壯藥了刁竹質(zhì)量控制方法的研究▲

陸崢琳 黃瑞松 黃 琴 梁曉東 葉積秀

(1 廣西民族醫(yī)藥研究院民族藥研究所，南寧市 530001，E-mail：499146468@qq.com；廣西醫(yī)科大學(xué)2 藥學(xué)院，3 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧市 530021；4 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530001)

論著·桂藥研究

壯藥了刁竹質(zhì)量控制方法的研究▲

陸崢琳1黃瑞松1黃 琴2梁曉東3葉積秀4

(1 廣西民族醫(yī)藥研究院民族藥研究所，南寧市 530001，E-mail：499146468@qq.com；廣西醫(yī)科大學(xué)2 藥學(xué)院，3 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧市 530021；4 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530001)

目的 建立壯藥了刁竹全草定性鑒別方法和含量測(cè)定方法，為了刁竹的質(zhì)量控制提供參考。方法 采用性狀、顯微、薄層層析(TLC)鑒別方法和高效液相色譜(HPLC)含量測(cè)定方法，對(duì)了刁竹進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，其中HPLC色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱，流動(dòng)相為甲醇-水(55 ∶45)，檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30℃。結(jié)果 在TLC鑒別中，兩種鑒別方法均可見特征斑點(diǎn)，具有專屬性，且特征性強(qiáng)、重復(fù)性好。應(yīng)用HPLC法，當(dāng)?shù)てし舆M(jìn)樣量為0.004328～0.2164 μg時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系：Y=5053.4X-1.7687，r=0.9998，平均加樣回收率為99.42%；10批藥材丹皮酚含量為0.15%～1.16%，平均為0.59%。結(jié)論 建立的了刁竹全草定性鑒定和定量測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)可有效控制該藥材的質(zhì)量。

壯藥；了刁竹；丹皮酚；質(zhì)量控制；薄層層析；高效液相色譜法

了刁竹別名寮刁竹、徐長(zhǎng)卿、逍遙竹、竹葉細(xì)辛、英雄草[1-3]，為廣西壯醫(yī)常用藥材，其原植物來源于蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿[4]。徐長(zhǎng)卿入藥用，中醫(yī)和壯醫(yī)入藥部位不同，中醫(yī)以根及根莖入藥，壯醫(yī)則多以全草入藥，稱為“了刁竹”，壯醫(yī)認(rèn)為其具有調(diào)龍路及火路、利谷道、祛濕毒、消腫痛的功效[5]。目前在廣西部分藥材流通市場(chǎng)中以根及根莖入藥和以全草入藥的該藥材均有銷售。歷版《中國(guó)藥典》收載的“徐長(zhǎng)卿”均以根及根莖入藥[6]，目前尚無了刁竹全草入藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致刁竹全草入藥處于無標(biāo)準(zhǔn)控制的狀態(tài)，影響了了刁竹全草臨床用藥的安全有效性。了刁竹主要含有丹皮酚[7-8]，丹皮酚為該藥材的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、抗菌、抗炎、降壓、抗心律失常、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[3]。為充分開發(fā)利用徐長(zhǎng)卿植物資源，控制了刁竹藥材質(zhì)量，確保該藥材臨床用藥的安全有效，本文對(duì)壯藥了刁竹全草藥材的性狀、顯微特征、薄層層析(thin-layer chromatography，TLC)鑒別、含量測(cè)定等項(xiàng)目進(jìn)行研究，建立壯藥了刁竹全草性狀、顯微、TLC鑒別方法和含量測(cè)定方法，為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了試驗(yàn)參考依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫公司，帶VWD檢測(cè)器)，LC-20AT高效液相色譜儀(島津公司，帶二極管陣列檢測(cè)器)，KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，C300防腐蝕隔膜真空泵(德國(guó)Chemvak公司)，XS205電子天平(瑞士梅特勒公司)，EASYpureⅡ超純水器(美國(guó)熱電公司)。

1.2 材料 了刁竹藥材共10批，均為全草，各批來源及收集時(shí)間見表1。其中3號(hào)樣品的對(duì)號(hào)蠟葉標(biāo)本經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)和廣西中醫(yī)藥研究院專家鑒定，確定為蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿；丹皮酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定院，批號(hào)：110708-200505)；硅膠G(青島海洋化工廠分廠，批號(hào) 20131118)；流動(dòng)相所用甲醇和乙腈均為色譜純(美國(guó)天地公司)、水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 了刁竹(全草)藥材來源情況

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 本品多扎成小捆，根不規(guī)則柱狀，有盤結(jié)長(zhǎng)0.5～3.5 cm，直徑2～4 cm。部分頂端附圓柱形殘莖，長(zhǎng)1～2 cm；斷面中空；根莖節(jié)處周圍著生多數(shù)根。根呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，彎曲，長(zhǎng)10～16 cm，直徑1～1.5 cm；表面淡黃棕色至淡棕色，具微細(xì)的縱皺紋，并有纖細(xì)的須根；質(zhì)脆，易折斷，斷面粉性，皮部類白色或白色，形成層環(huán)淡棕色，木部細(xì)小。莖單一或少有分支，長(zhǎng)20～60 cm，直徑1～2 mm；表面淡黃綠色，具細(xì)縱紋，或被毛；質(zhì)稍脆，折斷面纖維性。葉對(duì)生，葉片扭曲，易破碎，完整者長(zhǎng)披針形至線形，表面淡黃綠色，具短柄或幾無柄；頂端的葉腋內(nèi)偶見圓錐狀聚傘花序，花冠黃綠色。氣香，味微辛涼。見圖1。

圖1 了刁竹藥材圖

2.2 顯微鑒別 取藥材的根、莖、葉按石蠟切片法制作橫切面片；取適量藥材粉碎過60目篩后，將粉末放置載玻片上，滴加水合氯醛1～2滴透化，再滴加稀甘油1～2滴，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察和拍照。

2.2.1 根的橫切面特征：表皮細(xì)胞為一列，細(xì)胞類方形，外壁木化而增厚。皮層寬廣，細(xì)胞類圓形。細(xì)胞排列疏松，有的細(xì)胞內(nèi)含淀粉粒。內(nèi)皮層為一列細(xì)胞，凱氏點(diǎn)明顯。韌皮部狹窄，形成層不明顯。木質(zhì)部由導(dǎo)管及木纖維組成。見圖2。

2.2.2 莖的橫切面特征：莖直徑約2.0 mm。表皮為一列細(xì)胞類方形，外被角質(zhì)層。表皮下方有3～4列細(xì)胞含有葉綠素。皮層有斷續(xù)成環(huán)的纖維束組成。韌皮部狹窄，形成不明顯。木質(zhì)部由導(dǎo)管及纖維組成，木質(zhì)部射線明顯。髓細(xì)胞類圓形，排列疏松。見圖3。

2.2.3 葉的橫切面特征：葉的上、下表皮為一列細(xì)胞，上表皮為一列細(xì)胞，上表皮細(xì)胞較大，為不規(guī)則形。葉的薄壁細(xì)胞內(nèi)含草酸鈣簇晶。葉肉柵欄組織為柱形，排列整齊，海綿組織疏松。維管束為外韌型，導(dǎo)管單列排成行，韌皮部細(xì)胞排列緊密。下表皮細(xì)胞較小，見氣孔。見圖4。

2.3.4 粉末特征：本品呈淺灰棕色或褐色，氣清香，味微辛。淀粉粒眾多，單粒類圓形，直徑73～172 μm。具三復(fù)粒淀粉。草酸鈣簇晶較常見，直徑192～245 μm。非腺毛為單細(xì)胞，基部直徑130～175 μm。導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管，直徑85～148 μm。具緣紋孔導(dǎo)管直徑約286～414 μm。纖維有單根或成束，單根直徑約74～135 μm。見圖5。

圖2 根橫切面

圖3 莖橫切面

注：1.表皮，2.內(nèi)皮層，3.纖維束，4.韌皮部，5.木射線，6.木質(zhì)部，7.髓部

圖4 葉橫切面

注：1.上表皮，2.草酸鈣結(jié)晶，3.柵欄組織，4.導(dǎo)管，5.韌皮部，6.下表皮

圖5 粉末

2.3 TLC鑒別

2.3.1 方法一 ：取適量藥材粉碎過三號(hào)篩，取粉末約1 g，加乙醚10 ml，密塞，振搖10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)颖? ml溶解，作為供試品溶液。另取丹皮酚對(duì)照品，加丙酮制成2 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)附錄ⅥB]進(jìn)行試驗(yàn)，吸取供試品溶液5～10 μl、對(duì)照品溶液10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(3 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以鹽酸酸性5%的三氯化鐵乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果：10批藥材供試品均可檢出丹皮酚斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)分離效果好，集中清晰，重現(xiàn)性好，無干擾。見圖6。

圖6 了刁竹丹皮酚TLC圖

2.3.2 方法二：取適量藥材粉碎過三號(hào)篩，取粉末1 g，加乙醚10 ml，密塞，振搖10 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)颖? m溶解，作為供試品溶液。另取了刁竹對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)附錄Ⅵ B]進(jìn)行試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5～10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(10 ∶2 ∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果：10批藥材供試品色譜中，均可檢出對(duì)照藥材的主要斑點(diǎn)及熒光斑點(diǎn)。本方法分離效果好，斑點(diǎn)集中清晰，比移值適中，重現(xiàn)性好。見圖7和圖8。

圖7 了刁竹對(duì)照藥材TLC圖(365 nm熒光下)

注：1～2、4～10為了刁竹藥材；3為了刁竹對(duì)照藥材； A、B、C為 特征斑點(diǎn)

圖8 了刁竹對(duì)照藥材TLC圖(日光下)

注：1～2、4～10為了刁竹藥材；3為了刁竹對(duì)照藥材； A、B、C 為特征斑點(diǎn)

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 溶液制備：精密稱取丹皮酚對(duì)照品適量，加適量甲醇制成每1 ml含10 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液；取了刁竹(1號(hào))藥材粉末(過3號(hào)篩)0.2 g，置具塞平底燒瓶中，精密稱定，精密加入25 ml甲醇，稱定重量后，置水浴鍋加熱回流30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，過濾，精密吸取續(xù)濾液1 ml加甲醇定容到10 ml，作為供試品溶液；另取制備供試品溶液的甲醇試劑作為陰性溶液。

2.4.2 色譜條件及測(cè)定方法：以Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱，以甲醇-水(55 ∶45)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm，理論板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000，對(duì)照品與供試品溶液進(jìn)樣量均為10 μl。

2.4.3 專屬性考察：分別精密吸取上述2.4.1項(xiàng)的對(duì)照品、供試品和陰性溶液各10 μl，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果：本方法測(cè)定丹皮酚含量無陰性干擾，專屬性強(qiáng)。見圖9。

圖9 對(duì)照品溶液(A)、供試品溶液(B)、陰性對(duì)照液(C)HPLC圖

2.4.4 方法學(xué)考察：(1)線性關(guān)系考察：分別精密吸取丹皮酚溶液(108.2 μg/ml)0.1、1、2、3、4、5 ml，各加甲醇定容至25 ml，作為不同濃度的對(duì)照品溶液。將上述對(duì)照品溶液按擬定的色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：當(dāng)?shù)てし舆M(jìn)樣量在0.004328～0.2164 μg范圍內(nèi)時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程：Y=5053.4X-1.7687，r=0.9998。(2)精密度試驗(yàn)：取同一份供試品溶液(1號(hào))，按上述確定的色譜條件擬定的色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果：6次測(cè)定的丹皮酚峰面積平均值為160.4，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)=0.59%(n=6)。(3)重復(fù)性試驗(yàn)：取了刁竹樣品粉末(1號(hào))6份0.2 g，精密稱定，分別制備供試品溶液，分別測(cè)定并計(jì)算丹皮酚量。結(jié)果：6份供試液丹皮酚含量平均值為0.42%，RSD為1.17%(n=6)。(4)穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、24 h精密吸取10 μl注入液相色譜儀，測(cè)定丹皮酚峰面積值。結(jié)果：6次測(cè)定測(cè)得丹皮酚峰面積的平均值為160，RSD為1.03%。

2.4.5 回收率試驗(yàn)： 取了刁竹(全草)粉末(1號(hào))6份，每份約0.1 g，精密稱定，各加入丹皮酚對(duì)照品甲醇溶液(15.6 μg/ml)25 ml，照2.4.1項(xiàng)制備供試品溶液，并測(cè)定。結(jié)果：平均回收率為99.42%，RSD為1.60%(n=6)。

2.4.6 樣品測(cè)定：取表1中的10批了刁竹樣品，制備供試品溶液和丹皮酚對(duì)照品溶液同2.4.1，測(cè)定方法同2.4.2。結(jié)果：10批藥材丹皮酚含量為0.15%～1.16%，平均含量為0.59%。見表2。

表2 10批樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討 論

3.1 了刁竹全草性狀、顯微、TLC鑒別方法 (1)性狀鑒定。根據(jù)本文觀察結(jié)果，本品性狀主要特征為：根莖節(jié)處周圍著生多數(shù)根，根呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，表面淡黃棕色至淡棕色，質(zhì)脆，易折斷，斷面粉性，氣香，味微辛涼；莖多單一，具細(xì)縱紋；葉對(duì)生，完整者長(zhǎng)披針形至線形。藥材以莖葉茂盛，根及根莖香氣濃，味微辛涼為佳。(2)顯微鑒定。本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)了刁竹的根橫切面、莖橫切面、葉橫切面以及粉末進(jìn)行顯微觀察和圖片拍攝，考慮到生產(chǎn)檢驗(yàn)的實(shí)際情況，編制本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文時(shí)，只選擇了具有代表性和較易操作的莖橫切面和粉末特征。本品顯微鑒別要點(diǎn)為：根橫切面中，表皮細(xì)胞為一列，類方形；皮層寬廣，細(xì)胞類圓形；內(nèi)皮層為一列細(xì)胞，凱氏點(diǎn)明顯。粉末中淀粉粒眾多，具三復(fù)粒淀粉，草酸鈣簇晶較常見，導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管，纖維有單根或成束。(3)TLC鑒別。在TLC鑒別中，經(jīng)不同提取方式、不同展開系統(tǒng)、不同顯色方式、耐用性等研究，兩種鑒別方法結(jié)果均可見特征斑點(diǎn)，專屬性，特征性強(qiáng)，重復(fù)性好。故上述方法可作為了刁竹全草的性狀、顯微、TLC鑒別方法。

3.2 了刁竹含量測(cè)定方法 2010年版《中國(guó)藥典》收載了中藥徐長(zhǎng)卿，其藥用部位為根和根莖，以丹皮酚作為含量測(cè)定的指標(biāo)。經(jīng)筆者初步試驗(yàn)，了刁竹各部位均含有一定量的丹皮酚，據(jù)此本文以丹皮酚作為了刁竹全草含量測(cè)定的指標(biāo)?！吨袊?guó)藥典》收載的徐長(zhǎng)卿丹皮酚含量測(cè)定方法中供試品溶液采用超聲提取的方法制備。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)?jīng)對(duì)1號(hào)樣品分別采用回流和超聲提取兩種方法進(jìn)行丹皮酚得率的比較，回流提取制備的供試品溶液丹皮酚含量為0.40%，高于超聲提取的0.32%，故本實(shí)驗(yàn)最終采用水浴回流提取方法制備供試品溶液。最終建立了刁竹全草藥材中丹皮酚的高效液相色譜定量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了各批次樣品，均可檢出丹皮酚，10批藥材丹皮酚含量為0.15%～1.16%，平均含量為0.59%，提示不同產(chǎn)地的含量差異較大，有必要進(jìn)行質(zhì)量控制。考慮到藥材來源差異的情況，暫定本品丹皮酚含量限度為不低于0.20%。

[1] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生局.廣西本草選編:下冊(cè)[M].南寧:廣西人民出版社,1974:1 772.

[2] 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究所.廣西藥用植物名錄[M] 南寧:廣西人民出版社,1986:374.

[3] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草(第6冊(cè))[M].上海:科學(xué)技術(shù)出版社,1999:345.

[4] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第六十三卷 [M].北京:科學(xué)出版社,1977:351.

[5] 黃瑞松.壯藥選編:上冊(cè)[M].南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社,2015:306.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:268-269.

[7] 林玉璇,許學(xué)健.徐長(zhǎng)卿化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1963,10(9):576-577.

[8] 樓鳳昌,李 霞,馬琴玉,等.徐長(zhǎng)卿中異丹皮酚的結(jié)構(gòu)測(cè)定[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1989,20(3):167-169.

Research on quality control of Zhuang medicineCynanchumpaniculatum

LUZheng-lin1,HUANGRui-song1,HUANGQin2,LIANGXiao-dong3,YEJi-xiu4

(1GuangxiAcademyofMinorityNationalityMedicineandPharmacology,Nanning530001,China;2SchoolofPharmacy,3SchoolofBasieMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;4SchoolofPharmacy,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China)

Objective To establish the methods of identification and content measurement for Zhuang medicineCynanchumpaniculatum,thus to provide the reference for quality control ofCynanchumpaniculatum.Methods Qualitative and quantitative measurement forCynanchumpaniculatumwere conducted using macroscopical,microscopic identification,thin-layer chromatography(TLC) and high performance liquid chromatography(HPLC) method.Agilent ZORBAX SB-C18column was used as chromatographic column,and methanol-water(55 ∶45) as mobile phase in HPLC.The detection wavelength was 274 nm,the flow velocity was 1.0 ml/min,and temperature was kept at 30℃ in HPLC.Results In identification with TLC,characteristic spot was observed in the two identification methods.And the methods obtained specificity,obvious characteristics and good repeatability.HPLC method was used,when the sample size ofCynanchumpaniculatumwas between 0.004328 μg and 0.2164 μg,a good linear relationship was found between the sample size and peak area:Y=5053.4X-1.7687,r=0.9998,and the average percent recovery of sample was 99.42%.Of ten batches ofCynanchumpaniculatum,the contents of paeonol were 0.15%-1.16%,and the average content was 0.59%.Conclusion The established standards of qualitative identification and quantitative measurement can effectively control the quality ofCynanchumpaniculatum.

Zhuang medicine,Cynanchumpaniculatum,Paeonol,Quality control,Thin-layer chromatography,High performance liquid chromatography

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃(桂科重1355001-4)；廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(重2012015)；廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局課題(GX2C2014-G3-1577-YL2B-B-2)

陸崢琳(1985～)，女，碩士，助理研究員，研究方向：中草藥化學(xué)成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

黃瑞松(1958～)男，本科，主任中藥師，研究方向：中草藥化學(xué)成分和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，E-mail：hrs.3130064@163.com。

R 291.8；R 927.2

A

0253-4304(2016)08-1127-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.08.22

2016-03-17

2016-06-01)