胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用▲

支東一 李 偲 吳 嵐 劉開祥 李 浩

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，桂林市541001，E-mail：272740179@qq.com)

論著·基礎(chǔ)研究

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)大鼠腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用▲

支東一 李 偲 吳 嵐 劉開祥 李 浩

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，桂林市541001，E-mail：272740179@qq.com)

目的 探討胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)基因修飾的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)對(duì)大鼠腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 健康雄性Wistar大鼠48只分為假手術(shù)組、缺血模型組、 MSCs組、MSCs-IGF-1組，每組12只。除假手術(shù)組外，其余組采用改良線栓法建立左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。再灌注24 h后MSCs組、MSCs-IGF-1組分別采用MSCs、IGF-1修飾的MSCs干預(yù)治療。每組于再灌注后3 d和14 d行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，采用免疫組化法測(cè)BrdU陽細(xì)胞數(shù)量，TUNEL法測(cè)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，分光光度計(jì)測(cè)腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。結(jié)果 再灌注14 d后MSCs組與MSCs-IGF-1組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較缺血模型組明顯降低(P<0.05)，而MSCs-IGF-1組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于MSCs組(P<0.05)。再灌注后3 d及14 d，假手術(shù)組與缺血模型組未見明顯BrdU陽性細(xì)胞，MSCs-IGF-1組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)較MSCs組明顯增多(P<0.05)。再灌注后3 d及14 d，MSCs組與MSCs-IGF-1 組梗死半球神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目較缺血模型組相比明顯減少(P<0.05)，MSCs-IGF-1組比MSCs組凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。在灌注后3 d及14 d，與缺血模型組相比，MSCs組腦組織中SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯下降(P<0.05)，且MSCs-IGF-1組SOD活性較MSCs組更高(P<0.05)，MDA含量更低(P<0.05)。結(jié)論 IGF-1基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療干預(yù)比單純骨髓基質(zhì)細(xì)胞干預(yù)對(duì)腦缺血具有更好的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

腦缺血；骨髓基質(zhì)細(xì)胞；胰島素樣生長(zhǎng)因子1；大鼠；神經(jīng)保護(hù)；基因修飾

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)是目前應(yīng)用較多的外源性神經(jīng)干細(xì)胞之一，其數(shù)量相對(duì)較多，較易采集，分化能力較強(qiáng)，整合性較好；具有潛在較強(qiáng)的多向分化性，其可分化為永久性的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；將其移植入機(jī)體受損部位，可有效改善神經(jīng)功能[1-2]。MSCs移植是已知的治療大鼠局灶性腦缺血的有效方法。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)參與機(jī)體多種生理功能，是機(jī)體細(xì)胞增殖、分化和成熟過程中重要的一種細(xì)胞因子，不但對(duì)大腦生長(zhǎng)、發(fā)育有重要的作用，而且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞在體內(nèi)的存活及遷移，并促進(jìn)神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。本研究應(yīng)用IGF-1 基因轉(zhuǎn)染MSCs治療大鼠局灶性腦缺血，采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記MSCs行經(jīng)尾靜脈注射法移植，以探討該療法對(duì)移植細(xì)胞的存活及遷移、缺血腦組織中細(xì)胞凋亡的影響，以及對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用，為MSCs移植法治療人類腦缺血疾病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑：胎牛血清(Gibco公司，批號(hào)16000-044)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU；Sigma公司，批號(hào)B-5002)，單克隆小鼠BrdU抗體(Sigma公司，批號(hào)B8434)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)15596-026)，載體DNA3.1(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)5108)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)18080-051)，PCR引物 (美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)AM1005)，大腸桿菌DH5α(上海生工公司，批號(hào)AY2022-1)，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及HindⅢ(Promega公司，批號(hào)R6041)，質(zhì)粒提取試劑盒(Omega biotek公司，批號(hào)D2156)，LipofectAmine 2000 脂質(zhì)體(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)11668019)，脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Roche公司，批號(hào)11684817910)，二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物科技有限公司，批號(hào)P0010)，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫組化試劑盒(Boster公司，批號(hào)SA1074)。

1.1.2 主要儀器：動(dòng)物手術(shù)器械包(上海金鐘醫(yī)療器械有限公司)，雙極電凝器(北京東方紅劍醫(yī)療器械公司，型號(hào)CHR-V)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司，型號(hào)BB15)，可調(diào)式微量移液器(德國(guó)Eppendorf 公司，型號(hào)3111)，Labofuge 400R高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)，臺(tái)式干燥箱[上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠，型號(hào)GZX-GF-MBS-Z(9123A)]，電熱恒溫水浴箱(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠，型號(hào)HH.WZ1.600S)，-80℃超低溫冰箱(德國(guó)SIEMENS公司，型號(hào)MYZNJ)，雙目顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)IX70-SIFZ)，2400型PCR擴(kuò)增儀(Perkin-Elmer公司)，蛋白垂直電泳系統(tǒng) (美國(guó)Bio-Red公司，型號(hào)165-8001Mini-PROTEAN4)，轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器有限公司，型號(hào)TS-8)，BIO-RAD iMARK酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Red公司，型號(hào)iMARK)。1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：(1)雄性Wistar大鼠10只，周齡6周，清潔級(jí)，體質(zhì)量(180±20)g，購自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證：SCXK(桂)2009-0002。用于MSCs的提取。(2)雄性Wistar大鼠48只，周齡7～8周，清潔級(jí)，體質(zhì)量(250±30)g，購自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證：SCXK(桂)2009-0002。采用顆粒型鼠糧喂養(yǎng)，飲用自來水，室溫20℃左右。用于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)。

1.2 MSCs的提取、培養(yǎng)與標(biāo)記 取雄性Wistar大鼠10只，術(shù)前稱重，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下取大鼠脛骨和股骨，去其干骺端。用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓，將沖洗出的骨髓輕輕吹打均勻。 按細(xì)胞懸液 ∶細(xì)胞分離液=3 ∶1比例2 500 r/min離心15 min，然后重懸為單細(xì)胞懸液。在37℃、5% CO2、飽和濕度、充足培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)、擴(kuò)增。待原代培養(yǎng)細(xì)胞鋪滿瓶底，達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1 ∶2比例傳代，傳代細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，由于骨髓基質(zhì)細(xì)胞容易老化，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)行尾靜脈移植細(xì)胞選用第3～5 代傳代細(xì)胞。在移植前，將MSCs 1 000 r/min離心5 min，制成單細(xì)胞懸液，按1×106個(gè)/ml接種于培養(yǎng)瓶，并加入BrdU進(jìn)行標(biāo)記。

1.3 基因工程MSCs-IGF-1的生成及鑒定 (1)從周齡6周的雄性Wistar大鼠肝臟組織中抽提總RNA：取新鮮組織100 mg，剪碎后加入1 ml Trizol溶液，孵育5 min，低溫12 000 r/min離心15 min，去上清，加入75%乙醇，低溫7 500 r/min離心5 min，干燥RNA沉淀，-20℃保存。(2)利用RT-PCR獲取目的基因IGF-1互補(bǔ)DNA：總RNA反轉(zhuǎn)錄后得互補(bǔ)DNA，具體按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。經(jīng)PCR擴(kuò)增后凝膠電泳，割膠純化。然后將該目的基因與質(zhì)粒pcDNA3.1連接構(gòu)建為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1。(3)用氯化鈣溶液制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞：挑取大腸桿菌DH5α菌落于37℃液體培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期將菌液置于冰上，4℃ 8 000 r/min離心30 s，棄上清。用100 mmol/L的氯化鈣溶液400 μl懸浮菌體10 min，4℃ 4 000 r/min離心5 min，棄上清。再把菌體懸浮在冰上預(yù)冷的氯化鈣溶液中，此菌液即為感受態(tài)細(xì)菌。(4)將制備好的重組質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。期間避免培養(yǎng)基溫度過高，影響轉(zhuǎn)化率。(5)先用氨芐西林抗性菌落初步培養(yǎng)，制備小量存活的轉(zhuǎn)化體，采用BamHI與HindIII雙酶切對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行初步鑒定，酶切后進(jìn)行測(cè)序鑒定：挑取菌株接種于5 ml含有50 μg/ml的氨芐西林的培養(yǎng)液中，37℃搖床中培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)后的菌液按照質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)含有目的片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行全序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果通過Advanced BLAST2.0軟件與GenBank中的大鼠IGF-1互補(bǔ)DNA系列進(jìn)行分析。(6)然后搖菌大量擴(kuò)增含有目的基因的重組質(zhì)粒，SDS裂解法進(jìn)行提取。構(gòu)建重組質(zhì)粒 p-EGFP-N1-IGF-1，分別利用酶切、PCR、測(cè)序等方法驗(yàn)證，以確定 IGF-1的真核表達(dá)載體是否構(gòu)建成功。(7)基因轉(zhuǎn)染時(shí)嚴(yán)格按照LipofectAm-ine2000脂質(zhì)體使用說明書，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 術(shù)前12 h禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血模型組、MSCs組及MSCs-IGF-1組，每組12只。

1.5 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立 采用頸外動(dòng)脈插入石蠟線栓栓塞法，建立大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型。術(shù)前大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，取頸部正中皮膚切開，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、左側(cè)頸外動(dòng)脈和左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，此過程小心誤傷迷走神經(jīng)。用眼科剪在頸外動(dòng)脈剪一“V”形小口，線栓由頸外動(dòng)脈進(jìn)入然后折向頸內(nèi)動(dòng)脈，緩慢插入線栓，直至遇到阻力不能插入為止，此時(shí)，線栓插入深度至頸動(dòng)脈分叉處距離18～20 mm，線栓頭達(dá)到左側(cè)大腦中動(dòng)脈起始部。2 h后拔線栓至頸外動(dòng)脈實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組只分離血管，不行“V”形小口，不插入線栓。再灌注24 h后，MSCs組及MSCs-IGF-1組按1.0 ml/100 g體重行尾靜脈注入法行MSCs移植，其中MSCs組行MSCs移植，MSCs-IGF-1組行等量IGF-1基因修飾的MSCs移植。缺血模型組再灌注24 h后經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水做對(duì)照。

1.6 觀測(cè)指標(biāo)及方法 分別在再灌注后7 d、14 d，每組選取6只大鼠進(jìn)行指標(biāo)的檢測(cè)，其中3只用于BrdU陽性細(xì)胞檢測(cè)及TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，另3只用于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性與丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)含量測(cè)定。

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分：按照 Longa等[3]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各組分別于再灌注3 d和14 d后行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0分：正常，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：動(dòng)物不能完全伸展右前肢；2分：動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)“追尾現(xiàn)象”；3分：動(dòng)物行走跌倒或動(dòng)物站立不能；4分：無自發(fā)活動(dòng)，出現(xiàn)意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺損評(píng)分為1～3分視為局灶性腦缺血再灌注模型成功建立，除假手術(shù)組外，評(píng)分為0分、4分及蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠予以剔除。

1.6.2 免疫組化測(cè)BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)：每組于再灌注后3 d、14 d各取3只大鼠，10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，打開老鼠的胸腔，充分顯露心臟。然后依次用生理鹽水及4%多聚甲醛心內(nèi)快速滴注，待四肢伸直變硬后迅速斷頭取腦，切取以視交叉為中心、前后±2 mm的冠狀面腦組織，用4%多聚甲醛固定。常規(guī)脫水包埋制片，冠狀位切片。按照即用型SABC免疫組化試劑盒說明書，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。光鏡下觀察，細(xì)胞核顯示出特異性棕黃色即為BrdU陽性細(xì)胞。

1.6.3 TUNEL檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡：通過TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。再灌注后3 d、14 d制作厚5 μm腦冠狀面石蠟切片，步驟同“1.6.2”處免疫組化法，然后根據(jù)TUNEL試劑盒說明書，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行神經(jīng)凋亡細(xì)胞染色。其中細(xì)胞核內(nèi)顯示有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細(xì)胞，每張切片于高倍鏡視野(400×)下選取5個(gè)不重疊視野行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，其平均數(shù)即視為每張切片的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6.4 分光光度計(jì)測(cè)SOD活性、MDA含量：大鼠腦缺血再灌注模型制備成功后，每組隨機(jī)選3只大鼠深度麻醉迅速斷頭取腦，取梗死側(cè)(左側(cè))大腦半球，加入冰生理鹽水，制成10%腦組織勻漿，低溫3 000 r/min離心10 min、取上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以上過程均在冰上操作。按照試劑盒說明書采用黃嘌呤氧化酶法行腦組織中SOD活性測(cè)定，硫代巴比妥酸法行MDA含量測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs的培養(yǎng)形態(tài) MSCs接種初期，細(xì)胞種類較多，懸浮于培養(yǎng)基中，表面光滑、透亮，呈圓形或不規(guī)則形。3 d后即可出現(xiàn)細(xì)胞分裂現(xiàn)象，約1周細(xì)胞可鋪滿瓶底。傳代至第2代細(xì)胞呈類似于成纖維細(xì)胞的長(zhǎng)梭形，第3代以后細(xì)胞呈寬大扁平狀。見圖1、圖2。

圖1 原代MSCs(100×) 圖2 第5代MSCs(100×)

2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果 與缺血模型組比較，再灌注3 d后MSCs組和MSCs-IGF-1組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分無明顯差異(P>0.05)；再灌注14 d后MSCs組與MSCs-IGF-1組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較缺血模型明顯降低(P<0.05)，而MSCs-IGF-1組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于MSCs組(P<0.05)。見表1。

表1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果(x±s，分)

注：與缺血模型組比較，*P<0.05；與MSCs組比較，#P<0.05。

2.3 免疫組化測(cè)BrdU陽性細(xì)胞結(jié)果 假手術(shù)組與腦缺血模型組未見明顯BrdU陽性細(xì)胞，MSC 組與MSCs-IGF-1組在大鼠梗死側(cè)可見大量BrdU 陽性細(xì)胞，且在灌注后3 d及14 d，MSCs-IGF-1組BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)目較MSCs 組明顯增多(P<0.05)。見表2及圖3、圖4。

表2 BrdU陽性細(xì)胞數(shù)(x±s，個(gè)/HP)

A MSCs組 B MSCs-IGF-1組圖3 再灌注3 d后大鼠腦組織BrdU陽性細(xì)胞數(shù)(SABC染色，400×) A MSCs組 B MSCs-IGF-1組圖4 再灌注14 d后大鼠腦組織BrdU陽性細(xì)胞數(shù)(SABC染色，400×)

2.4 TUNEL法測(cè)腦細(xì)胞凋亡結(jié)果 在灌注后3 d及14 d，缺血模型組大鼠病灶側(cè)可見大量陽性凋亡腦細(xì)胞，較MSCs組、MSCs-IGF-1組明顯增多(P<0.05)；而MSCs-IGF-1組的腦細(xì)胞凋亡數(shù)量較MSCs 組明顯減少(P<0.05)。見表3及圖5、圖6。

表3 各組腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)量(x±s，個(gè)/HP)

注：各時(shí)間點(diǎn)，組間兩兩比較，P<0.05。

A 假手術(shù)組 B 缺血模型組

C MSCs組 D MSCs-IGF-1組

圖5 再灌注3 d后大鼠腦細(xì)胞凋亡的結(jié)果(TUNEL，400×)

A 假手術(shù)組 B 缺血模型組

C MSCs組 D MSCs-IGF-1組

圖6 再灌注14 d后大鼠腦細(xì)胞凋亡的結(jié)果(TUNEL，400×)

2.5 MDA和SOD檢測(cè)結(jié)果 在灌注后各時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，缺血模型組腦組織中SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯增加(P<0.05)；與缺血模型組比較，MSCs組與MSCs-IGF-1組的SOD活性顯著升高、MDA含量明顯減少(P<0.05)；與MSCs組比較，MSCs-IGF-1組腦組織中SOD活性更高(P<0.05)，MDA含量更低(P<0.05)。見表4。

表4 各組MDA 與SOD檢測(cè)結(jié)果(x±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P>0.05，余各組間兩兩比較，P均<0.05。

3 討 論

缺血性腦血管病是一種嚴(yán)重影響人類健康的常見病、多發(fā)病，其高致殘率和致死率給家庭及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[4]。改善腦缺血后的神經(jīng)功能缺損、提高患者生活質(zhì)量是目前神經(jīng)病學(xué)研究的重點(diǎn)方面。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，缺血組織再灌注主要通過釋放大量炎性因子、引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡等方面造成神經(jīng)功能缺損[5]。且應(yīng)用遠(yuǎn)端肢體缺血后處理[6]的實(shí)驗(yàn)方法調(diào)動(dòng)體內(nèi)內(nèi)源性保護(hù)通路來改善神經(jīng)功能缺損取到了不錯(cuò)的效果。近年來，隨著分子克隆和基因重組技術(shù)的逐漸成熟，神經(jīng)干細(xì)胞治療、基因工程治療等新方法的出現(xiàn)，又為腦血管病的治療提供了新思路。

MSCs是成體骨髓中的一類多能干細(xì)胞，具有分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的潛能，亦可轉(zhuǎn)分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，從而替代損傷組織，修復(fù)機(jī)體功能缺損。相關(guān)研究表明，直接將MSCs移植入顱內(nèi)，可明顯促進(jìn)治療組神經(jīng)功能的恢復(fù)，且病灶處的細(xì)胞存活、遷移及分化情況較對(duì)照組好[7-8]。另外，MSCs還可以促進(jìn)血管再生[9]，改善神經(jīng)細(xì)胞生存環(huán)境，進(jìn)一步加快神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，MSCs迅速成為臨床研究重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，單純進(jìn)行MSCs移植雖然有效，但是效果并不是十分理想[10]。目前，有研究采用基因工程技術(shù)，通過基因修飾使MSCs表達(dá)外源性基因，即在體外將編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、促生長(zhǎng)因子、抗凋亡因子等的基因片段導(dǎo)入MSCs 中，并將基因修飾后的MSCs移植到受損部位，利用MSCs可在腦缺血的微環(huán)境中向神經(jīng)細(xì)胞分化，促進(jìn)各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌的特點(diǎn)[11-12]，有效改善神經(jīng)功能缺損。IGF是生長(zhǎng)激素發(fā)揮生理作用過程中必需的一種活性蛋白多肽物質(zhì)?，F(xiàn)在已知的IGF包括IGF-1和IGF-2。IGF1是一類促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、具有胰島素樣代謝效應(yīng)的因子，可促進(jìn)骨合成代謝，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、分化，并參與創(chuàng)傷修復(fù)等重要的生命過程。IGF-1同樣存在于腦組織，是影響出生后大腦生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子[13]。相關(guān)研究表明，腦缺血后腦內(nèi)IGF-1mRNA的表達(dá)增高，游離的IGF-1濃度上升，提示IGF-1可能有神經(jīng)元保護(hù)作用[14]。不僅如此，IGF-1還能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化起到一定的誘導(dǎo)作用，并促進(jìn)細(xì)胞的存活。這些研究結(jié)果提示IGF-1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用。由于IGF-1分子量大，且血腦屏障的存在使常規(guī)靜脈注射治療效果不明顯，采用腦內(nèi)定向移植又加大了腦組織受損的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)技術(shù)操作要求較高。而基因治療的方法可有效避免這些弊端，經(jīng)基因修飾的干細(xì)胞移植，可使IGF-1在腦部持續(xù)表達(dá)，對(duì)于神經(jīng)損傷的修復(fù)非常有利。本實(shí)驗(yàn)選用IGF-1基因修飾MSCs來治療局灶性腦缺血模型大鼠，結(jié)果顯示，再灌注14 d后MSCs組與MSCs-IGF-1組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較缺血模型明顯降低(P<0.05)，而MSCs-IGF-1組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于MSCs組(P<0.05)，提示與MSCs組比較，IGF-1轉(zhuǎn)染MSCs治療組大鼠可顯著改善大鼠神經(jīng)功能，表明IGF-1 基因轉(zhuǎn)染MSCs治療腦缺血的療效明顯優(yōu)越于單純MSCs治療。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是腦缺血造成神經(jīng)損傷的主要病理生理學(xué)機(jī)制之一。腦組織缺血后，可產(chǎn)生大量氧自由基，引起線粒體損害和細(xì)胞水腫，促進(jìn)蛋白質(zhì)DNA鏈斷裂，引起神經(jīng)細(xì)胞功能、結(jié)構(gòu)等一系列改變[15]。因此，本研究從氧化應(yīng)激反應(yīng)方面探討了MSCs移植發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能的作用機(jī)制。MDA是脂質(zhì)過氧化代謝的最終產(chǎn)物，其含量可反映組織過氧化程度及細(xì)胞損傷的程度。SOD是超氧陰離子的天然殺手，能及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的細(xì)胞損害，SOD在生物體內(nèi)的水平是機(jī)體抗氧化能力的直觀指標(biāo)之一。Valle-Prieto等[16]的研究發(fā)現(xiàn)體外MSCs可以增強(qiáng)SOD和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，有效清除體內(nèi)活性氧和活性氮物質(zhì)，限制氧化應(yīng)激造成的組織損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與缺血模型組比較，MSCs組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯下降(P<0.05)，說明MSCs具有一定的抗氧化應(yīng)激作用，從而可減輕神經(jīng)功能損害。此外，本文結(jié)果亦顯示MSCs-IGF-1組在MSCs基礎(chǔ)上，SOD活性進(jìn)一步增加(P<0.05)，MDA含量進(jìn)一步減少(P<0.05)，說明了MSCs經(jīng)基因修飾后增強(qiáng)了其單獨(dú)移植的抗氧化應(yīng)激能力。本研究還檢測(cè)了標(biāo)記MSCs BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，再灌注后3 d和14 d，MSCs-IGF-1組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)均較MSCs組明顯升高(P<0.05)，說明了IGF-1基因具有促進(jìn)MSCs移植后的存活及遷移的作用。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是繼發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)受損后的一個(gè)常見轉(zhuǎn)歸，也是造成神經(jīng)功能缺損的一個(gè)重要因素。本文結(jié)果顯示，再灌注后3 d和14 d，MSCs-IGF-1組的神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量均較MSCs組明顯減少，原因可能是IGF-1基因本身具有一定的抗凋亡作用，也可能是MSCs經(jīng)IGF-1基因修飾后促進(jìn)了其在腦內(nèi)的遷移及分化，從而加強(qiáng)了自身的抗細(xì)胞凋亡能力。

綜上所述，經(jīng)IGF-1基因轉(zhuǎn)染后MSCs比其單獨(dú)移植對(duì)腦缺血后的神經(jīng)恢復(fù)具有更好的療效。其機(jī)制可能是因?yàn)镮GF-1基因修飾可促進(jìn)MSCs的存活及遷移分化，并增強(qiáng)其抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡能力，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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Effect of insulin-like growth factor-1 gene-modified marrow stromal cells on neurological protection in rats with cerebral ischemia

ZHIDong-yi,LICai,WULan,LIUKai-xiang,LIHao

(DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin541001,China)

Objective To explore the effect of insulin-like growth factor-1(IGF-1)gene-modified marrow stromal cells(MSCs) on the neurological protection in rats with cerebral ischemia,and to investigate the mechanism.Methods Forty-eight healthy male Wistar rats were divided into sham group,ischemia model group,MSCs group,MSCs-IGF-1 group,with 12 rats in each group.The ischemia-reperfusion model of left middle cerebral artery was established by using the modified embolism line methods in all groups except for the sham group.MSCs group and MSCs-IGF-1 group were treated with MSCs and IGF-1-modified MSCs respectively after 24 hours of reperfusion.At 3 and 14 days after reperfusion,neurological deficit scores were assessed,the amount of BrdU-positive cells was detected by immunohistochemistry,the apoptosis neural cells were detected by TUNEL method,and the superoxide dismutase(SOD) activity and methane dicarboxylic aldehyde(MDA) level of brain tissues were measured by spectrophotometer.Results At 14 days after reperfusion,the neurological scores of MSCs group and MSCs-IGF-1 group were significantly lower than that of ischemia model group(P<0.05),and the score of MSCs-IGF-1 group was significantly lower than that of MSCs group(P<0.05).At 3 and 14 days after reperfusion,the cells with significantly positive BrdU were not observed in the sham group and ischemia model group,and the cells with positive BrdU of MSCs-IGF-1 group were significantly more than those of MSCs group(P<0.05).At 3 and 14 days after reperfusion,the amount of nerve cell apoptosis in the infarct hemisphere was significantly lower in MSCs group or MSCs-IGF-1 group compared to that in the ischemia model group(P<0.05),and the amount in the MSCs-IGF-1 group was significantly lower than that in the MSCs group(P<0.05).At 3 and 14 days after reperfusion,MSCs group obtained significantly higher SOD activity and lower MDA level in the brain tissues compared to ischemia model group(P<0.05).And MSCs-IGF-1 group had higher SOD activity and lower MDA level compared to MSCs group(P<0.05).Conclusion IGF-1 gene-modified MSCs has a superior neurological protection effect on cerebral ischemia compared to MSCs alone,and the mechanism might be related to strengthening the ability of resisting oxidative stress of MSCs and reducing the number of apoptosis cells.

Cerebral ischemia,Marrow stromal cells,Insulin-like growth factor-1,Rat,Neurological protection,Gene-modified

廣西自然科學(xué)基金(2013GXNSFAA019190)；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(YCSZ2014207)；廣西醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(Z2013480)

支東一(1989～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：腦血管病。

李浩(1975～)，男，在讀博士研究生，教授，研究方向：腦血管病，E-mail：1871412324@qq.com。

R 743.31

A

0253-4304(2015)01-0001-06

10.11675/j.issn.0253-4304.2015.01.01

2015-10-21

2016-01-07)