凋亡大腸癌CT26細胞對小鼠血清免疫因子水平以及免疫細胞增殖、活性的影響▲

孫朝文 張廣鈺 趙 辰 成懷福 鐘 漓 戴 凌

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，桂林市 541001，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

凋亡大腸癌CT26細胞對小鼠血清免疫因子水平以及免疫細胞增殖、活性的影響▲

孫朝文 張廣鈺 趙 辰 成懷福 鐘 漓 戴 凌

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，桂林市 541001，E-mail：sunchaowen20081010@163.com)

目的 探討凋亡大腸癌CT26細胞對小鼠血清免疫因子水平以及免疫細胞增殖、活性的影響。方法 取對數(shù)生長期大腸癌CT26細胞制備凋亡、壞死腫瘤細胞。取Balb/c小鼠20只，分離T淋巴細胞亞群及自然殺傷(NK)細胞、獲取巨噬細胞，并制備細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。將小鼠CTL、NK細胞、巨噬細胞分別經(jīng)相應(yīng)腫瘤細胞處理后，均分為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組，應(yīng)用51Cr釋放實驗測定各組CTL、NK細胞、巨噬細胞的活性，細胞計數(shù)(CCK-8)法檢測各組CTL、NK細胞和巨噬細胞的增殖情況。另選取Balb/c小鼠分為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組各10只，分別將凋亡、壞死、對數(shù)生長期CT26細胞按通過皮下及靜脈輸注小鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組小鼠血清可溶性Fas(sFas)、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-4、IL-10、IL-12、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達水平。結(jié)果 與壞死腫瘤細胞組及腫瘤細胞對照組比較，凋亡腫瘤細胞組中不同效靶比的CTL、NK細胞及巨噬細胞活性均降低(P<0.05)。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，凋亡腫瘤細胞組的CTL、NK細胞及巨噬細胞的A450值均低于壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組(P<0.05)。ELISA檢測顯示凋亡腫瘤細胞組sFas相對表達量低于壞死腫瘤細胞組和腫瘤細胞對照組(P<0.05)。凋亡腫瘤細胞組IL-4表達水平高于腫瘤細胞對照組(P<0.05)，IL-10、TGF-β表達水平則高于其他兩組(P<0.05)，IL-12表達水平低于其他兩組(P<0.05)。結(jié)論 凋亡大腸癌CT26細胞能夠抑制小鼠特異性CTL、NK細胞、巨噬細胞增殖及其活性，影響大腸癌小鼠正常免疫功能。

大腸癌；CT26細胞；細胞毒性T細胞；自然殺傷細胞；巨噬細胞；可溶性Fas

大腸癌是最為常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第3位[1]。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率近年來持續(xù)上升，現(xiàn)已分別位居男性惡性腫瘤發(fā)病第5位和女性惡性腫瘤發(fā)病第3位[2]。過去幾十年中，在大腸癌治療方面上取得巨大進步，且已形成手術(shù)治療加術(shù)后輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)方案[3]，同時近年來部分指南對不能耐受手術(shù)或者術(shù)后預(yù)期較差的患者，推薦使用西妥昔單抗單一療法或者聯(lián)合伊立替康(或鉑類)的聯(lián)合治療方案[4]。然而結(jié)直腸癌仍是全球癌癥死因的主要原因之一[5]，特別是由于我國居民飲食結(jié)構(gòu)向西方轉(zhuǎn)變、肥胖及缺乏運動等因素，大腸癌的發(fā)病率和死亡率進一步上升[6]。目前認(rèn)為影響大腸癌發(fā)生的主要因素是遺傳因素和環(huán)境因素[7]，而大腸癌患者機體的免疫功能改變主要包括調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)數(shù)量增高、腫瘤應(yīng)答的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)活性降低及對腫瘤細胞的免疫耐受，機體免疫監(jiān)視功能的降低與喪失被認(rèn)為是結(jié)直腸癌發(fā)生的主要表現(xiàn)。機體發(fā)生免疫監(jiān)視功能的降低與喪失的原因眾多，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)凋亡腫瘤細胞也可誘導(dǎo)機體對腫瘤的免疫耐受[8]，而近期又有學(xué)者提示通過阻斷在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄活化因子3磷酸化可幫助腫瘤細胞免受機體自身免疫系統(tǒng)的清除[9]。但目前凋亡腫瘤細胞導(dǎo)致機體對腫瘤免疫耐受的機制未明。因此，本研究通過分析凋亡大腸癌CT26細胞對小鼠血清免疫因子水平以及免疫細胞增殖、活性的影響，以探討凋亡腫瘤細胞與腫瘤免疫耐受的關(guān)系及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物 放線菌素D(美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：1102C035)；6%可溶性淀粉肉湯：在100 ml肉湯培養(yǎng)基[北京海淀中海動物保健科技公司，090216(PT-1)]中加入可溶性淀粉6 g，經(jīng)煮沸滅菌30 min，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物 清潔級6～8周齡Balb/c小鼠50只，雄性，體重(240±30)g，動物許可證號：SCXK(湘)2014-0015，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。所有小鼠均按無特定病原體級飼養(yǎng)，且所有實驗均通過動物倫理委員會認(rèn)證。

1.3 細胞株及主要試劑 小鼠結(jié)腸癌細胞株CT26.WT(購于中國科學(xué)院細胞庫)。膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，生產(chǎn)批號：20140331)、胰酶(美國Gibco公司，生產(chǎn)批號：1220087)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：141215)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：130422)等。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司，型號：311)，雙人超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號：BCM-1000)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus，型號：CKX-31)；離心機(德國Eppendorf，型號：Centrifuge 5415R)；移液槍(芬蘭百得公司，型號：Genex，規(guī)格：20～200 μl)；BL-420生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，型號：BL-420S)等。

1.5 方法

1.5.1 CT26細胞的培養(yǎng)及凋亡、壞死腫瘤細胞的制備： 將CT26細胞用含10%胎牛血清(美國Gibco公司，生產(chǎn)批號：14000-044)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司，生產(chǎn)批號：120917)培養(yǎng)于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。另取對數(shù)生長期CT26細胞接種于6孔板中，調(diào)整密度為1×106細胞/孔。待細胞貼壁后加入含放線菌素D(200 ng/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h誘導(dǎo)凋亡，用胰酶消化，收集懸液并依次加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶(美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：20120811)，混勻后室溫避光孵育15 min后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡，富集，按不同濃度稀釋備用。另外取對數(shù)生長期CT26細胞用加熱法(腫瘤細胞株56℃水浴1h)制備壞死腫瘤細胞，顯微鏡下觀察細胞的壞死形態(tài)改變并確定，臺盼藍拒染法檢測細胞死亡率，按不同濃度稀釋備用。

1.5.2 動物分組及CTL細胞、NK細胞及巨噬細胞的制備： 適應(yīng)性喂養(yǎng)Balb/c小鼠5～6 d后，取6～8周齡雄性Balb/c小鼠20只，采用隨機數(shù)字表法將其分為單個核細胞制備組及腹腔巨噬細胞制備組，每組10只。單個核細胞制備組的小鼠正常喂養(yǎng)，3 d后脫頸椎處死，取脾臟，去被膜，于200目不銹鋼網(wǎng)過濾，800 r/min離心4 min后收集待分離細胞，將細胞懸浮于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，采用免疫磁珠分選法分別分離T細胞亞群與自然殺傷(natural killer，NK)細胞，通過流式細胞儀鑒定其表型，分選出的陽性細胞用熒光標(biāo)記的相應(yīng)抗體通過熒光激活細胞分離法(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)鑒定純度。將T淋巴細胞與凋亡腫瘤細胞按25 ∶1比例混勻，靜置于培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，4 d后半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。第2周起，每周加比例為10 ∶1的凋亡細胞1次，共3次。其中在第2次的第3天加入白細胞介素(interleukin，IL)-2(終濃度20 U/ml)，并每隔3～4 d更換1次培養(yǎng)基。在第3次結(jié)束后，2 000 r/min離心5～10 min后收集細胞，即特異性CTL，計數(shù)、調(diào)整至合適濃度。給予腹腔巨噬細胞制備組的小鼠腹腔注射無菌的6% 淀粉肉湯1.0 ml，通過引發(fā)腹腔的非感染性炎癥而誘導(dǎo)腹腔外巨噬細胞移動并聚集于腹腔。48 h后，被巨噬細胞吞噬的淀粉等微粒已消化殆盡，誘導(dǎo)后巨噬細胞尚屬于正常巨噬細胞，并具有活躍的吞噬功能。誘導(dǎo)2～3 d后處死，仰臥固定，常規(guī)消毒皮膚，開腹，用毛細吸管收集腹腔液，其中含豐富的巨噬細胞。計數(shù)、調(diào)整巨噬細胞濃度。

1.5.3 免疫細胞的分組：將不同免疫細胞(CTL、NK細胞、巨噬細胞)分別經(jīng)相應(yīng)腫瘤細胞處理后，CTL、NK細胞、巨噬細胞均分為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組3個亞組：(1)凋亡腫瘤細胞組：先將不同的免疫細胞各自與凋亡腫瘤細胞在96孔培養(yǎng)板內(nèi)共孵育2 h，后以兩組不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入靶細胞繼續(xù)孵育至4 h。(2)壞死腫瘤細胞組：先將不同的免疫細胞各自與壞死腫瘤細胞在96孔培養(yǎng)板內(nèi)共孵育2 h，后以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)加入靶細胞繼續(xù)孵育至4 h。(3)腫瘤細胞對照組：不同的免疫細胞各自與靶細胞以不同的效靶比(25 ∶1、50 ∶1)在96孔培養(yǎng)板內(nèi)孵育至4 h。

1.5.4 免疫細胞活性檢測：采用51Cr釋放實驗測定各組的CTL、NK細胞、巨噬細胞活性，其中以相應(yīng)腫瘤細胞為靶細胞并預(yù)先以Na251CrO4標(biāo)記，免疫細胞為效應(yīng)細胞。以上各組同時設(shè)自然釋放對照孔及最大釋放對照孔。分別取每組各孔上清，用γ計數(shù)儀測量放射活性值(單位：cpm)。免疫細胞活性根據(jù)下式計算51Cr自然釋放率和免疫細胞活性：

1.5.5 免疫細胞增殖檢測：采用細胞計數(shù)(cell counting kit-8，CCK-8)法檢測鼠的NK、CTL、巨噬細胞增殖。分別將各組CTL、NK細胞、巨噬細胞與對數(shù)生長期的CT26細胞按25 ∶1比例混勻鋪96孔板，細胞重懸成單細胞懸液，每孔1×103個細胞，100 μl培基，每組3個復(fù)孔，96孔板邊上一圈的孔不鋪細胞，只加PBS用于調(diào)零。將培養(yǎng)板靜置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共培養(yǎng)72 h，終止培養(yǎng)前2 h加入每孔加入10 μl的CCK-8試劑(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：20120503)，繼續(xù)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A值)，計算細胞增殖活性。

1.5.6 ELISA檢測細胞因子表達水平：選取6～8周齡雄性Balb/c小鼠30只，采用隨機數(shù)字表法將其分為凋亡腫瘤細胞組、壞死腫瘤細胞組、腫瘤壞死對照組各10只，各組通過皮下及靜脈注射相應(yīng)不同狀態(tài)(凋亡、壞死、對數(shù)生長期)的CT26細胞，皮下注射采用1×107/ml密度、0.05 ml的注射量，靜脈注射采用1～3 ml的注射量。分別經(jīng)尾靜脈采血約500 μl，待血自然凝固后，5 963 r/min離心10 min，吸取血清分裝凍存于-70℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。采用ELISA嚴(yán)格按照操作說明書進行檢測血清可溶性Fas(soluble Fas，sFas)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、IL-4、IL-10、IL-12、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)水平。測定標(biāo)本A450值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，A值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點，通過標(biāo)本的A值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以(x±s)表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗或q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同狀態(tài)腫瘤細胞對小鼠體外CTL、NK細胞及巨噬細胞活性的抑制作用 3組的CTL、NK細胞及巨噬細胞51Cr自然釋放率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與壞死細胞組及腫瘤細胞對照組比較，凋亡腫瘤細胞組的CTL、NK細胞及巨噬細胞不同效靶比的CTL、NK細胞及巨噬細胞活性均降低(P<0.05)。見表1～3。

表1 不同狀態(tài)腫瘤細胞對 小鼠體外CTL活性的影響(x±s，%)

注：與壞死腫瘤細胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細胞對照組比較，#P<0.05。

表2 不同狀態(tài)腫瘤細胞對 小鼠體外NK細胞活性的影響(x±s，%)

注：與壞死腫瘤細胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細胞對照組比較，#P<0.05。

表3 不同狀態(tài)腫瘤細胞對 小鼠體外巨噬細胞活性的影響(x±s，%)

注：與壞死腫瘤細胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細胞對照組比較，#P<0.05。

2.2 不同狀態(tài)腫瘤細胞對小鼠NK細胞、CD8+T淋巴細胞和巨噬細胞增殖的影響 凋亡腫瘤細胞組的NK細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞的A450值均低于壞死腫瘤細胞組、腫瘤細胞對照組(P<0.05)，見表4。

表4 不同狀態(tài)腫瘤細胞對 小鼠免疫細胞增殖活性的影響(x±s)

注：與壞死腫瘤細胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細胞對照組比較，#P<0.05。

2.3 不同狀態(tài)腫瘤細胞對小鼠血清sFas表達以及小鼠血清IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平的影響 凋亡腫瘤細胞組sFas相對表達量低于壞死腫瘤細胞組和腫瘤細胞對照組(P<0.05)，而壞死腫瘤細胞組的sFas相對表達量則高于正常腫瘤細胞組(P<0.05)。凋亡腫瘤細胞組抗炎因子IL-4表達水平高于腫瘤細胞對照組而小于壞死腫瘤細胞組(P<0.05)，抗炎因子IL-10、TGF-β表達水平則高于其他兩組(P<0.05)，促炎因子IL-12表達水平低于其他兩組(P<0.05)，IFN-γ表達水平亦低于其他兩組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 不同狀態(tài)腫瘤細胞對小鼠血清sFas表達量及IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β含量的影響(x±s)

注：與壞死腫瘤細胞組比較，△P<0.05；與腫瘤細胞對照組比較，#P<0.05。

3 討 論

近年來，細胞凋亡與機體免疫的關(guān)系，特別是細胞凋亡參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)成為研究熱點。Feig等[8]發(fā)現(xiàn)凋亡除了與機體免疫系統(tǒng)保持平衡和穩(wěn)定有密切的關(guān)系外，其更是機體主動調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的一種重要方式，即凋亡具有免疫調(diào)節(jié)作用。Ravishankar等[9]發(fā)現(xiàn)凋亡細胞可以調(diào)節(jié)機體先天免疫系統(tǒng)，使得二級淋巴器官的哨兵吞噬細胞減少和免疫抑制通路被阻斷，從而達到減輕局部炎癥、產(chǎn)生自身耐受的效果，其將凋亡細胞調(diào)節(jié)的固有免疫抑制與凋亡細胞的免疫耐受形容為“上下文”般的依賴關(guān)系。Hassan等[10]則提出，傳統(tǒng)意義上認(rèn)為正常的細胞凋亡可以減少基因?qū)用娴哪[瘤發(fā)生，但往往腫瘤細胞誘導(dǎo)正常的細胞凋亡變異，進而可以導(dǎo)致腫瘤細胞逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視。陳建鋒等[11]認(rèn)為細胞死亡的不同方式對機體的免疫應(yīng)答可能有著不同的影響，如細胞的凋亡可能抑制局部的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受，而細胞的壞死則啟動了適應(yīng)性免疫反應(yīng)，加強免疫應(yīng)答。

本研究分別采用51Cr釋放實驗、CCK-8方法檢測凋亡大腸癌CT26細胞培養(yǎng)的免疫細胞活性及增殖情況，結(jié)果顯示，與壞死細胞組及腫瘤細胞對照組比較，凋亡腫瘤細胞組中不同效靶比的CTL、NK細胞及巨噬細胞活性及A450值均降低(P<0.05)，這提示與凋亡大腸癌CT26細胞培養(yǎng)的免疫細胞活性及增殖受到抑制。因此，可以初步認(rèn)為不僅是正常細胞凋亡可以抑制機體免疫調(diào)節(jié)，凋亡的大腸癌CT26細胞也可抑制T淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞的增殖和活性，這意味著凋亡腫瘤細胞也可以像正常細胞凋亡時那樣誘導(dǎo)機體發(fā)生免疫耐受。多年來一直認(rèn)為這些凋亡細胞對免疫系統(tǒng)的影響極小，而腫瘤細胞往往會抑制細胞凋亡特別是對腫瘤細胞自身的凋亡刺激[12]。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)通過吞噬負載抗原的凋亡細胞而誘導(dǎo)了免疫耐受，未成熟的DC細胞能遞呈凋亡信號至抗原特異性T細胞，從而抑制了T細胞的增殖，這表明在體內(nèi)凋亡的誘導(dǎo)能導(dǎo)致抗原特異性耐受，很有可能通過DC和Treg介導(dǎo)[13]。凋亡細胞導(dǎo)致免疫耐受已在一些器官移植的實驗中得到證實[14-15]。此外，陳建峰等[11]以大鼠心臟移植作為動物模型，將紫外線照射后培養(yǎng)8 h的供者凋亡脾細胞注入受鼠體內(nèi)，分別在輸注后0、3、7、14 d將供鼠心臟移植至受鼠腹腔內(nèi)，結(jié)果提示紫外線能有效誘導(dǎo)大鼠脾細胞凋亡，預(yù)輸注供者凋亡脾細胞組移植心臟存活期明顯延長，而輸注相同活細胞或死細胞組則無此效應(yīng)，表明凋亡細胞能主動抑制受者淋巴細胞活性，延長同種移植物存活時間。Sun[16]將人白血病細胞株K560和HL-60用細胞凋亡誘導(dǎo)劑芬戈莫德和放線菌酮誘導(dǎo)凋亡后，與小鼠脾源性淋巴細共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其能抑制CD3+小鼠T淋巴細胞的早期活化因子CD69的表達，表明凋亡腫瘤細胞在抑制T細胞的活化、調(diào)節(jié)T細胞的免疫方面起重要的作用。而我們也發(fā)現(xiàn)凋亡大腸癌CT26細胞可抑制T淋巴細胞、巨噬細胞及NK細胞的增殖和活性。這提示當(dāng)機體固有免疫系統(tǒng)功能受到抑制時，炎性因子的活性受到影響，可能成為誘導(dǎo)機體對腫瘤細胞產(chǎn)生免疫耐受的重要環(huán)節(jié)。但也有學(xué)者報告凋亡細胞對免疫系統(tǒng)有相反的作用，Wang等[17]從C57/B1/6小鼠脾分離的活化T細胞，并用30 Gy的放射線照射以使T細胞凋亡，然后將凋亡T細胞注射同基因小鼠腹腔，結(jié)果顯示免疫小鼠體內(nèi)CD8+T細胞和CD62L+T細胞的比例明顯增多，對小鼠的腫瘤生長具有抑制作用。

然而，目前仍未完全明確細胞凋亡是如何對機體免疫系統(tǒng)進行精細調(diào)節(jié)。既往學(xué)者認(rèn)為Fas及其配體可以促進細胞凋亡，但是它們在炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)方面的作用尚未明確[18]。而目前的觀點認(rèn)為已凋亡細胞提供了豐富的抗原，從而使機體建立起外周免疫耐受[19]。Dupont等[20]在總結(jié)前人的基礎(chǔ)上提出，F(xiàn)as配體之所以在免疫赦免中扮演重要角色，是因為由Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)等腫瘤壞死因子家族通過誘導(dǎo)浸潤性淋巴細胞凋亡達到抑制免疫應(yīng)答的目的；其對比經(jīng)鼠源Fas配體(mouse Fas ligand，mFasL)和可溶性Fas配體(soluble Fas ligand，sFasL)激活的T淋巴細胞和中性粒細胞后發(fā)現(xiàn)，在體外暴露于細胞表面的mFasL高度表達于DAP-3小鼠的成纖維細胞并激活T淋巴細胞的凋亡，而sFasL是一種較低效的T淋巴細胞凋亡誘導(dǎo)劑，可是通過分子交聯(lián)可以大大提升sFasL的效率；同時發(fā)現(xiàn)雖然sFasL在激活T淋巴細胞的凋亡方面相當(dāng)?shù)托В墒菂s可以強力促進中性粒細胞的趨化。少量的研究表明缺乏sFasL可能導(dǎo)致無法激活中性粒細胞招募[21]。然而目前sFasL誘導(dǎo)中性粒細胞招募現(xiàn)象的機制尚不明確。Lloyd等[22]認(rèn)為經(jīng)Fas介導(dǎo)的凋亡可能不是一個被動的過程，而是凋亡細胞主動釋放高水平的細胞因子IL-1和IL-10。Miwa等[23]則認(rèn)為FasL引起中性粒細胞浸潤的進一步機制是FasL可以誘導(dǎo)靶細胞產(chǎn)生IL-1β。而目前被廣泛接受的機制則是由Chen等[24]提出的，其認(rèn)為FasL誘導(dǎo)了可以產(chǎn)生激活中性粒細胞增殖作用的蛋白激酶。本研究針對sFas的表達水平及相關(guān)免疫因子的水平進行了探討，結(jié)果顯示，凋亡腫瘤細胞組sFas相對表達量低于壞死腫瘤細胞組和腫瘤細胞對照組(P<0.05)，且凋亡腫瘤細胞組抗炎因子IL-4表達水平高于腫瘤細胞對照組(P<0.05)，抗炎因子IL-10、TGF-β表達水平則高于其他兩組(P<0.05)，促炎因子IL-12表達水平低于其他兩組(P<0.05)。這提示相對于正常生長的腫瘤細胞及已經(jīng)發(fā)生死亡的腫瘤細胞，凋亡中或者即將啟動凋亡的腫瘤細胞中sFas及相關(guān)抗炎免疫因子表達水平上升。這從另一角度反映炎癥反應(yīng)得到抑制，同時也提示即使Fas配體能夠抑制細胞凋亡，但在已經(jīng)發(fā)生凋亡的腫瘤細胞中卻能發(fā)揮抑制T淋巴細胞等免疫細胞的活性甚至低效誘導(dǎo)T淋巴細胞凋亡，在此基礎(chǔ)上可能聯(lián)合產(chǎn)生誘導(dǎo)中性粒細胞趨化，進而達到產(chǎn)生機體免疫耐受。所以當(dāng)機體固有免疫系統(tǒng)功能受到抑制時，炎性因子的活性受到影響，可能成為誘導(dǎo)機體對腫瘤細胞產(chǎn)生免疫耐受的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述，凋亡小鼠大腸癌CT26細胞能夠抑制小鼠特異性CTL、NK細胞、巨噬細胞增殖及其活性，影響了大腸癌小鼠正常免疫功能。凋亡大腸癌CT26細胞sFas表達降低影響其自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的部分炎癥因子及其活性，緩解局部炎癥反應(yīng)，進而抑制小鼠免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫抑制或免疫耐受。本次實驗對于凋亡CT26細胞抑制小鼠特異性CTL、NK細胞、巨噬細胞增殖及其活性的具體機制沒有展開具體研究，實驗中部分實驗結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義可能是樣本數(shù)不足、重復(fù)性不夠、測量誤差等原因引起，應(yīng)當(dāng)進一步實驗論證。

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Effects of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on serum levels of immunological factors,proliferation and activity of immunological cells in mice

SUNChao-wen,ZHANGGuang-yu,ZHAOChen,CHENGHuai-fu,ZHONGLi,DAILing

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China)

Objective To investigate the effects of apoptotic colorectal cancer CT26 cells on the serum immunological factors levels,the proliferation and activity of immunological cells in mice.Methods Colorectal cancer CT26 cells during logarithmic growth phase were used to prepare the apoptotic and necrotic tumor cells.T lymphocyte subsets and natural killer(NK) cells were isolated and macrophages were obtained from 20 Balb/c mice,and then cytotoxic T lymphocytes(CTL) were prepared.CTL,NK cells and macrophages were divided into apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group after treated with corresponding tumor cells.51Cr release assay was used to detect the activities of CTL,NK cells and macrophages in each group.Cell counting kit-8(CCK-8) assay was used to detect the proliferation of CTL,NK cells and macrophages.Another Balb/c mice were selected and divided into apoptotic tumor cell group,necrotic tumor cell group and tumor cell control group,with 10 rats in each group.Apoptotic CT26 cells,necrotic CT26 cells and CT26 cells during logarithmic growth phase were subcutaneously and intravenously infused into mice in corresponding groups.The enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the expression levels of serum soluble Fas(sFas),interference gamma(IFN-γ),interleukin(IL)-4,IL-10,IL-12 and transforming growth factor-β(TGF-β).Results Compared to the necrotic tumor cell group or the tumor cell control group,the activities of CTL,NK cells and macrophages with different effect-or-target ratios decreased in the apoptotic tumor cell group(P<0.05).The results of CCK-8 assay showed that theA450 values of CTL,NK cells and macrophages in the apoptotic tumor cell group were lower than those in either the necrotic tumor cell group or the tumor cell control group(P<0.05).ELISA assay showed that the relative expression of sFas in the apoptotic tumor cell group was lower than that in either the necrotic tumor cell group or the tumor cell control group(P<0.05).Expression level of IL-4 in the apoptotic tumor cell group was higher than that in the tumor cell control group(P<0.05).Expression levels of IL-10 and TGF-β were higher and expression level of IL-12 was lower in the apoptotic tumor cell group compared to the other two groups(P<0.05).Conclusion Apoptotic colorectal cancer CT26 cells can inhibit the proliferation and activities of specific CTL,NK cells and macrophages in mice,and affect the normal immune function of mice with colorectal cancer. 【Key words】 Colorectal cancer,CT26 cells,Cytotoxic T lymphocyte,Nature killer cell,Macrophages,Soluble Fas

廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFAA276035)；廣西桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃(20120121-1-13)

孫朝文(1988～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：消化道惡性腫瘤的診治，微創(chuàng)外科。

張廣鈺(1966～)， 男，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：消化道惡性腫瘤的診治，微創(chuàng)外科，E-mail：acrosssky@126.com。

R 735.3

A

0253-4304(2016)10-1337-06

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.01

2016-05-20

2016-07-22)