四氯化碳不同給藥途徑復(fù)合乙醇誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的研究

安禎祥 何遠(yuǎn)利 王敏

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

四氯化碳不同給藥途徑復(fù)合乙醇誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的研究

安禎祥 何遠(yuǎn)利 王敏△

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

目的 比較四氯化碳(CCL4)腹腔注射、皮下注射復(fù)合乙醇灌胃SD大鼠制備肝纖維化動(dòng)物模型，為研究肝纖維化病理機(jī)制、治療提供質(zhì)量穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型。方法 SD大鼠40只隨機(jī)分為四組，每組10只，腹腔注射造模組用50% CCL4橄欖油溶液腹腔注射(體積比：四氯化碳：橄欖油=1∶1)，劑量0.15 mL/100 g， 2次/周； 皮下注射造模組用50% CCL4橄欖油溶液背部皮下注射，劑量0.3 mL/100g， 2次/周，兩組均在實(shí)驗(yàn)第2周開(kāi)始給大鼠用30%乙醇灌胃，劑量1 mL/100g，隔天1次造模。腹腔注射對(duì)照組、皮下注射對(duì)照組，只采用等量橄欖油腹腔注射、皮下注射，生理鹽水灌胃。對(duì)比研究CCL4不同給藥途徑復(fù)合乙醇灌胃建立大鼠肝纖維化模型的效果。結(jié)果 腹腔注射造模組第8周造模成功，造模結(jié)束時(shí)死亡3只，死亡率30%，皮下注射造模組第10周造模成功，造模結(jié)束時(shí)大鼠無(wú)死亡，兩造模組比較，造模時(shí)間比較有顯著性差異(P<0.01)，肝組織纖維化病理分級(jí)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 兩種方法均可成功建立肝纖維化模型，且各有優(yōu)勢(shì)，腹腔注射造模組成模時(shí)間短，有時(shí)間優(yōu)勢(shì)，但是死亡率高，皮下注射造模組成模時(shí)間長(zhǎng)，死亡率低，有成活優(yōu)勢(shì)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇應(yīng)用不同的方法構(gòu)建動(dòng)物模型。

肝纖維化； 四氯化碳； 乙醇； 復(fù)合法； 模型

肝纖維化動(dòng)物模型的建立是開(kāi)展肝纖維化防治研究的重要手段，也是進(jìn)行人體研究的前提[1]。因此建立高效、質(zhì)量穩(wěn)定的肝纖維化動(dòng)物模型顯得尤為重要。CCL4作為一種典型的肝毒物質(zhì)，可強(qiáng)烈地引起肝細(xì)胞壞死，一直被研究者用來(lái)誘發(fā)各種肝損傷模型以闡明化合物肝毒性機(jī)制或肝損傷保護(hù)機(jī)制[2]。CCL4可通過(guò)腹腔注射、皮下注射、灌胃、吸入等途徑造模，單純CCL4造模方法簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、病變典型，但是肝纖維化形成時(shí)間比較長(zhǎng)，死亡率高。本實(shí)驗(yàn)擬就CCL4腹腔注射、皮下注射復(fù)合乙醇灌胃進(jìn)行比較研究，探討這兩種復(fù)合方法各自的優(yōu)劣，為肝纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇造模方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠40只，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量160～200 g，動(dòng)物及飼料均由重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷(xiāo)售有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(渝)2012-005。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。房間通風(fēng)良好，保持清潔，溫度20～25 ℃，空氣濕度50%～70%，用標(biāo)準(zhǔn)大鼠箱飼養(yǎng)，每箱5只，水料充足。

1.2 主要試劑 四氯化碳 (天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)20120506)；橄欖油為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?5%醫(yī)用酒精；4%甲醛；生理鹽水。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒，貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，批號(hào)2001-0367；天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒，貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，批號(hào)2001-0367。透明質(zhì)酸(HA)，批號(hào)：20140709；層粘連蛋白(LN)，批號(hào)：20140720；IV型膠原(IV-C)，批號(hào)：20140816；Ⅲ型前膠原N端肽(PⅢP)，批號(hào)：20140702，鄭州安圖生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 肝纖四項(xiàng)儀器為艾德康A(chǔ)DC CLIA 400，生化儀為德國(guó)西門(mén)子ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀，顯微鏡(奧林巴斯 BX51)，萊卡切片機(jī)RM2235。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 本實(shí)驗(yàn)分兩種方法造模，腹腔注射造模組：CCL4腹腔注射+酒精灌胃，皮下注射造模組：CCL4皮下注射+酒精灌胃。將SD大鼠40只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為四組:腹腔注射造模組10只、腹腔注射對(duì)照組10只、皮下注射造模組10只、皮下注射對(duì)照組10只，腹腔注射造模組用50% CCL4橄欖油溶液腹腔注射(體積比=四氯化碳：橄欖油=1∶1)，劑量0.15 mL/100 g，2次/周，皮下注射組用50% CCL4橄欖油溶液背部皮下注射，劑量0.3 mL/100g，2次/周，并從實(shí)驗(yàn)第2周開(kāi)始給大鼠用30%酒精灌胃，劑量1 mL/100g，隔天1次造模。大鼠每周稱(chēng)體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量增長(zhǎng)而相應(yīng)調(diào)整造模藥物劑量。實(shí)驗(yàn)第8周，從兩造模動(dòng)物中各隨機(jī)抽取1只大鼠處死，作肝纖維化病理學(xué)檢查，按照《病毒性肝炎防治方案》[3]肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷肝纖維化程度，直到有2期以上肝纖維化形成，即確定肝纖維化模型復(fù)制成功，腹腔注射造模第8周即成功，皮下注射組造模第10周成功。

1.4.2 樣品采集 各組大鼠每周稱(chēng)量體質(zhì)量1次，觀察每組體質(zhì)量變化有無(wú)差異、進(jìn)食量、毛色、活動(dòng)狀況等情況。各組于實(shí)驗(yàn)第8周各隨機(jī)處死1只大鼠，行肝纖維化組織病理學(xué)檢測(cè)。腹腔注射造模組第8周確定造模成功，皮下注射造模組第10周造模成功，各于造模結(jié)束后，禁食12 h，測(cè)體質(zhì)量，腹主動(dòng)脈采血，離心取血清，檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及肝纖維化指標(biāo)血清中HA、LN、IV-C、PⅢP含量。脫頸處死大鼠，剖取肝臟，提取肝組織做病理學(xué)檢查。取各組肝臟右葉相同部位組織1塊置入10%福爾馬林固定，作常規(guī)石蠟切片，HE染色，按照《病毒性肝炎防治方案》[3]肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷肝纖維化程度，在光鏡下觀察肝內(nèi)部結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞炎癥程度以及肝纖維化組織增生情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別記錄病理分級(jí)，并取其平均值作為該動(dòng)物肝臟的病理分級(jí)。

2 結(jié) 果

第8周末隨機(jī)處死各組大鼠1只，HE染色發(fā)現(xiàn)腹腔注射造模組纖維化已經(jīng)形成，處死全部腹腔注射造模組大鼠及腹腔注射對(duì)照組大鼠，至第10周隨機(jī)處死剩余各組大鼠各1只，HE染色發(fā)現(xiàn)肝纖維化形成，處死剩余兩組大鼠。造模過(guò)程中皮下注射造模組大鼠無(wú)死亡，腹腔注射造模組共死亡大鼠3只，死亡率約30%，其余兩組大鼠無(wú)死亡。

2.1 各組大鼠一般情況比較 各組大鼠入場(chǎng)時(shí)體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。復(fù)合因素造模兩組大鼠一般情況差，皮毛干澀無(wú)光澤，精神萎靡，行為遲鈍，活動(dòng)和飲食減少，有扎堆現(xiàn)象，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，兩組相比無(wú)顯著性差異。兩組對(duì)照組大鼠一般情況良好，體質(zhì)量增長(zhǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模過(guò)程中，腹腔注射造模組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，前兩次造模中體質(zhì)量呈負(fù)增長(zhǎng)，在前6周，與腹腔對(duì)照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，皮下注射造模組體質(zhì)量普遍有緩慢增長(zhǎng)，低于對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與腹腔注射造模組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量的變化(g，±s)

注：與腹腔注射對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 各組大鼠血清纖維化指標(biāo)、ALT、AST的比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射造模組、皮下注射造模組大鼠血清HA、LN均較各相應(yīng)對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而腹腔注射造模組、皮下注射造模組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IV-C、PⅢP實(shí)驗(yàn)各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶在腹腔注射造模組、皮下注射造模組較對(duì)照組有升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，谷草轉(zhuǎn)氨酶在腹腔注射造模組較其余各組有明顯升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)、ALT、AST檢測(cè)結(jié)果(±s)

注：與腹腔注射對(duì)照組比較，*P<0.01，與皮下注射對(duì)照組比較，**P<0.01。

2.3 兩造模組大鼠肝纖維化時(shí)間比較 腹腔注射造模組第8周造模成功，皮下注射造模組第10周造模成功，兩組造模組比較，造模時(shí)間有顯著性差異(P<0.01)。

2.4 各組大鼠肝組織纖維化病理學(xué)比較 兩組對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，以中央靜脈為中心放射狀排列，無(wú)假小葉形成。造模兩組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞明顯壞死，纖維組織增生，多數(shù)形成假小葉，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肝小葉中有壞死S2、S3、S4期情況：腹腔造模組分別為1、4、2，皮下造模組分別為3、5、1，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

肝纖維化模型主要有CCL4、二甲基亞硝胺、硫代乙酰胺、異種血清、乙醇、膽總管結(jié)扎等單因素造模和復(fù)合因素造模。單因素造模時(shí)間長(zhǎng)，死亡率高，形成率低，病理分期不明顯。復(fù)合因素造?？煽s短造模時(shí)間，復(fù)合造模因素可產(chǎn)生協(xié)同作用，減少單一因素的強(qiáng)度，降低死亡率，增加成功率。CCL4是一種選擇性的肝毒性物質(zhì)，本研究使用橄欖油作為溶劑，按1/1體積比例能很好地溶解，方便、易于獲得，是一種好的實(shí)驗(yàn)方法。CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型在病理機(jī)制的某些方面與人肝纖維化相似，如肝細(xì)胞壞死后的再生、中央靜脈周?chē)渭?xì)胞壞死及纖維組織增生，與人慢性肝病進(jìn)展為肝硬化相似，但是CCL4的肝毒性作用劇烈，如劑量掌握不當(dāng)，死亡率較高，且停止給藥后有一定自然恢復(fù)趨勢(shì)的缺點(diǎn)。CCL4給藥方式國(guó)內(nèi)外存在差異，國(guó)外主要采用腹腔注射， 國(guó)內(nèi)主要采用皮下注射， 兩種給藥方式造模動(dòng)物的死亡率均較高[4]。CCL4經(jīng)門(mén)靜脈到達(dá)肝臟，在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素氧化酶P450代謝生成大量的自由基，攻擊肝細(xì)胞，使肝細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，CCL4反復(fù)破壞肝細(xì)胞， 結(jié)果造成肝臟的炎癥遷延，不斷形成纖維化。乙醇在肝臟通過(guò)乙醇脫氫酶( ADH) 和微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)( MEOS) 進(jìn)行氧化代謝產(chǎn)生毒性代謝產(chǎn)物乙醛，通過(guò)肝細(xì)胞損害、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)、抑制三羧酸循環(huán)等多種途徑損害肝臟的結(jié)構(gòu)和功能，刺激膠原蛋白的合成，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[5]。乙醇能誘導(dǎo)P450活性從而增加CCL4的肝毒性，在乙醇致肝脂肪變作用下用CCL4能加速肝細(xì)胞壞死，縮短造模時(shí)間[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射、皮下注射復(fù)合乙醇造模均可誘發(fā)大鼠肝纖維化的形成，腹腔注射復(fù)合乙醇灌胃成模時(shí)間為第8周，較皮下注射復(fù)合乙醇造模提前兩周，有時(shí)間優(yōu)勢(shì)，雖然腹腔注射CCL4劑量小，但死亡率高(30%)，考慮原因系腹腔注射后腹膜吸收面積大，CCL4一次性進(jìn)入血液循環(huán)量大，導(dǎo)致肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死，發(fā)生急性肝衰竭而死亡，更多的顯示為急性肝功能損傷，大鼠只要能耐受前期實(shí)驗(yàn)，后期就可發(fā)生肝纖維化，皮下注射雖然劑量偏大，但是吸收慢，對(duì)肝臟毒性相對(duì)偏小，大鼠能耐受，表現(xiàn)慢性肝功能損害，所以形成肝纖維化時(shí)間相對(duì)偏長(zhǎng)，死亡率低是其優(yōu)勢(shì)。從對(duì)轉(zhuǎn)氨酶、HA、LN的檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，腹腔注射復(fù)合乙醇造模組均較對(duì)其余各組有升高，亦支持上述結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：造模兩組大鼠肝內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂，均形成肝纖維化，兩種方法均能成功建立肝纖維化動(dòng)物模型。腹腔注射復(fù)合法造模時(shí)間為第8周，較皮下注射造模組縮短時(shí)間兩周，有時(shí)間優(yōu)勢(shì)，但死亡率高達(dá)30%，皮下注射復(fù)合法造模時(shí)間長(zhǎng)，死亡率低是其優(yōu)勢(shì)。復(fù)合因素中的CCL4可模擬氧化損傷，乙醇模擬酒精中毒，均能損傷肝細(xì)胞，損傷的肝臟可進(jìn)一步發(fā)生纖維化，較單因素模型具普遍性和現(xiàn)實(shí)意義，與肝纖維化的形成機(jī)制貼近，能更準(zhǔn)確模擬自然生活環(huán)境，適用于抗肝纖維化的作用機(jī)制研究，在實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇應(yīng)用。

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Preparation of hepatic fibrosis rat models induced by carbon tetrachloride administration in different ways combined with ethanol lavage

AnZhenxiang,HeYuanli,WangMin.

FirstAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,China

Objective To provide reliable hepatic fibrosis rat models for the research on the pathologic mechanism and the treatment of hepatic fibrosis through the comparison of the models induced by gastric administration of ethanol combined with different CCL4 injection ways (intraperitoneally and subcutaneously respectively). Methods 40 SD rats were randomly divided into 4 groups (10 rats in each group): intraperitoneally-injected group, injection of 50% of CCL4and olive oil (volume ratio, CCL4∶ Olive Oil = 1∶1 ) at the dosage of 0.15 mL/100g, twice per week; subcutaneously-injected group, injection of 50% of CCL4and olive oil under the dorsal tissue at the dosage of 0.3 mL/100g, twice per week. Both of the two groups were gastrically administrated with 30% of ethanol every two days at the dosage of 1 mL/100g in the second week of the experiment; the other two control groups were only injected the same amount of olive oil intraperitoneally and subutaneously respectively with gastric administration of normal saline. Then the models prepared by different administration of CCL4with ethanol were compared. Results Intraperitoneally-injected group was successfully modeled in 8 weeks with the death of three rats (the mortality rate was 30%), while subcutaneously-injected group was modeled in 10 weeks without the death of any rat. There was significant difference in modeling time (P<0.01) but no significant difference in pathological grading on hepatic fibrosis(P>0.05) between the two groups.Conclusion Both the two different administration ways of CCL4could successfully create hepatic fibrosis rat models. Intraperitoneal injection has an advantage in modeling time but its mortality rate is a bit high. However, subcutaneous injection has the advantage in mortality rate but its modeling time is longer. Thus, we could select different CCL4administration ways according to different experimental purpose.

Hepatic fibrosis; Carbon tetrachloride (CCL4); Ethanol; Composite method; Model

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460726)；貴州省教育廳自然科學(xué)研究招標(biāo)資助項(xiàng)目(合同編號(hào)： 黔教合KY字(2012)(41)號(hào))；貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展資助項(xiàng)目(合同編號(hào)： 黔科合SY字(2012)3146)

R-332,R575

A

1000-744X(2016)01-0006-03

2015-10-02)

△通信作者