兔脂肪干細胞與軟骨細胞微球共培養(yǎng)成軟骨分化最適誘導比例的實驗研究

趙明璨 楊 午 劉 暢，2*

1(吉林大學口腔醫(yī)學院，長春 130021)2(廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，廣州口腔病研究所，口腔醫(yī)學重點實驗室， 廣州 510140)

兔脂肪干細胞與軟骨細胞微球共培養(yǎng)成軟骨分化最適誘導比例的實驗研究

趙明璨1楊 午1劉 暢1，2*

1(吉林大學口腔醫(yī)學院，長春 130021)2(廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，廣州口腔病研究所，口腔醫(yī)學重點實驗室， 廣州 510140)

通過間接共培養(yǎng)ADSC與軟骨細胞微球，得出使ADSC發(fā)生軟骨向分化的最佳比例。體外分離培養(yǎng)新西蘭大白兔ADSC和軟骨細胞，制成微球分置于Tranwell上下室，實驗分為陽性對照組，陰性對照組，生長因子對照組及不同比例(0.5∶1; 1∶1; 1∶2; 1∶3; 1∶5;1∶7)的ADSC和軟骨細胞共培養(yǎng)組，培養(yǎng)28天后分別行組織形態(tài)學觀察，GAG、COL-Ⅱ和COL-Ⅹ的定性定量檢測。阿利新藍-核固紅染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示比例為0.5∶1和1∶1的陽性較弱，而Ⅹ型膠原在生長因子對照組的表達最為強烈。DMMB法顯示總GAG含量在共培養(yǎng)組較陰性對照組均有所增加(P<0.05)，且增加量與軟骨細胞的比例呈正相關，但是在ADSC：AC比例達到1∶5之后有所下降。OHP檢測總膠原蛋白的變化同上，且1∶5組中沉積的膠原量比陰性對照組高出7.3倍。能夠使ADSCs最大程度的表達軟骨特異性細胞外基質，同時使COL-Ⅹ等軟骨肥大標志無明顯上調的ADSC與軟骨細胞的比例為1∶5，共培養(yǎng)誘導較生長因子能夠抑制ADSC軟骨向分化后的肥大問題。

脂肪干細胞；軟骨細胞；共培養(yǎng)；生長因子

引言

軟骨一旦損傷便無法自行修復，但組織工程的興起為解決這一難題提供了新的方法。脂肪干細胞(adipose-derived stem cell，ADSC)因來源豐富、取材方便等優(yōu)點而成為軟骨組織工程理想的種子細胞[1]，然而并沒有一種公認高效的誘導方法[2]。傳統(tǒng)誘導用到大量的生長因子，如轉化生長因子β家族(transforming growth factor-βs，TGF-βs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族(bone morphogenetic proteins，BMPs)等，費用高、半衰期短，而且避免不了在ADSC發(fā)生向穩(wěn)定軟骨分化的同時發(fā)生早期肥大[3-5]。已知正常關節(jié)軟骨微環(huán)境可以誘導ADSC向軟骨細胞分化[6]，因此近年來利用ADSC和軟骨細胞共培養(yǎng)的方法誘導ADSC向軟骨分化的研究越來越多[7-8]，但共培養(yǎng)的機制及兩種細胞的最佳比例有待進一步探討。

1 材料和方法

1.1 材料

健康新西蘭大白兔，體重約250 g(吉林大學動物中心；Transwells插入裝置(美國 Corning)；L-DMEM 培養(yǎng)基、H-DMEM、DMEM-F12 (美國 Hyclone)；胰蛋白酶、I型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、透明質酸酶、青/鏈霉素、兩性霉素B、PicoGreen dsDNA定量試劑盒(美國Invitrogen)；氯胺T、P-DMBA、4-羥基脯氨酸(美國 Sigma)；胰島素、ITS、DMB、木瓜蛋白酶消化液(美國 Gibco)；阿利新藍、TGF-β3、 BMP-6 (美國 Cyagen)；兔二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB染色液(邁新 福州)；硫酸軟骨素(美國Calbiochem)。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干細胞的分離與培養(yǎng)

2～4周齡健康新西蘭大白兔，取皮下脂肪用0.1%的I型膠原酶消化60 min；過濾，離心(1 000 r/min)，10%FBS的L-DMEM重懸細胞，接種，培養(yǎng)于37℃、5%CO2的孵箱；24 h后半量換液，之后3天換液一次。待細胞達90%融合時傳代，0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化，以5×105cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，細胞傳至第3代備用。

1.2.2 脂肪干細胞的鑒定

取第3代ADSC，以每孔2×104個細胞接種到24孔培養(yǎng)板上，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞達90%融合時，分別換為成脂誘導培養(yǎng)基(H-DMEM，10%FBS，1×10-6M 地塞米松，10 μg/mL胰島素，50 μg/L-抗壞血栓，0.5 mM的IBMX，0.2 mM吲哚美辛，青/鏈霉素各100 U/mL)及成骨誘導培養(yǎng)基(H-DMEM，10%FBS，1×10-8M地塞米松，L-抗壞血栓50 μg/mL，β-磷酸甘油鈉10 mM，青/鏈霉素100 U/mL)，行成脂及成骨誘導。3周后分別行油紅O染色及茜素紅-Tris-HCl染色，倒置顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 軟骨細胞的分離與培養(yǎng)

2～4周齡健康新西蘭大白兔無菌處死，取關節(jié)軟骨切成1 mm×1 mm小塊，0.2%Ⅱ型膠原酶消化16 h；過濾后1 200 r/min離心5 min；10%FBS的DMEM/F12重懸細胞獲得關節(jié)軟骨細胞(ACs)，在37℃、5%CO2的標準孵箱培養(yǎng)，2 d換液一次；待細胞達90%融合時傳代，以1～5×105cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶，待細胞鋪滿瓶底后備用。

1.2.4 脂肪干細胞和軟骨細胞微球的制作

取第3代ADSC和第1代AC，消化后移入15 mL離心管內，調整細胞數(shù)為5×l05個，1 200 r/min離心5 min制成pellets。加入基礎培養(yǎng)基(L-DMEM，10%FBS，100 U/ mL青/鏈霉素)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3 d，使細胞團聚集，依照此法制成8個ADSC微球和19個軟骨細胞微球。同時，制成一個細胞數(shù)為2.5×105個的AC球，方法同上。

1.2.5 實驗模型的建立及分組

將ADSC和AC微球分置于Tranwell上下層。實驗共分為9組(n=3)：#1為單純AC球，用普通培養(yǎng)基(H-DMEM，1% ITS，50 μg/mL L-抗壞血栓，40 μg/mL L-脯氨酸，青/鏈霉素100 U/ mL，2.5 μg/mL兩性霉素B)培養(yǎng)；#2為單純上層ADSC球的陰性對照組(普通培養(yǎng)基)；#3為單純ADSC球，用誘導培養(yǎng)基(普通培養(yǎng)基+1×10-7M 地塞米松+10 ng/mL TGF- β3+10 ng/mL BMP-6)培養(yǎng)，為生長因子對照組。組4到組9(#4～#9)為實驗組，將ADSC球和AC球以不同比例(0.5∶1; 1∶1; 1∶2; 1∶3;1∶5;1∶7)共培養(yǎng)(普通培養(yǎng)基)。將以上9組分置于24孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液一次。培養(yǎng)28 d后，取出ADSC微球檢測。

1.3 觀測指標

1.3.1 大體觀察

觀察誘導后各組ADSC微球的大小、形狀、色澤、質地的變化，比較各組間標本濕重的差異。

1.3.2 組織學觀察

取各組誘導后的ADSC微球，固定后包埋切片。

1)HE染色觀察微球結構，包括組織的連續(xù)性、密度及軟骨陷窩形成情況。

2)阿利新藍-核固紅雙染色，觀察軟骨特異性細胞外基質GAG的表達情況。

3)采用免疫組化染色法，觀察誘導后ADSC微球Ⅱ型膠原的表達：切片脫蠟脫水，4 mg/mL透明質酸酶(pH值為5.5)消化60 min(37℃)，內源性過氧化物酶室溫下處理10 min，滴加濃度為1∶80的Ⅱ型膠原一抗，4℃過夜，約20 h后用酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物孵育10 min；DAB顯色，蘇木素復染，自來水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；倒置相差，顯微鏡觀察。

4)采用免疫組化染色法，鑒定誘導后ADSC微球Ⅹ型膠原的表達：切片脫蠟脫水， 0.25%的胰酶(含1 mM EDTA)消化3 min(37℃)，內源性過氧化物酶處理10 min，滴加濃度為1∶200的Ⅹ型膠原一抗，4℃過夜，用酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物孵育10 min，顯色、復染、脫水、透明、封片、觀察。

1.3.3 DMB染色法定量檢測GAG

培養(yǎng)28 d后取出細胞微球，木瓜蛋白酶消化16 h(65℃)；用PicoGreen dsDNA定量試劑盒檢測微球的DNA濃度，用做DMB檢測值的標準化；在96孔板中加入40 μL梯度濃度(0～35 μg/mL)的C-4-S標準液和樣品液，每孔加入125 μL DMB染液，酶標儀測量595 nm處的吸光度值(OD)，繪制濃度標準曲線，計算樣品所含GAG濃度。

1.3.4 OHP法定量檢測總膠原

培養(yǎng)28d后取出細胞微球，木瓜蛋白酶消化細胞微球(65℃；16 h)，用PicoGreen dsDNA定量試劑盒做OHP檢測值的標準化；分別將標準液、樣品50 μL及12N HCl(37%)50 μL加入2 mL耐高溫離心管中，高壓蒸汽滅菌鍋中(120℃，15～20 kg/cm2)水解30 min；96孔板中加入50 μL梯度濃度的OHP標準液和樣品液及50 μL 的氯胺-T溶液混勻，室溫靜置15 min后加入p-DMBA顯色液，37℃反應30 min；使用酶標儀測量550 nm處的吸光度值(OD)，繪制濃度標準曲線，計算樣品所含羥基脯氨酸濃度，并以7.46∶1的比例將其轉化為II型膠原濃度[9]。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 脂肪干細胞多向分化潛能鑒定結果

ADSC經成脂誘導5 d后細胞逐漸變圓，增殖停止，細胞內出現(xiàn)小脂滴樣空泡，隨后空泡逐漸增多并互相融合。油紅0染色脂滴為紅色(見圖1(a))；ADSC經成骨誘導后細胞增大變?yōu)槎嘟切危?周左右可見折光度高的晶瑩似鈣基質結節(jié)物質出現(xiàn)，細胞呈重疊融合生長態(tài)勢。誘導 21 d后，茜素紅-Tris-Hcl染色將沉積明顯的鈣結節(jié)染成深粉紅色(見圖1(b))。

圖1 脂肪干細胞多向分化潛能鑒定結果。(a)成脂誘導油紅0染色(100×)；(b)成骨誘導茜素紅染色(100×)Fig.1 The Result of multilineage differentiation of ADSC. (a)Osteogenic measured by oil red o staining；(b) Adipogenic measured by alizarin red staining.

2.2 各組微球大體觀察及濕重

體外共培養(yǎng)4周后，各組細胞微球均聚集成類圓形組織塊(見圖2)。#1為半透明的光滑結構，體積較大，色乳白，質地稍韌有彈性；#2微球團塊呈淡黃色不透明狀態(tài)，質地較軟無彈性。#3與共培養(yǎng)組(#4 ～ #9)為白色稍有硬度的低彈團塊，組間肉眼差異較小，但從ADSC：AC為1∶3的實驗組開始，ADSC微球的韌度較低，細胞比例組的微球韌度有明顯增加。為了驗證大體結果，稱量各ADSC細胞微球濕重，通過測量進一步量化結果(見圖3)。

圖2 各組細胞微球大體觀察Fig.2 The gross view of each pellets

圖3 各組細胞微球濕重測量Fig.3 The wet weight of each pellets

2.3 組織學觀察

2.3.1 HE染色

圖4為培養(yǎng)28 d后各組HE染色結果，結果顯示軟骨細胞陽性對照組(見圖4(a))有大量軟骨陷窩形成；高軟骨比例的共培養(yǎng)組(1∶3，1∶5，1∶7)可見零星軟骨陷窩(見圖4(g)～(f))。ADSC陰性對照組(見圖4(b))未見軟骨陷窩形成。同時，除了軟骨細胞陽性對照組，所有實驗組和對照組的ADSC微球周圍一圈都有不同程度的空泡，而在微球中央部空泡則很少發(fā)生，在生長因子陽性對照組最多(見圖4(c))。

圖4 培養(yǎng)28 d后各組HE染色結果 (200×)。(a)～(i) #1～#9Fig.4 The result of HE staining after 28 days of culture 200×. (a)～(i) #1～#9

2.3.2 阿利新藍-核固紅染色

圖5為培養(yǎng)28 d后各組阿利新藍-核固紅染色結果，除了ADSC陰性對照組(見圖5(b))，各實驗組及對照組阿利新藍染色均為陽性；低軟骨細胞比例共培養(yǎng)組(0.5∶1與1∶1)與高軟骨細胞比例共培養(yǎng)組(1∶5，1∶7)和陽性對照組相比，藍色著色較淺；相比高軟骨細胞比例共培養(yǎng)組(1∶3，1∶5，1∶7)和生長因子陽性對照組(見圖5(c))，藍色的深淺差異不大。

圖5 培養(yǎng)28 d后各組阿利新藍-核固紅染色結果(200×)。(a)～(i) #1～#9Fig.5 The result of toluidine blue- nuclear fast red staining after 28 days of culture 200×. (a)～(i) #1～#9

2.3.3 II型膠原免疫組化染色

圖6為培養(yǎng)28 d后各組II型膠原免疫組化染色結果，除了ADSC陰性對照組(見圖6(b))外，其余各組均可見到棕黃色沉淀；ADSC-AC 比為1∶5(見圖6(h))，達到了生長因子陽性對照組(見圖6(c))的著色水平；低軟骨細胞比例組(見圖6(d)、(e))與高濃度軟骨細胞共培養(yǎng)組(見圖6(g)、(f))相比，Ⅱ型膠原著色較淺。

圖6 培養(yǎng)28 d后各組Ⅱ型膠原免疫組化染色結果 (200×)。(a)～(i) #1～#9Fig.6 The result of immunofluorescence staining of collagen type Ⅱ after 28 days of culture 200×. (a)～(i) #1～#9

2.3.4 Ⅹ型膠原免疫組化染色

圖7為培養(yǎng)28 d后各組Ⅹ型膠原免疫組化染色結果，結果顯示各共培養(yǎng)組(見圖7(d)～(i))及生長因子陽性對照組(見圖7(c))均可見到棕黃色區(qū)域。其中，以生長因子陽性對照組的顏色最深，共培養(yǎng)各組Ⅹ型膠原免疫組化著色均較淺。

圖7 培養(yǎng)28 d后各組Ⅹ型膠原免疫組化染色結果 (200×)。(a)～(i) #1～#9 Fig.7 The result of immunofluorescence staining of collagen typeⅩafter 28 days of culture 200×. (a)～(i) #1～#9

2.4 GAG定量

經過28 d共培養(yǎng)，ADSC微球分泌大量的GAG，與陰性對照組形成鮮明對比(P<0.05)。然而，ADSC-AC比為1∶5和1∶7組中，GAG的沉積量比1∶1組高出將近140%。實驗結果還表明，共培養(yǎng)時相對較高的軟骨細胞比例組(1∶3，1∶5和1∶7)GAG的沉積量甚至達到了生長因子對照組的水平，但組間無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見圖8)。

圖8 各組細胞微球GAG定量結果Fig.8 The GAG quantitative result of each pellets

2.5 總膠原定量

共培養(yǎng)28 d后，軟骨細胞比例從1∶1到1∶7的各共培養(yǎng)組ADSC微球的總膠原量較ADSC陰性對照組(#2)均有所增加，1∶5組中沉積的膠原量最高，比陰性對照組高出7.3倍，且總膠原量占到微球濕重的1.58%。用濕重標準化該測量值發(fā)現(xiàn)，在1∶3組、1∶5組、1∶7共培養(yǎng)組和生長因子陽性對照組，ADSC微球單位質量產生膠原量無顯著差異(P>0.05)，但均較其余共培養(yǎng)組高(見圖9)。

圖9 各組細胞微球總膠原定量結果Fig.9 The total collagen quantitative result ofeach pellets

3 討論

由疾病等原因引起關節(jié)軟骨損傷的修復一直是醫(yī)學界面臨的難題。以種子細胞為依托的組織工程的出現(xiàn)為軟骨再生提供了新的方法，其中骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)和ADSC的研究最為廣泛。雖然有研究[10]認為，在TGF-β3與BMP-2存在時，BMSC較ADSC有更強的成軟骨潛能，但對于相對缺血、缺氧的關節(jié)軟骨微環(huán)境而言，ADSC更能耐受缺氧及無血清等引起的凋亡，同時來源廣泛及含量豐富等優(yōu)勢，使ADSC的研究更具臨床價值。

三維的立體環(huán)境對構建組織工程軟骨非常重要[11]。Yoon等認為，ADSC三維培養(yǎng)較單層培養(yǎng)成軟骨能力增強的原因可能是3D微環(huán)境增加了細胞間的交流，同時輕度缺氧激活了p-p38、AKT和 HIF-1a信號通路，從而增強了SOX-9表達[12]。本OHP結果顯示ADSC微球分泌大量的GAG和膠原，與陰性對照組形成對比(P<0.05)。實驗中還發(fā)現(xiàn)，所有實驗組(AC陽性對照組除外)的微球周圍均有不同程度的空泡，而在微球中心則很少發(fā)生這種情況。這也許是微球中心缺氧微環(huán)境有利于誘導，而周圍暴露于正常氧環(huán)境，使得誘導后的ADSC肥大進而凋亡。筆者的猜想來自于Ville等的結論[13]。

關于MSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)在體外構建軟骨組織的研究已經很多[14-17]，有單層混合共培養(yǎng)[14]、細胞離心微球共培養(yǎng)[15]和三維支架共培養(yǎng)[16]。因為這些研究中兩種細胞群有直接的細胞接觸，所以難以區(qū)分檢測到的軟骨特異性信號的起源。此外，以往大多數(shù)共培養(yǎng)實驗依賴TGF-β以確保MSC的軟骨向分化[15-16]，因此對單純軟骨細胞能否驅動MSCs的分化并不明確。而最近的一項研究表明，在沒有外源性誘導因子的情況下，來源于骨關節(jié)炎患者的ACs可以單獨誘導MSCs發(fā)生軟骨向分化[17]，筆者的實驗也證明了這點。建立MSCs與軟骨細胞的最佳比例，是構建高質量組織工程的關鍵。在共培養(yǎng)時，不同的細胞來源以及實驗條件都可能導致不同的最佳比率[18]。將人類髓核(NPs)細胞與人BMSCs直接共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)兩者比例為3∶1時軟骨特異性標志物表達最多，而進行間接共培養(yǎng)時比例不同則無差異。Fischer等共培養(yǎng)ACs與BMSCs時發(fā)現(xiàn)，當兩者比例為2∶1時，COL-Ⅱ的基因比例最高[15]。Yang等發(fā)現(xiàn)，在沒有細胞直接接觸的情況下，當ACs/MSCs為63∶1時，共培養(yǎng)的MSCs在細胞形態(tài)、行為和表型最接近AC[19]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，微球Transwell間接共培養(yǎng)ADSC與AC時，發(fā)生軟骨向分化的最佳比例為1∶5。而隨著AC比例的增加，軟骨特異性細胞外基質并未接著升高，可能是因為比例為5∶1時，AC分泌的可溶性因子的量已經達到了可以觸發(fā)ADSC發(fā)生有效軟骨向分化的劑量。在這種情況下，繼續(xù)增加AC的比例顯得意義不大，而且較大的細胞量還可能影響營養(yǎng)物質的供給。

作為軟骨細胞最特異的表面標志，GAG及Ⅱ型膠原的表達水平反映了ADSC發(fā)生軟骨向分化的情況，而隨著未成熟的軟骨細胞分化成肥大軟骨細胞并分泌Ⅹ型膠原，也意味著軟骨內成骨的開始[20]。傳統(tǒng)應用ADSC作為種子細胞時，經常添加生長因子誘導其軟骨向分化。然而，最完美的生長因子及作用機制、甚至有效劑量都還處于探索階段。最大的問題是，這種培養(yǎng)模式在使軟骨特異性細胞外基質表達上調的同時，也上調了X型膠原等軟骨肥大的標志，使形成的新生軟骨短時間就發(fā)生鈣化、微骨化、纖維化以及微血管浸潤，不能形成穩(wěn)定的透明軟骨[21]。研究[22]證實，將軟骨細胞與MSC共培養(yǎng)，可以抑制誘導后干細胞的早期肥大問題[23]。本實驗設置了生長因子對照組(10ng/ml TGF-β3+10ng/ml BMP-6)，想觀察所謂最好的成軟骨誘導劑[3]與最適比例的共培養(yǎng)組相比，成軟骨效能有何差異。實驗結果表明，AC-ADSC 比為5∶1時，單位質量所產生的GAG及總膠原的含量上甚至達到了生長因子誘導組的水平(P>0.05)，但是在Ⅹ型膠原表達方面卻明顯降低，筆者對Ⅹ型膠原基因的PCR檢測結果也證實了這點(數(shù)據沒有顯示)。研究證實，共培養(yǎng)使ADSC發(fā)生軟骨向分化的同時，還能抑制誘導后干細胞的早期肥大問題，是一種更為高效簡捷的誘導方法。

4 結論

結果顯示，能夠使ADSC最大程度地表達軟骨特異性細胞外基質，同時使COL-Ⅹ等軟骨肥大標志無明顯上調的ADSC與AC的比例為1∶5，同時證實共培養(yǎng)誘導較生長因子能夠抑制ADSC軟骨向分化后的肥大問題。然而，實驗僅檢測了誘導后ADSC的數(shù)據，沒有對AC微球的變化進行分析，這是一個不完善的地方。同時，更高比例的軟骨細胞(AC-ADSC=7∶1)共培養(yǎng)時軟骨特異性細胞外基質沒有繼續(xù)增加的具體原因還有待進一步探索，也許在通過更全面的定性和定量檢測共培養(yǎng)液中生長因子種類和含量后可以給出一些答案，但是實際上的可操作性也是有限的，這涉及到進一步的mRNA的內容，探討共培養(yǎng)的更深層次的分子機制是下一步的研究內容。

(致謝 感謝吉林大學第一醫(yī)院轉化所王平教授對實驗操作所做的指導，感謝吉林大學口腔醫(yī)院孫宏晨教授對實驗設計的指正。)

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An Experimental Study on Optimal Ratio of Chondrogenesis in Pellet Co-Culture of Adipose-Derived Stem Cells and Chondrocytes Differentiation in Rabbits

Zhao Mingcan1Yang Wu1Liu Chang1，2*

1(SchoolofStomatology,JilinUniversity,Changchun130021,China)2(LaboratoryofOralMedicine,GuangzhouInstituteofOralDisease,StomatologyHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510140,China)

The aim of this work was to figure out the optimal ratio of adipose-derived stem cells (ADSCs) to articular chondrocyte (AC) (ADSCs/AC)in the chondrogenesis effect through indirectly co-culture pellets of ADSCs and AC. Isolate and cultivate ADSC and chondrocytes to form pellets that were placed into upper and lower layers of tranwell system. Experiments included positive control group, negative control group, growth factor control groupand ADSC and chondrocytes pellets in different ratios (0.5∶1; 1∶1; 1∶2; 1∶3; 1∶5; 1∶7) groups. After 28 days of culture,histological morphology, protein level of GAG, COL-II and COL-X were examined. Results: Toluidine blue staining and collagen typeII displayed 0.5∶1 and 1∶1 groups showed weak positive staining. The collagen X in the growth factor group showed the most strong positive staining; DMMB showed that the total GAG content in co-culture groups increased when compared with that of the control group (P<0.05),while decreased whenthe ratio of ADSC/AC reached 1∶5. Results obtained from OHP measurements howed the variation tendency of total collagen was similar to the change tendency of GAG. Conclusions: The optimal ratio that made adipose derived stem cells expressed the maximum cartilage specific extracellular matrix was 1∶5. The co-culture inhibited the hypertrophic problem when compared with growth factor induction.

adipose-derived stem cell；chondrocyte；co-culture；growth factor

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 05.009

2015-11-06， 錄用日期:2016-07-05

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140204022SF)；廣東省教育廳省級高等教育“創(chuàng)新強校工程”專項資金(B16036087)；長春市重大科技攻關項目 (13KG45)

R318

A

0258-8021(2016) 05-0570-07

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: lcwztt@gmail.com