HBV相關(guān)性和非HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織的長鏈非編碼RNA的表達(dá)分析

趙 冀 周 超 鄧小凡 張 宇 劉興超 朱世凱 陳 凱 陳云飛 楊洪吉

(四川省人民醫(yī)院1 器官移植中心，2 消化內(nèi)科，成都市 610072，E-maill：zhaoji8842@163.com)

論著·臨床研究

HBV相關(guān)性和非HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織的長鏈非編碼RNA的表達(dá)分析

趙 冀1周 超2鄧小凡1張 宇1劉興超1朱世凱1陳 凱1陳云飛1楊洪吉1

(四川省人民醫(yī)院1 器官移植中心，2 消化內(nèi)科，成都市 610072，E-maill：zhaoji8842@163.com)

目的 探討HBV相關(guān)性和非HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌(HCC)組織的長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達(dá)情況。方法 選擇行手術(shù)治療的HBV相關(guān)HCC患者42例、非HBV相關(guān)HCC患者45例，采用原位雜交技術(shù)檢測兩組患者腫瘤維修組和癌旁組織中肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1-反義RNA1(AFAP1-AS1)、肝癌微血管浸潤相關(guān)lncRNA(MVIH)和肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT-1)的表達(dá)水平，并比較不同臨床特征HCC患者腫瘤組織AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1的表達(dá)情況。結(jié)果 在兩組患者中，腫瘤組織AFAP-AS1的染色分?jǐn)?shù)低于癌旁組織(P<0.05)，而腫瘤組織MVIH和MALAT-1的染色分?jǐn)?shù)高于癌旁組織(P均<0.05)。HBV相關(guān)性HCC組癌旁組織中的AFAP-AS1染色分?jǐn)?shù)高于非HBV相關(guān)HCC組癌旁組織(P<0.05)，而兩組腫瘤組織AFAP-AS1染色分?jǐn)?shù)、兩組腫瘤組織或癌旁組織中MVIH和MALAT-1的染色分?jǐn)?shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。在HBV相關(guān)性HCC、非HBV相關(guān)性HCC患者中，AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1在不同的分期和分型患者的腫瘤組織中的表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 在HCC組織中AFAP1-AS1表達(dá)下調(diào)而MVIH和MALAT-1表達(dá)上調(diào)，三者均參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，而AFAP1-AS1的表達(dá)可能還受到HBV相關(guān)生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。

肝細(xì)胞癌；乙型肝炎病毒；長鏈非編碼RNA；肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1-反義RNA1；肝癌微血管浸潤相關(guān)長鏈非編碼RNA；肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)全球的發(fā)病率和死亡率均較高，由于我國人口基數(shù)較大，在我國HCC的年新發(fā)病例數(shù)約占全球總新發(fā)病數(shù)的55%[1]。HCC的發(fā)生與HBV感染的關(guān)系十分密切，約50%的HCC是由HBV感染導(dǎo)致[1]。有研究表明HBV相關(guān)性HCC和非HBV相關(guān)性HCC可能存在臨床病理特征的不同，前者的術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)是后者的1.5倍[2]。這些提示兩種HCC的病理發(fā)展過程和疾病進(jìn)展機(jī)制可能存在一定差異。一項(xiàng)大規(guī)模研究結(jié)果顯示，約90%的HBV相關(guān)性HCC患者的腫瘤細(xì)胞里被整合進(jìn)了HBV-DNA[3]，因此使得HBV相性關(guān)HCC的基因調(diào)控和蛋白表達(dá)也有異于非HBV相關(guān)性HCC，從而進(jìn)一步使得兩者的生物學(xué)過程表現(xiàn)不一致。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，二、三級結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在細(xì)胞凋亡、分化等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[4]。越來越多的研究表明一些lncRNA在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色，而在關(guān)于HCC的研究中，肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1-反義RNA1(actin filament-associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1)、肝癌微血管浸潤相關(guān)lncRNA(long non-coding RNA associated with microvascular invasion in HCC， MVIH)和肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1)等lncRNA被發(fā)現(xiàn)在HCC組織中差異表達(dá)，并且部分lncRNA還與HCC的臨床特征相關(guān)[5-7]。但這些lncRNA在HBV相關(guān)性HCC和非HBV性相關(guān)HCC中是否也存在差異表達(dá)，進(jìn)而引起兩者的生物學(xué)行為出現(xiàn)差異尚無明確結(jié)論。本研究旨在探討HBV相關(guān)性HCC組織、非HBV相關(guān)性HCC組織和癌旁組織中AFAP1-AS1、MVIH、MALAT-1的表達(dá)情況，為揭示兩種腫瘤不同生物學(xué)行為的表現(xiàn)機(jī)制提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 納入2011年7月至2014年6月四川省人民醫(yī)院器官移植中心收治的HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理學(xué)明確診斷為HCC；(2)符合衛(wèi)生部發(fā)布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版)》[8]肝切除術(shù)適應(yīng)證，并行手術(shù)治療的患者，手術(shù)切除腫瘤組織和癌旁組織樣本保存完好、可用；(3)術(shù)前同時接受血清HBV和HCV病毒標(biāo)志物檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)外院手術(shù)者或無法獲取腫瘤組織和癌旁組織樣本者；(2)合并其他部位惡性腫瘤或其他器官嚴(yán)重功能障礙；(3)HBV和HCV同時感染者。最終納入87例HCC患者，其中HBV相關(guān)性(HBsAg陽性)HCC 42例、非HBV相關(guān)性(HBsAg陰性)HCC 45例。兩組患者臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。所有受試者均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院的倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)同意。

表1 兩組臨床資料比較

注：*按照肝細(xì)胞癌的巴塞羅那分期(2010版)進(jìn)行臨床分期[9]。

1.2 組織芯片制作 將42例HBV相關(guān)HCC和45例非HBV相關(guān)HCC的手術(shù)切除腫瘤組織、癌旁組織標(biāo)本送西安艾麗娜生物科技有限公司加工制作，每張芯片包含175個組織點(diǎn)(每點(diǎn)都來源于不同患者或同一患者的不同類型組織)囊括了所有患者所有類型的組織和染色對照點(diǎn)，為保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，共制作18張組織芯片，其中3張用作不同lncRNAs原位雜交實(shí)驗(yàn)條件摸索(每個lncRNA各1張)，9張用作檢測(每個lncRNA各3張)，6張備用(每個lncRNA各2張)。

1.3 主要試劑與儀器 原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司、熒光倒置顯微鏡購自德國Leica公司(DM2500)、烘箱購自德國Binder公司、4℃和-20℃冰箱購自中國Haier公司。

1.4 原位雜交

1.4.1 寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)和合成：在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中查找AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1相應(yīng)基因的DNA序列，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，并在BLAST軟件中進(jìn)行精確匹配，并參閱相應(yīng)文獻(xiàn)[5-7]為每個lncRNA選出特異性較好、雜交參數(shù)最佳的探針。AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-13個lncRNA基因的探針序列分別為5′-TGTTGATTCTAAGAGGACACAGACTGCTTCATTC-3′、5′-CAAACAGGGAGTAGTTCTTAGTGAGTAGTTC-3′和5′-GAACATGTAACTTGTAGACTGGAGAAGATAGG-3′。最后送北京金唯智生物科技有限公司完成寡核苷酸探針的序列合成和標(biāo)記(3′端采用地高辛標(biāo)記)。

1.4.2 雜交檢測：包含175個組織點(diǎn)的組織芯片經(jīng)60 min烤片、30 min脫蠟、梯度酒精、滅火內(nèi)源性過氧化物酶、暴露mRNA核酸片段、后固定等標(biāo)準(zhǔn)的流程處理后，進(jìn)行預(yù)雜交(37℃ 4 h)、雜交(37℃過夜)、洗滌和封閉，再向芯片上滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC和生物素化過氧化物酶等進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺染色，最后清洗封片。同一lncRNA的3張檢測用芯片的處理?xiàng)l件保持一致。

1.5 結(jié)果判斷 應(yīng)用Leica熒光倒置顯微鏡觀察AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1在各組織中的表達(dá)分布，并將圖像拍照存檔。采用半定量評分法[10]評價染色情況：(1)使用ImagePro Plus軟件分析組織的平均光密度或陽性染色強(qiáng)度(陰性為0分、弱陽性為1分、陽性為2分、強(qiáng)陽性為3分)；(2)兩名研究者分別對切片進(jìn)行陽性染色細(xì)胞比率計(jì)分(0%～5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分)；(3)染色分?jǐn)?shù)=染色強(qiáng)度×陽性染色細(xì)胞比率計(jì)分。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，不同組別樣本間基因的表達(dá)差異比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1在不同類型HCC患者不同組織中的表達(dá)情況 AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。采用半定量評分法對三者的原位雜交染色結(jié)果進(jìn)行評分，結(jié)果顯示在HBV相關(guān)HCC組和非HBV相關(guān)HCC組中，腫瘤組織AFAP-AS1的染色分?jǐn)?shù)低于癌旁組織(P均<0.05)，而腫瘤組織MVIH和MALAT-1的染色分?jǐn)?shù)高于癌旁組織(P均<0.05)。HBV相關(guān)性HCC組癌旁組織中的AFAP-AS1染色分?jǐn)?shù)高于在非HBV相關(guān)HCC組癌旁組織(P<0.05)，兩組腫瘤組織AFAP-AS1染色分?jǐn)?shù)、兩組腫瘤組織或癌旁組織中MVIH和MALAT-1的染色分?jǐn)?shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

表2 AFAP-AS1、MVIH和MALAT-1在兩組不同組織中染色分?jǐn)?shù)比較(x±s，分)

2.2 不同臨床特征HCC患者腫瘤組織AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1的表達(dá)情況 在HBV相關(guān)性HCC、非HBV相關(guān)性HCC患者中，AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1在不同的分期和分型患者的腫瘤組織中的表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表3。

表3 不同臨床特征HCC患者AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1的染色分?jǐn)?shù)比較(x±s，分)

3 討 論

基礎(chǔ)研究表明，lncRNA作為基因組中的“暗物質(zhì)”，實(shí)際上參與蛋白修飾過程、翻譯水平、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳水平等多層面的生物學(xué)過程，并與肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。HCC作為一種與HBV感染密切相關(guān)的惡性腫瘤[12]，其基因組中l(wèi)ncRNA的表達(dá)調(diào)控可能受到HBV生物學(xué)過程的影響，從而使得lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也發(fā)生改變。

肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1基因本身被認(rèn)為是病毒癌基因依賴的酪氨酸蛋白激酶的作用底物之一，有肌動蛋白銜接蛋白的功能，對維持上皮細(xì)胞張力絲的完整性十分重要，并且與前列腺癌和乳腺癌等密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，無論是HBV相關(guān)HCC還是非HBV相關(guān)HCC，其腫瘤組織中的AFAP-AS1表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)，但不同臨床分期和分型的HCC患者AFAP-AS1表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，提示AFAP-AS1在HCC發(fā)生中的潛在作用，但其與腫瘤的進(jìn)展可能并無明顯關(guān)系。趙艷華[5]也研究發(fā)現(xiàn)，AFAP1-AS1在HCC中的表達(dá)下調(diào)，并且可能通過RNA-RNA之間的相互作用影響肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1生物學(xué)功能的發(fā)揮，從而達(dá)到參與HCC的發(fā)生發(fā)展中。此外，結(jié)果顯示，AFAP1-AS1在HBV相關(guān)HCC癌旁組織中的表達(dá)顯著高于非HBV相關(guān)HCC癌旁組織(P<0.05)，推測AFAP1-AS1的表達(dá)調(diào)控可能與HBV的生物學(xué)過程密切相關(guān)，AFAP1-AS1的下調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生過程相關(guān)，因此AFAP1-AS1扮演的可能是抑制腫瘤發(fā)生的作用，但具體機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還需進(jìn)一步分析。

MVIH是一種與腫瘤微血管浸潤相關(guān)的lncRNA[13]，袁聲賢[6]對215例肝癌患者進(jìn)行研究后證實(shí)了MVIH過表達(dá)與頻繁的微血管浸潤及較高的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段，以及無復(fù)發(fā)生存率下降有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，與癌旁組織相比，腫瘤組織中MVIH表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，提示MVIH具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，符合前期研究[6]對MVIH潛在生物學(xué)功能的理解。MALAT-1是近些研究新發(fā)現(xiàn)的一個可作為肝移植后是否復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)[14]。有研究顯示MALAT-1過表達(dá)廣泛存在于HCC中，并參與HCC的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，是預(yù)測肝癌肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7，15]，本研究結(jié)果也顯示腫瘤組織中MVIH表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。但不同臨床分期和分型的HCC患者M(jìn)VIH、MALAT-1表達(dá)均無明顯差異(P>0.05)，且兩組腫瘤組織或癌旁組織中MVIH和MALAT-1的染色分?jǐn)?shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，提示MVIH和MALAT-1與腫瘤的進(jìn)展可能并無明顯關(guān)系，且與HBV感染可能無相關(guān)性。

綜上所述，AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-13種lncRNA與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中AFAP1-AS1的表達(dá)調(diào)控可能與HBV的生物學(xué)過程密切相關(guān)，應(yīng)深入分析lncRNA在HBV感染與HCC發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系。但研究仍存在不足之處：一方面，本研究采用的是原位雜交方法，這種方法的穩(wěn)定性不如實(shí)時熒光定量PCR，對條件的摸索和控制較為困難，因此外界因素可能對結(jié)果產(chǎn)生一定干擾；另一方面，本研究未結(jié)合患者的預(yù)后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，因此對AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1等3種lncRNA在HCC進(jìn)展中是否也具有重要作用不得而知。今后的研究還需采用更加準(zhǔn)確的方法，全面地結(jié)合患者的臨床病理特征，深入分析lncRNA在HBV相關(guān)HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

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Analysis on expressions of long non-coding RNAs in HBV-related and non-HBV-related hepatocellular carcinoma tissues

ZHAOJi1,ZHOUChao2,DENGXiao-fan1,ZHANGYu1,LIUXing-chao1,ZHUShi-kai1,CHENKai1,CHENYun-fei1,YANGHong-ji1

(1OrganTransplantCenter,2DepartmentofGastroenterology,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China)

Objective To explore the expressions of long non-coding RNAs(lncRNA) in HBV-related and non-HBV-related hepatocellular carcinoma(HCC) tissues.Methods Forty-two patients with HBV-related and 45 with non-HBV-related HCC undergoing surgery were enrolled.insituhybridization technique was used to detect the expression levels of actin filament-associated protein 1-antisense RNA1(AFAP1-AS1),lncRNA associated with microvascular invasion in HCC(MVIH) and metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT-1) in tumor tissues and paracarcinoma tissues of both groups.And the expressions of AFAP1-AS1,MVIH and MALAT-1 in the tumor tissues were compared between the HCC patients with different clinical features.Results In the two groups,the staining fraction of AFAP-AS1 was lower but the staining fractions of MVIH and MALAT-1 were higher in the tumor tissues compared to the paracarcinoma tissues(allP<0.05).The staining fraction of AFAP-AS1 in the paracarcinoma tissues of HBV- related HCC group was higher than that in the paracarcinoma tissue of non-HBV-related HCC(P<0.05),but no significant difference in the staining fraction of AFAP-AS1 in the tumor tissues was found between the two groups(allP>0.05).And there were no significant differences in the staining fractions of MVIH and MALAT-1 in either tumor tissues or paracarcinama tissues between the two groups(allP>0.05).For the patients with HBV-related HCC or non-HBV-related HCC,no significant differences in the staining fractions of AFAP-AS1,MVIH and MALAT-1 in the tumor tissues were found between the patients with different stages or classifications(allP>0.05).Conclusion The expression of AFAP1-AS1 decreases but the expressions of MVIH and MALAT1 increase in HCC tissues,and all of them are involved in the development of HCC.And the expression of AFAP1-AS1 may also be regulated by HBV-related biological processes.

Hepatocellular carcinoma,Hepatitis B virus,Long non-coding RNA,Actin filament-associated protein1-antisense RNA1,Long non-coding RNA associated with microvascular invasion in HCC,Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1

趙冀(1980～)，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：肝癌診斷治療基礎(chǔ)與臨床。

R 735.7

A

0253-4304(2016)10-1385-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.13

2016-04-27

2016-07-19)