)皮細胞進行分組:① 空白對照組:在細胞培養(yǎng)體系中不加任何干預(yù)因素;② 血清組:在細胞培養(yǎng)體系中加入重度子癇前期孕婦血清,干預(yù)終濃度分別為5%、10%、15%和20%;③ TNF-α組:在血管內(nèi)皮細胞中加入TNF-α干預(yù),終濃度分別為100 U/ml、200 U/ml;④ UTI聯(lián)合血清干預(yù)組(UTI+血清組):在20%血清干預(yù)組中加入UTI,UTI濃度分別為50 U/ml、100 U/ml、500 U/ml和1 000 U/ml;⑤ UTI聯(lián)合TNF-α干預(yù)組(UTI+TNF-α組):在200 U/ml TNF-α組中分別加入UTI,濃度分別為50 U/ml、100 U/ml、500 U/ml和1 000 U/ml。以上每組實驗設(shè)6個檢測復(fù)孔,干預(yù)時間均分別為12、24 h。1.4 血管內(nèi)皮細胞增殖活性檢測 采用噻唑藍(MTT)比色法檢測血管內(nèi)皮細胞增殖活性,經(jīng)細胞計數(shù),以每孔104個對數(shù)期生長的血管內(nèi)皮細胞加入96孔板,培養(yǎng)12 h后,按各類分組進行試驗干預(yù),在12、24 h時點,各組加入5 mg/ml濃度MTT溶液20 ml,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),孔板離心機離心1 000 r/min,5 min,棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,然后每孔加入150 μl二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,經(jīng)孔板離心機離心1 000 r/min,5 min,取上清應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測方法檢測各孔吸光值,測量波長為OD 490 nm。

    1.5 血管內(nèi)皮細胞凋亡率 采用磷脂結(jié)合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)染色法,應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測血管內(nèi)皮細胞凋亡,按試劑盒操作說明書進行。其中Annexin V+/PI-為早期凋亡細胞,Annexin V+/PI+為晚期凋亡細胞。

    1.6 細胞線粒體膜電位檢測 在血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)體系中,加入陽離子染料JC-1,采用流式細胞術(shù)檢測線粒體跨膜電位變化,其中紅色熒光細胞表示正常細胞,綠色熒光細胞表示凋亡細胞。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以(x±s)表示,根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果,采用方差分析或秩和檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 不同濃度血清和不同濃度TNF-α干預(yù)血管內(nèi)皮細胞增殖活性比較 12 h、24 h時,5%、10% 血清組血管內(nèi)皮細胞增殖活性(OD值)與空白組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而15%、20%血清組OD值均低于空白組(P<0.05);與空白組比較,12 h時點,100 U/ml TNF-α組的OD值稍降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),200 U/ml TNF-α組OD值低于空白組(P<0.05);在24 h時點,100 U/ml TNF-α組、200 U/ml TNF-α組的OD值均低于空白組(P<0.05)。見表1。

    表1 不同濃度血清和不同濃度TNF-α組

    注:與空白組比較,*P<0.05。

    2.2 各組血管內(nèi)皮細胞凋亡率比較 12 h、24 h時,20%血清組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率均高于空白組(P<0.05)。12 h、24 h時,50 U/ml、100 U/ml UTI聯(lián)合血清組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率與20%血清組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),除24 h時500 U/ml UTI+20%血清組較20%血清組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)外,12、24 h時,500 U/ml、1 000 U/ml UTI聯(lián)合血清組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率均低于20%血清組(P<0.05)。50 U/ml、100 U/ml UTI聯(lián)合TNF-α組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率與200 U/ml TNF-α組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI聯(lián)合TNF-α組的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率低于200 U/ml TNF-α組(P<0.05),見表2。

    2.3 各組血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位變化情況 采用流式細胞術(shù)檢測血管內(nèi)皮細胞線粒體跨膜電位變化,可反映為線粒體通路介導(dǎo)細胞凋亡率情況。12 h、24 h時點,50 U/ml、100 U/ml UTI干預(yù)組的細胞凋亡率與20%血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而500 U/ml、1 000 U/ml UTI干預(yù)組的細胞凋亡率低于20%血清組(P<0.05)。12 h、24 h時點,50 U/ml、100 U/ml UTI聯(lián)合TNF-α組的細胞凋亡率與200 U/ml TNF-α組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而500 U/ml與1 000 U/ml UTI組的細胞凋亡率低于200 U/ml TNF-α組(P<0.05),見表3。

    表2 各組不同時間的細胞早期凋亡率、晚期凋亡率比較(x±s,%)

    注:*與空白組對比,P<0.05,#與20%血清組對比,P<0.05,**與200 U/ml TNF-α組對比,P<0.05。

    表3 各組血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位比較(x±s,%)

    注:*與20%血清組比較,P<0.05,#與200 U/ml TNF-α組比較,P<0.05。

    3 討 論

    妊娠是一個特殊的生理過程,即使是在正常妊娠過程中,機體也會產(chǎn)生一些特殊物質(zhì)導(dǎo)致妊娠相關(guān)性變化,是妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生基礎(chǔ)。近年的研究認為,妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機制之一是機體免疫失衡,并且發(fā)現(xiàn)重度子癇前期患者血清炎性因子水平顯著高于正常孕婦[5]。本研究結(jié)果也表明重度子癇前期的患者血清可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡,和經(jīng)典的炎性因子TNF-α表現(xiàn)出類似的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng),提示妊娠期高血壓疾病發(fā)病機制與高水平的炎性因子有密切關(guān)系。本研究所選取的TNF-α是重要的炎性因子,在諸多炎性介質(zhì)損傷機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其被認為是妊娠期高血壓疾病血管內(nèi)皮損傷中起主要作用的炎性因子[6]。TNF-α主要來源于活化的巨噬細胞,但眾多組織和細胞均可以分泌TNF-α。有研究發(fā)現(xiàn)[5-6]妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中TNF-α水平顯著高于正常孕婦,而且白細胞TNF-α mRNA表達明顯增高,提示妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織和血清中TNF-α等炎性因子水平升高是其疾病發(fā)生的重要基礎(chǔ)。有學(xué)者[7]以TNF-α體外干預(yù)血管內(nèi)皮細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)的改變與妊娠期高血壓疾病患者臍帶血管內(nèi)皮細胞病變類似,如出現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞腫脹導(dǎo)致管腔狹窄,內(nèi)皮細胞間連接疏松,通透性增大,導(dǎo)致紅細胞外漏等不良后果,在亞細胞結(jié)構(gòu)方面則出現(xiàn)內(nèi)皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核膜破壞,在透射電鏡下可見TNF-α干預(yù)的臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體,提示損傷結(jié)局多為細胞凋亡。本研究在體外細胞學(xué)試驗中加入重度子癇前期患者血清干預(yù)后發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮細胞凋亡數(shù)增多,而且采用TNF-α體外干預(yù)血管內(nèi)皮細胞也有類似的促凋亡效應(yīng),并且進一步檢測凋亡相關(guān)的線粒體膜電位,發(fā)現(xiàn)重度子癇患者血清和TNF-α均可能通過改變線粒體通透性,使陽離子染料JC-1作用后的血管內(nèi)皮細胞發(fā)出綠色熒光,提示發(fā)生了細胞凋亡。綜上所述,重度子癇前期重要的發(fā)病機制與機體免疫亢進密切相關(guān),其中經(jīng)典的炎性因子TNF-α可能通過線粒體途徑介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡,表明含有高水平炎性介質(zhì)的重度子癇前期患者血清可以損傷血管內(nèi)皮細胞,表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細胞凋亡。

    鑒于重度子癇前期患者血清炎性因子水平較高,但皮質(zhì)醇激素等常規(guī)的抗感染治療不利于胎兒生長發(fā)育,目前亟須尋找一種適合該類患者的抗炎治療方法,以緩解或抑制過度炎癥引起的血管損傷,防止后續(xù)的繼發(fā)損害。本研究嘗試以TNF-α和重度子癇患者血清干預(yù),構(gòu)建體外血管內(nèi)皮細胞凋亡損傷模型,以模擬妊娠期高血壓疾病患者血管內(nèi)皮損傷效應(yīng),然后以UTI干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度UTI(>500 U/ml)可以顯著抑制TNF-α和重度子癇前期患者血清引起的血管內(nèi)皮細胞損傷效應(yīng),并且可抑制線粒體通透性增高誘導(dǎo)的細胞凋亡損傷。UTI是存在于正常人體尿液與血液中的天然物質(zhì),是一種Kunitz型蛋白酶抑制劑,可抑制體內(nèi)多種活性酶,包括炎癥損傷的相關(guān)酶,如粒細胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等。UTI常用于拮抗胰腺炎引起的酶性損傷,但近年研究發(fā)現(xiàn)該藥有較強的抗炎作用,應(yīng)用大劑量UTI治療膿毒血癥患者,可降低膿毒血癥器官損傷程度和死亡率,其機制是其抑制炎性因子釋放和炎性因子引發(fā)的后續(xù)損傷,阻斷炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)效應(yīng)[8-10],這表明UTI具有較強大的抗炎效應(yīng)。另外,UTI是機體天然存在的物質(zhì),非常符合妊娠期用藥原則與要求。有研究應(yīng)用UTI預(yù)防早產(chǎn)和治療不孕癥,其主要機制是抑制生殖系統(tǒng)感染而產(chǎn)生的炎癥因子,促進卵母細胞丘復(fù)合體的形成,而卵母細胞丘復(fù)合體則是卵母細胞成熟和排卵的基礎(chǔ)[3,11],這提示UTI用于重度子癇前期的可行性,進一步在符合相關(guān)規(guī)定的前提下開展多中心臨床研究,可為UTI用于治療重度子癇前期提供臨床研究數(shù)據(jù)。

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    Experimental study on the antagonism of ulinastatin against vascular endothelial cell apoptosis induced by inflammatory factors

    HUANGWei-min1,CHENXiang-yi2,CAIJie3,SHEZuo-ya4,TANQi3,XIAHong-wei1,ZHAOYan-qiong5

    (1DepartmentofObstetrics,theMaternalandChildHealthHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530003,China;2BasicMedicalCollege,3MedicalExperimentalCenter,4NursingCollege,5PublicHealthCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

    Objective To explore antagonism effect and mechanism of ulinastatin(UTI) against vascular endothelial cell injury induced by serum and tumor necrosis factor-α(TNF-α) of sever preeclampsia patients.Methods Serum of 10 patients with severe preeclampsia were collected and refrigerated for further use.Human umbilical vein endothelial cells were divided into:(1) blank control group,(2) 5%,10%,15%,and 20% serum group:different concentration of serum was added,respectively,(3) 100 U/ml and 200 U/ml TNF-α group:different concentration of TNF-α was added,respectively,(4) 20% serum with 50 U/ml,100 U/ml,500 U/ml,or 1 000 U/ml UTI(serum group+UTI) group:different concentration of ulinastatin was added into 20% serum,respectively,(5) 200 U/ml TNF-α with 50 U/ml,100 U/ml,500 U/ml,or 1 000 U/ml UTI(TNF-α+UTI group) group:different concentration of ulinastatin was added into 200 U/ml TNF-α Group,respectively.Each group was made 6 copies,and intervened for 12 or 24 hours.The injury of endothelial cells was assessed by MTT,and vascular endothelial cell apoptosis and mitochondrial membrane potential were tested by Annexin V/PI flow cytometry.Results (1) Proliferation activity of vascular endothelial cell:after 12 h and 24 h of intervene,optical density(OD) of 15% and 20% serum group were significantly lower,and 24 h after,OD of 100 U/ml and 200 U/ml TNF-α group were significantly lower compared to those of blank control group(P<0.05).(2)Apoptosis of vascular endothelial cell:at 12 h and 24 h point,the earlier and later apoptosis rates of 20% serum group were significantly higher than those of blank control group(P<0.05),and at 24 h point,were significantly lower in 500 U/ml and 1 000 U/ml UTI group than in blank control group(P<0.05).There was no significantly difference in these rates between 50 U/ml,100 U/ml UTI combined with 200 U/ml TNF-α group and 200 U/ml TNF-α group(P>0.05),however,the rates were significantly lower in 500 U/ml,1 000 U/ml UTI combined with 200 U/ml TNF-α group than in 200 U/ml TNF-α group(P<0.05).(3) The mitochondrial membrane potential of human umbilical veinen dothelial cell:there was no significantly difference between 50 U/ml,100 U/ml UTI group and 20% serum group(P>0.05),however,it was significantly lower in 500 U/ml,1 000 U/ml UTI group than in 20% serum group(P<0.05).There was no significantly difference between 50 U/ml,100 U/ml UTI combined with 200 U/ml TNF-α group and 200 U/ml TNF-α group(P>0.05),however,it was significantly lower in 500 U/ml,1 000 U/ml UTI combined with 200 U/ml TNF-α group than in 200 U/ml TNF-α group(P<0.05).Conclusion UTI can reduce apoptosis rate of vascular endothelial cell induced by serum and TNF-α of sever preeclampsia patients.The mechanism may be associated with its capacity of balancing the cell mitochondrial transmembrane potential,indicating UTI can be used as a drug candidate for antagonism of inflammation in gestational hypertension.

    Severe preeclampsia,Ulinastatin,tumor necrosis factor-α,Human umbilical veinen dothelial cells,Apoptosis

    廣西自然科學(xué)基金(桂科自0832147);廣西醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題 (Z2012204,Z2012042,Z2003031);廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點科研課題(重200713)

    黃衛(wèi)民(1968~),男,碩士,主任醫(yī)師,研究方向:圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)。

    趙艷瓊(1970~),女,碩士,副教授,副主任醫(yī)師,研究方向:婦幼保健與圍產(chǎn)醫(yī)學(xué),E-mail:739657195@qq.com。

    R 714.24+5

    A

    0253-4304(2016)12-1638-05

    10.11675/j.issn.0253-4304.2016.12.03

    2016-08-02

    2016-10-25)

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