趨化因子受體9、血管內皮生長因子及基質金屬蛋白酶2、9在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

王志維 牛玉旭 林 輝

(1 武漢大學人民醫(yī)院胸心外科，武漢市 430060，E-mail：wangzhiwp@sina.com；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院胸心外科，南寧市 530021)

論著·臨床研究

趨化因子受體9、血管內皮生長因子及基質金屬蛋白酶2、9在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

王志維1牛玉旭1林 輝2

(1 武漢大學人民醫(yī)院胸心外科，武漢市 430060，E-mail：wangzhiwp@sina.com；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院胸心外科，南寧市 530021)

目的 探討趨化因子受體9(CCR9)、血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMP)2及MMP9在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達情況及其臨床意義。方法 采用免疫組化PV-9000法檢測60例NSCLC患者腫瘤組織和癌旁組織中CCR9與VEGF、MMP2、MMP9的表達情況，分析腫瘤組織CCR9表達與臨床病理特征及其他蛋白表達間的關系，以及腫瘤組織VEGF、MMP2、MMP9的陽性表達率與淋巴結轉移間的關系。結果 腫瘤組織CCR9、VEGF、MMP2、MMP9蛋白的陽性表達率均高于癌旁組織(P<0.05)。腺癌、淋巴結轉移患者的腫瘤組織CCR9陽性表達率分別高于鱗癌、無淋巴結轉移患者(P<0.05)，淋巴結轉移患者腫瘤組織MMP2及MMP9的陽性表達率均高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)。VEGF陽性表達、MMP2陽性表達、MMP9陽性表達患者的腫瘤組織CCR9陽性表達率分別高于VEGF陰性表達、MMP2陰性表達、MMP9陰性表達患者(P<0.05)，且在淋巴結轉移患者中，腫瘤組織CCR9的表達與VEGF、MMP2及MMP9蛋白的表達均呈正相關(P<0.05)。結論 CCR9與VEGF、MMP2、MMP9蛋白的高表達可能在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移中發(fā)揮重要作用，CCR9或許能通過某些信號通路來調控VEGF、MMP2、MMP9蛋白的表達，其可能會成為評估NSCLC病情發(fā)展的重要指標。

肺腫瘤；非小細胞肺癌；趨化因子受體9；血管內皮生長因子；基質金屬蛋白酶

Expression of chemokine receptor 9,vascular endothelial growth factor,matrix

肺癌屬于全球常見的惡性腫瘤[1]，在我國肺癌的發(fā)病率和病死率一直居高不下[2]，其中約85%患者為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。目前臨床上對NSCLC患者主要采取手術為主，放療、化療、生物、中醫(yī)中藥等為輔的綜合治療，但患者的治療和預后未見突破性進展，患者的 5年總生存率不足20%[3]。對NSCLC的發(fā)病相關因素進行研究，并做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，成為目前迫切需求。

越來越多的研究表明，趨化因子受體(chemokine receptor，CCR)9在卵巢癌[4-5]、胰腺癌[6]、乳腺癌[7]等多種惡性腫瘤中表達，其可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)已被證實具有強大的促進血管生長作用[8]，其與相應的受體結合以后能促進血管的新生及生長。同時，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一種細胞外蛋白水解酶，可降解基底膜，促進惡性腫瘤的侵襲和遷移[9]，其中MMP2和MMP9又是降解Ⅳ型膠原最主要的酶。本研究將對CCR9、VEGF、MMP2、MMP9在NSCLC中的表達情況及其之間的關系進行初步探索，為針對NSCLC發(fā)病機制及靶向治療的后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年9月至2015年12月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院胸心外科行手術治療的NSCLC患者60例，收集其手術切除的腫瘤組織及癌旁組織石蠟包埋標本，所有病例術前均未接受放化療及免疫治療，且在術后及進入本研究前進行了雙重病理學診斷。60例NSCLC患者中，肺腺癌35例，肺鱗癌25例；男性40例，女性20例；年齡31～76歲，平均年齡58歲；淋巴結轉移陽性者45例，淋巴結轉移陰性者15例。

1.2 主要試劑 兔抗人CCR9單克隆抗體購自英國Abcam公司(生產批號：GR105409)；即用型鼠抗人VEGF單克隆抗體購自福建邁新生物技術開發(fā)有限公司(生產批號：160202243C)；即用型兔抗人MMP2多克隆抗體(生產批號：15913112)、即用型兔抗人MMP9單克隆抗體、PV-9000試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒均購自北京中杉金橋公司(生產批號：16690201、K152411C、15155A10)。

1.3 CCR9、VEGF、MMP2、MMP9的檢測 采用免疫組織化學法(PV-9000法)對所得標本進行檢測。所有石蠟標本4 μm厚連續(xù)切片，60℃烤箱烤片2 h，二甲苯、梯度酒精脫蠟、水化切片，檸檬酸鹽溶液進行抗原修復(高溫高壓法)，3% H2O2去離子水溶液孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶。分別于切片標本上滴加兔抗CCR9單克隆抗體(稀釋濃度為1 ∶50)、即用型鼠抗VEGF單克隆抗體、即用型兔抗MMP2多克隆抗體、即用型兔抗MMP9單克隆抗體，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作為陰性對照。4℃冰箱中孵育過夜，室溫下復溫45 min，PBS浸洗3次，每次5 min。依次滴加PV-9000試劑盒中試劑1(聚合物輔助劑)、試劑2(辣根酶標記羊抗兔或小鼠IgG多聚體)，37℃水浴箱中45 min后取出，常規(guī)DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，鏡下閱片。

1.4 結果判定 采取雙盲法經由兩位病理醫(yī)師閱片，CCR9、VEGF、MMP2、MMP9的陽性反應定位在腫瘤細胞的胞膜和(或)胞質中，結果評判標準參考鐘永瀧等[10]使用的標準，采用半定量二次計分法。在400倍鏡下隨機挑選5個不重復視野，每個視野下計數100個腫瘤細胞，將5個視野的腫瘤細胞平均陽性率作為該切片的陽性率。陽性率≤5%記為0分；陽性率>5%～<25%記為1分；陽性率25%～<50%記為2分；陽性率≥50%記為3分。根據細胞染色的強度分為：細胞未著色為0分；細胞著淺黃色為1分；細胞著黃色為2分；細胞著棕黃色或褐色為3分。兩者相乘，乘積0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～6分為陽性，>6分為強陽性；得分為0記為陰性，得分>0均記為陽性組。

1.5 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，CCR9與VEGF、MMP2及MMP9之間的相關性分析采用雙向有序列聯(lián)表資料的χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CCR9、VEGF、MMP2和MMP9蛋白在NSCLC組織及癌旁組織的表達 CCR9、VEGF、MMP2和MMP9主要在腫瘤組織細胞膜和(或)細胞質中表達，胞膜呈現(xiàn)黃色顆粒狀，胞質呈現(xiàn)彌漫性黃染；在癌旁組織肺泡上皮細胞中CCR9、VEGF、MMP2和MMP9呈陽性表達，其染色強度、陽性細胞率均顯著低于癌組織，見圖1。CCR9、VEGF、MMP2和MMP9在腫瘤組織中的陽性表達率均高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

圖1 CCR9、VEGF、MMP2和MMP9在NSCLC腫瘤組織中的表達情況 注：A為CCR9在肺腺癌中陽性表達；B為CCR9在肺鱗癌中陽性表達；C為VEGF在肺腺癌中陽性表達；D為VEGF在肺鱗癌中陽性表達；E為MMP2在肺腺癌中陽性表達；F為MMP2在肺鱗癌中陽性表達；G為MMP9在肺腺癌中陽性表達；H為MMP9在肺鱗癌中陽性表達。

表1 CCR9、VEGF、MMP2、MMP9在NSCLC患者腫瘤 組織與癌旁組織中的陽性表達情況[n=60，(n，%)]

2.2 CCR9表達與NSCLC臨床病理特征及其他蛋白表達之間的關系 腺癌、淋巴結轉移、VEGF陽性表達、MMP2陽性表達、MMP9陽性表達患者的腫瘤組織CCR9陽性表達率分別高于鱗癌、無淋巴結轉移、VEGF陰性表達、MMP2陰性表達、MMP9陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而不同性別、年齡段患者腫瘤組織的CCR9陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 VEGF、MMP2及MMP9的陽性表達率與淋巴結轉移及CCR9之間的關系 淋巴結轉移患者腫瘤組織MMP2及MMP9的陽性表達率均高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)，見表3。此外，在存在淋巴結轉移患者中，其腫瘤組織CCR9的表達與VEGF、MMP2及MMP9蛋白的表達均呈正相關(r=0.339，P<0.05；r=0.257，P<0.05；r=0.530，P<0.05)。

表2 不同臨床病理學特征、不同VEGF、MMP2、MMP9 表達情況患者腫瘤組織中CCR9的陽性表達率比較

表3 有無淋巴結轉移患者腫瘤組織VEGF、MMP2、MMP9的陽性表達比較(n，%)

3 討 論

CCR是一類含有7次跨膜結構的G蛋白偶聯(lián)受體，已有研究表明，其通過與配體結合的方式其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[11-12]。目前越來越多的CCR被發(fā)現(xiàn)與腫瘤存在著密切的關系，如CCR10[13]、CCR6[14]、CXCR4[15]等。隨著對CCR方面研究的深入，作為CCR家族一員的CCR9因能通過結合特異性配體C-C趨化因子配體25[16]在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等[4，7，17-20]多種腫瘤中異常表達而引起了研究者的重視。

在本研究中，我們通過檢測非小細胞肺癌患者腫瘤組織CCR9的表達情況發(fā)現(xiàn)，CCR9在腫瘤組織中的陽性表達率均高于癌旁組織(P<0.05)，且淋巴結轉移患者腫瘤組織CCR9的陽性表達率高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)，提示NSCLC組織中CCR9的表達上調，且可能與淋巴結轉移密切相關，這與李杰等[21]在胰腺癌方面的報告相似。CCR9在肺腺癌和肺鱗癌中均有表達，但腺癌中的表達率更高(P<0.05)，這種差異可能可解釋肺腺癌較肺鱗癌預后更差、更易早期轉移的特點。因此CCR9的表達情況可作為臨床評估NSCLC患者預后的有效指標，為NSCLC患者的早期診斷、預后評估等提供參考，針對CCR9的靶向治療或許能成為NSCLC治療方案的選擇之一。

VEGF又稱為血管通透因子，其首先在牛垂體濾泡星形細胞的體外培養(yǎng)液中提取獲到，該因子能直接或間接促進血管的形成。其既能通過特異性誘導血管內皮細胞有絲分裂的方式來直接刺激血管生成[22]，又能增加血管的通透性為血管的形成提供支持。本研究結果顯示，NSCLC患者腫瘤組織的VEGF陽性表達率高于癌旁組織(P<0.05)，這提示VEGF可能參與NSCLC的血管形成等過程，我們猜測VEGF可能促進腫瘤組織中血管的增殖從而為腫瘤細胞的生長提供營養(yǎng)支持。

自1962年Gross等[23]首次發(fā)現(xiàn)以來，目前至少已發(fā)現(xiàn)MMP有23個成員[24]，它們都屬于鋅離子依賴蛋白內切酶家族，是人體內降解細胞外基質的主要酶類，具有促進惡性腫瘤細胞侵襲和轉移的作用。其中MMP2(又稱為72 KD Ⅵ型膠原酶或明膠酶A)和MMP9(又稱為92 KD Ⅵ型膠原酶或明膠酶B)被認為是腫瘤侵襲轉移過程中最直接、最主要的金屬蛋白酶[25]。MMP2和MMP9在腫瘤組織中的陽性表達率均高于癌旁組織(P<0.05)，提示NSCLC組織中MMP2和MMP9的表達均上調。腫瘤細胞會分泌酶原狀態(tài)的MMP2、MMP9，兩者被激活成膠原酶以后才會降解細胞外基質，然后腫瘤細胞即可透過缺失部分向周圍組織和器官進行擴散，最終達到侵襲轉移的目的；而在正常組織中的MMP與基質金屬蛋白酶組織抑制劑之間保持相對平衡狀態(tài)，共同維持著細胞外基質的降解或聚集，維持機體的穩(wěn)定。此外，淋巴結轉移NSCLC患者腫瘤組織的MMP2及MMP9陽性表達率均顯著高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)，也進一步提示MMP2和MMP9在NSCLC的侵襲轉移中起著不可忽視的作用。

在針對CCR9與VEGF、MMP2、MMP9之間關系的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF陽性表達、MMP2陽性表達、MMP9陽性表達患者的腫瘤組織CCR9陽性表達率分別高于VEGF陰性表達、MMP2陰性表達、MMP9陰性表達患者(P<0.05)，且在淋巴結轉移患者中，其腫瘤組織CCR9的表達與VEGF、MMP2及MMP9蛋白的表達均呈正相關(P<0.05)，這提示CCR9有可能通過某些信號通路來調節(jié)VEGF、MMP2及MMP9蛋白的表達，進而達到調節(jié)NSCLC增殖、侵襲、轉移等過程。

綜上所述，CCR9、VEGF、MMP2、MMP9蛋白的高表達可能在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移中發(fā)揮重要作用，CCR9可能通過某些信號通路來調控VEGF、MMP2、MMP9蛋白的表達，其可能會成為評估NSCLC病情發(fā)展的重要指標。雖然目前關于CCR9在NSCLC中的研究越來越多，但是具體的調控機制及信號通路尚未闡述清楚，還需要進一步深入研究，以期能為NSCLC的臨床綜合治療提供一種新的思路。

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metalloproteinase 2 and 9 in non-small cell lung cancer tissues and its clinical significance

WANGZhi-wei1,NIUYu-xu1,LINHui2

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China;2DepartmentofCardiothoracicSurgery,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To explore the expressions of chemokine receptor 9(CCR9),vascular endothelial growth factor(VEGF),matrix metalloproteinase(MMP)2 and MMP9 in the non-small cell lung cancer(NSCLC) tissues and its clinical significance.Methods The expressions of CCR9,VEGF,MMP2 and MMP9 were detected by immunohistochemistry(PV-9000) in tumor tissues and paracarcinoma tissues of 60 patients with NSCLC.The relationship of CCR9 expression in tumor tissues with clinicopathological features and other proteins expressions was analyzed.The relationship of positive rates of VEGF,MMP2 and MMP9 with lymph node metastasis was also analyzed.Results The positive expression rates of CCR9,VEGF,MMP2 and MMP9 in tumor tissues were higher than those in paracarcinoma tissues(P<0.05).The positive expression rates of CCR9 in tumor tissues of the patients with adenocarcinoma and with lymph node metastasis were higher than those of the patients with squamous cell carcinoma and without lymph node metastasis respectively(P<0.05).The positive expression rates of MMP2 and MMP9 in tumor tissues of the patients with lymph node metastasis were higher than those of the patients without lymph node metastasis(P<0.05).The positive expression rates of CCR9 in tumor tissues of the patients with positive VEGF expression,positive MMP2 expression and positive MMP9 expression were higher than those of the patients with negative VEGF expression,negative MMP2 expression and negative MMP9 expression respectively(P<0.05).And among the patients with lymph node metastasis,the expression of CCR9 in tumor tissues positively correlated with the expression of VEGF,MMP2 or MMP9(P<0.05).Conclusion Up-regulation of CCR9,VEGF,MMP2 and MMP9 expressions probably plays an important role in the progression,metastasis and invasion of NSCLC.The expressions of VEGF,MMP2 and MMP9 may be regulated by CCR9 through some signal pathways.CCR9 probably becomes an important indicator for evaluating the development of NSCLC. 【Key words】 Lung neoplasm,Non-small cell lung cancer,Chemokine receptor 9,Vascular endothelial growth factor,Matrix metalloproteinase

王志維(1962～)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：心臟大血管疾病的防治。

林輝(1957～)，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：胸心疾病臨床診斷的研究，E-mail：linhui33622@126.com。

R 734.2

A

0253-4304(2016)10-1377-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.11

2016-06-03

2016-07-25)