細(xì)菌肥料Agr、PfPt和Mic對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗生長(zhǎng)和次生代謝物含量的影響

邵國(guó)棟, 艾娟娟, 孫啟武

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100091)

細(xì)菌肥料Agr、PfPt和Mic對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗生長(zhǎng)和次生代謝物含量的影響

邵國(guó)棟, 艾娟娟, 孫啟武①

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100091)

運(yùn)用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，在田間栽培條件下，對(duì)曼地亞紅豆杉(TaxusmediaRehder)1年生幼苗施用3種細(xì)菌肥料〔放射性土壤桿菌肥料(Agr)、熒光假單胞菌肥料(PfPt)和微球菌肥料(Mic)，濃度為2×107CFU·mL-1，施肥2次〕，對(duì)翌年生長(zhǎng)期幼苗株高和冠幅的增長(zhǎng)量變化以及枝葉中4種次生代謝物〔紫杉醇、三尖杉寧堿、10-去乙酰紫杉醇和10-去乙?；涂ㄍあ?10-DAB Ⅲ)〕含量進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：施用Agr、Mic和PfPt后的翌年11月份，曼地亞紅豆杉幼苗株高和冠幅的增長(zhǎng)量均大于CK(不施肥，對(duì)照)組，其中，施用PfPt后幼苗株高增長(zhǎng)量最大，且顯著高于CK組(P<0.05)；施用Mic后幼苗的冠幅增長(zhǎng)量最大，但與CK組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。施用Agr、Mic和PfPt后枝葉中紫杉醇、三尖杉寧堿和10-DAB Ⅲ含量均顯著高于CK組，其中，施用Mic后紫杉醇含量最高，施用PfPt后三尖杉寧堿和10-DAB Ⅲ含量最高，且總體上顯著高于其他處理組；施用Mic后10-去乙酰紫杉醇含量最高，且顯著高于CK組及其他處理組，而施用Agr和PfPt后10-去乙酰紫杉醇含量與CK組無(wú)顯著差異。研究結(jié)果顯示：施用Agr、Mic和PfPt均對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗生長(zhǎng)以及枝葉中次生代謝物積累有一定的促進(jìn)作用，但不同細(xì)菌肥料的促進(jìn)效應(yīng)存在差異，因此，在曼地亞紅豆杉的栽培過(guò)程中應(yīng)根據(jù)不同需求選擇適宜的細(xì)菌肥料。

細(xì)菌肥料; 曼地亞紅豆杉; 生長(zhǎng); 次生代謝物; 紫杉醇

曼地亞紅豆杉(TaxusmediaRehder)為紅豆杉屬(TaxusLinn.)植物，是以東北紅豆杉(T.cuspidataSieb. et Zucc.)為母本、歐洲紅豆杉(T.baccataLinn.)為父本的天然雜交種[1]。曼地亞紅豆杉多為常綠灌木，根系發(fā)達(dá)、枝葉茂盛、生長(zhǎng)迅速，具有耐寒和耐修剪等特點(diǎn)，在中國(guó)大部分地區(qū)均可種植[2]。曼地亞紅豆杉全株均可提取紫杉醇[3]，且紫杉醇含量高并穩(wěn)定[4]，從其植株中提取的紫杉醇對(duì)于治療乳腺癌、卵巢癌和非小葉肺癌等多種癌癥有顯著療效[5-8]，近年來(lái)關(guān)于其次生代謝物10-去乙酰紫杉醇、10-去乙?；涂ㄍあ?10-DAB Ⅲ)和三尖杉寧堿的潛在藥用價(jià)值已有一定的研究[9-10]，因此，采取合理的栽培措施以提高曼地亞紅豆杉植株中紫杉醇等次生代謝物的含量與產(chǎn)量，對(duì)于曼地亞紅豆杉植物資源的高效利用具有重要意義。

目前，有關(guān)曼地亞紅豆杉的研究主要集中在栽培措施和繁育技術(shù)[1,11-14]、紫杉醇提取方法及測(cè)定[15-16]等方面，對(duì)影響其植株中紫杉醇等次生代謝物含量因素的研究也僅限于產(chǎn)地[17]、林齡與采收季節(jié)[18-19]、營(yíng)養(yǎng)脅迫[20]等方面。李乃偉等[21]認(rèn)為，合理施肥可以促進(jìn)曼地亞紅豆杉生長(zhǎng)，提高紫杉醇含量。大面積使用化學(xué)肥料不僅導(dǎo)致環(huán)境污染，也不利于土壤性質(zhì)的改良[22]。細(xì)菌肥料作為一種使用方便、用量少、無(wú)污染且能培肥地力的新型肥料[23]，近些年在恢復(fù)地力、增加林木產(chǎn)量以及提高林產(chǎn)品質(zhì)量[24-27]等方面已有較多的研究報(bào)道。

作者以曼地亞紅豆杉幼苗為研究對(duì)象，采用大田栽培的方式，研究放射性土壤桿菌肥料(Agr)、熒光假單胞菌肥料(PfPt)和微球菌肥料(Mic)3種細(xì)菌肥料對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗生長(zhǎng)以及紫杉醇、三尖杉寧堿、10-去乙酰紫杉醇和10-DABⅢ含量的影響，以期為曼地亞紅豆杉藥用原料林的培育及合理栽培措施的制定提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地概況

實(shí)驗(yàn)地位于廣東省韶關(guān)市乳源瑤族自治縣洛陽(yáng)鎮(zhèn)，地理坐標(biāo)為北緯24°24′36″、東經(jīng)113°03′19″，海拔700～1 200 m，平均海拔800 m；為亞熱帶季風(fēng)氣候，氣候特點(diǎn)為冬暖夏涼、空氣相對(duì)濕度大，年平均氣溫16.5 ℃，月平均最高氣溫29.9 ℃(7月份)，月平均最低氣溫9.4 ℃(1月份)，平均年降雨量約2 800 mm。土壤濕潤(rùn)肥沃，主要為山地紅壤；全鎮(zhèn)林地總面積28 666.69 hm2，森林覆蓋率85%；地帶性植被為亞熱帶常綠闊葉林。

1.2 材料

供試材料為曼地亞紅豆杉品種‘Hickii’的1年生扦插苗，均來(lái)自廣東省韶關(guān)市乳源瑤族自治縣紅豆杉種植基地。供試細(xì)菌肥料分別為放射性土壤桿菌肥料(Agr)、熒光假單胞菌肥料(PfPt)和微球菌肥料(Mic)，濃度均為2×109CFU·mL-1，由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所森林土壤研究室自行研制。

主要儀器：DFY-250A搖擺式多功能高速粉碎機(jī)(上海谷寧儀器有限公司)，KQ-250E昆山舒美超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SENCO-R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)，Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，F(xiàn)A1204C自動(dòng)校準(zhǔn)分析天平(上海越平科學(xué)儀器儀器公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(密理博中國(guó)有限公司)。

主要試劑：超純水，甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(桂林暉昂生化藥業(yè)有限責(zé)任公司， 產(chǎn)品編號(hào)： JF20090301)， 三尖杉寧堿、 10-去乙酰紫杉醇和10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品均由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所森林土壤研究室提供。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置和處理方法 采用單因素隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，4種施肥處理分別為Agr、Mic和PfPt 3種細(xì)菌肥料以及不施肥(對(duì)照)，各3次重復(fù)，每處理幼苗50株。于2007年10月選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗進(jìn)行定植，株距和行距均為0.5 m，穴栽；將細(xì)菌肥料稀釋100倍，即濃度為2×107CFU·mL-1，施于植株根部周圍，每株施用1 L；15 d后進(jìn)行第2次施肥，施用量與第1次相同(陽(yáng)光照射強(qiáng)烈時(shí)覆土)。

1.3.2 幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 分別于2008年5月、 6月、7月和11月的月末用鋼卷尺(精度0.1 cm)測(cè)量幼苗的株高和冠幅。株高為幼苗基部至主莖頂部的高度，冠幅為東西、南北冠幅的平均值；株高和冠幅增長(zhǎng)量為當(dāng)次測(cè)量值與上次測(cè)量值差值的平均值。在2008年11月末生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定完畢后，每個(gè)處理隨機(jī)選擇20株幼苗，采集當(dāng)年生新鮮枝葉200 g，混合后帶回實(shí)驗(yàn)室，于40 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎后備用。

1.3.3 次生代謝物的提取和測(cè)定

1.3.3.1 HPLC色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=20∶35∶45混合液，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，保留時(shí)間30 min。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 分別精密稱取紫杉醇、三尖杉寧堿、10-去乙酰紫杉醇和10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，分別用甲醇配制成質(zhì)量濃度1.0 mg·mL-1對(duì)照品母液，并用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度0.025、0.050、0.100、0.200和0.400 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述HPLC色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.3 樣品溶液制備及提取 參照于少帥等[28]和高銀祥等[29]的方法制備待測(cè)液，略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取樣品粉末2.0 mg，加入丙酮-乙酸乙酯混合液(體積比1∶1)30 mL，超聲波提取1 h，過(guò)濾；濾渣按上述方法重復(fù)提取1次，合并2次濾液，于40 ℃減壓蒸干； 殘?jiān)?0 mL甲醇溶解， 4 000 r·min-1離心5 min，上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾；濾液按上述方法進(jìn)行HPLC分析，并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用峰面積歸一化法計(jì)算樣品中各成分的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用EXCEL 2007和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行方差分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同細(xì)菌肥料對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗生長(zhǎng)的影響

分別用細(xì)菌肥料Agr、PfPt和Mic施肥2次，翌年生長(zhǎng)期曼地亞紅豆杉幼苗株高和冠幅增長(zhǎng)量的變化見(jiàn)表1。

2.1.1 株高增長(zhǎng)量的變化 由表1可以看出：6月份，Agr處理對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗株高的促進(jìn)作用最明顯，株高增長(zhǎng)量最大，達(dá)到2.54 cm，較CK(不施肥，對(duì)照)組增加117.09%，差異顯著(P<0.05)；其次為Mic處理組，幼苗株高增長(zhǎng)量也達(dá)到1.37 cm，較CK組增加17.09%，但無(wú)顯著差異(P>0.05)；PfPt處理組的幼苗株高增長(zhǎng)量最小，僅為0.17 cm，并顯著低于CK組。方差分析結(jié)果顯示：使用不同細(xì)菌肥料對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗株高增長(zhǎng)量的影響有顯著差異，其中，Agr處理組的株高增長(zhǎng)量顯著大于其他處理組，PfPt處理組的株高增長(zhǎng)量顯著小于其他處理組。

7月份，Agr、Mic和PfPt處理組的曼地亞紅豆杉幼苗株高增長(zhǎng)量均大于6月份， 分別為3.57、2.50和0.47 cm，其中Agr處理組的株高增長(zhǎng)量較CK組增加21.02%，而Mic和PfPt處理組的株高增長(zhǎng)量均小于CK組。方差分析結(jié)果顯示：各處理組間的幼苗株高增長(zhǎng)量均差異顯著，其中，僅Agr處理組的株高增長(zhǎng)量顯著高于CK組，另2個(gè)處理組的株高增長(zhǎng)量均顯著小于CK組，以PfPt處理組的株高增長(zhǎng)量最小。

11月份，各處理組的幼苗株高增長(zhǎng)量均較7月份明顯增大，其中，PfPt處理組的株高增長(zhǎng)量最大， Mic和Agr處理組的株高增長(zhǎng)量次之，3個(gè)處理組幼苗株高的平均增長(zhǎng)量分別為10.92、10.16和8.69 cm，較CK組分別增加27.42%、18.55%和1.40%。方差分析結(jié)果顯示：PfPt處理組的幼苗株高增長(zhǎng)量與Mic處理組無(wú)顯著差異，但顯著高于CK組和Agr處理組，Mic、Agr和CK 3個(gè)處理組間的株高增長(zhǎng)量則無(wú)顯著差異。

2.1.2 冠幅增長(zhǎng)量的變化 由表1還以看出：6月份， CK組曼地亞紅豆杉幼苗的冠幅增長(zhǎng)量最大， 為1.67 cm；其次為Mic處理組，冠幅增長(zhǎng)量為1.48 cm；Agr處理組的冠幅增長(zhǎng)量最小，僅為0.64 cm。方差分析結(jié)果顯示：Mic處理組和CK組間幼苗的冠幅增長(zhǎng)量無(wú)顯著差異；Agr和PfPt處理組間的冠幅增長(zhǎng)量也無(wú)顯著差異，但均顯著低于Mic處理組和CK組。

表1 施用3種細(xì)菌肥料后翌年生長(zhǎng)期曼地亞紅豆杉幼苗株高和冠幅增長(zhǎng)量的變化
Table 1 Change in increments of height and crown width of Taxus media Rehder in growth period of next year after applied three bacterial fertilizers

處理2)Treatment2)不同月份的株高增長(zhǎng)量/cmIncrementofheightindifferentmonths6月June7月July11月November不同月份的冠幅增長(zhǎng)量/cmIncrementofcrownwidthindifferentmonths6月June7月July11月NovemberCK1.17±0.04b2.95±0.15b8.57±0.24b1.67±0.24a2.59±0.45a5.44±1.14aAgr2.54±0.25a3.57±0.19a8.69±0.25b0.64±0.37b2.77±1.11a5.74±0.67aPfPt0.17±0.08c0.48±0.29d10.92±0.64a0.82±0.07b1.50±0.36b6.86±1.75aMic1.37±0.25b2.50±0.20c10.16±2.49ab1.48±0.22a2.57±0.14a7.20±1.05a

1)同列中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)CK: 不施肥(對(duì)照) No fertilizing (the control); Agr: 放射性土壤桿菌肥料Agrobacteriumradiobacterfertilizer; PfPt: 熒光假單胞菌肥料Pseudomonasfluorescencefertilizer; Mic: 微球菌肥料Micrococcusfertilizer. 3種細(xì)菌肥料濃度均為2×107CFU·mL-1，施肥2次 Concentrations of three bacterial fertilizers all are 2×107CFU·mL-1, fertilizing two times.

7月份，各處理組的幼苗冠幅增長(zhǎng)量均明顯大于6月份。 其中， Agr處理組的冠幅增長(zhǎng)量最大， 達(dá)到2.77 cm，較CK組增加6.95%；PfPt和Mic處理組的冠幅增長(zhǎng)量分別為1.50和2.57 cm，均低于CK組。方差分析結(jié)果顯示：Agr和Mic處理組與CK組間的冠幅增長(zhǎng)量均無(wú)顯著差異，僅PfPt處理組的冠幅增長(zhǎng)量顯著小于CK組及Agr和Mic處理組。

11月份，各處理組的幼苗冠幅增長(zhǎng)量均較7月份大幅提高。其中，Mic處理組的冠幅增長(zhǎng)量最大，為7.20 cm，較CK組增加32.35%；PfPt和Agr處理組的冠幅增長(zhǎng)量分別為6.86和5.74 cm，分別較CK組增加26.10%和5.51%。方差分析結(jié)果顯示：4個(gè)處理組間的幼苗冠幅增長(zhǎng)量無(wú)顯著差異。

2.2 不同細(xì)菌肥料對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗枝葉中4種次生代謝物含量的影響

分別用細(xì)菌肥料Agr、PfPt和Mic施肥2次，翌年11月份曼地亞紅豆杉幼苗枝葉中紫杉醇、三尖杉寧堿、10-去乙酰紫杉醇和10-DAB Ⅲ的含量見(jiàn)表2。

2.2.1 對(duì)紫杉醇含量的影響 由表2可以看出：Mic和PfPt處理組的幼苗枝葉中紫杉醇含量較高， 分別為0.031 7%和0.031 6%；Agr處理組的紫杉醇含量也較高， 為0.030 7%； Mic、 PfPt 和Agr處理組的紫杉醇含量分別較CK(不施肥， 對(duì)照)組提高5.67%、 5.33%和2.33%。方差分析結(jié)果顯示：Mic和PfPt處理組的紫杉醇含量顯著高于Agr處理組和CK組(P<0.05)，但Mic和PfPt處理組間無(wú)顯著差異。

2.2.2 對(duì)三尖杉寧堿含量的影響 由表2還可以看出：PfPt、Agr和Mic處理組的幼苗枝葉中三尖杉寧堿含量分別為0.024 3%、0.022 7%和0.020 4%，分別較CK組提高24.62%、16.41%和4.62%。方差分析結(jié)果顯示：不同處理間三尖杉寧堿含量均存在顯著差異，其中，Agr、PfPt和Mic處理組的三尖杉寧堿含量均顯著高于CK組。

2.2.3 對(duì)10-去乙酰紫杉醇含量的影響 由表2還可以看出：Mic處理組的幼苗枝葉中10-去乙酰紫杉醇含量最高，達(dá)到0.015 6%，較CK組提高6.85%；PfPt處理組、CK組和Agr處理組的10-去乙酰紫杉醇含量較低，分別為0.014 9%、0.014 6%和0.014 4%。

表2 施用3種細(xì)菌肥料后翌年11月份曼地亞紅豆杉幼苗枝葉中4種次生代謝物的含量
Table 2 Contents of four secondary metabolites in branch and leaf of Taxus media Rehder in November of next year after applied three bacterial fertilizers

處理2)Treatment2)紫杉醇含量/%Contentoftaxol三尖杉寧堿含量/%Contentofcephalomannine10-去乙酰紫杉醇含量/%Contentof10-deacetyltaxol10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量/%Contentof10-deacetylbaccatinⅢCK0.0300±0.0004c0.0195±0.0013d0.0146±0.0002b0.0153±0.0013dAgr0.0307±0.0003b0.0227±0.0019b0.0144±0.0001b0.0183±0.0025bPfPt0.0316±0.0005a0.0243±0.0023a0.0149±0.0001b0.0241±0.0021aMic0.0317±0.0001a0.0204±0.0004c0.0156±0.0006a0.0164±0.0021c

1)同列中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)CK: 不施肥(對(duì)照) No fertilizing (the control); Agr: 放射性土壤桿菌肥料Agrobacteriumradiobacterfertilizer; PfPt: 熒光假單胞菌肥料Pseudomonasfluorescencefertilizer; Mic: 微球菌肥料Micrococcusfertilizer. 3種細(xì)菌肥料濃度均為2×107CFU·mL-1，施肥2次 Concentrations of three bacterial fertilizers all are 2×107CFU·mL-1, fertilizing two times.

方差分析結(jié)果顯示：Mic處理組的10-去乙酰紫杉醇含量顯著高于CK組及PfPt和Agr處理組，而后3組間的10-去乙酰紫杉醇含量無(wú)顯著差異。

2.2.4 對(duì)10-DAB Ⅲ含量的影響 由表2還可以看出：3個(gè)細(xì)菌肥料處理組的幼苗枝葉中10-DAB Ⅲ含量均高于CK組。其中，PfPt處理組的10-DAB Ⅲ含量最高，達(dá)0.024 1%；Agr和Mic處理組的10-DAB Ⅲ含量也較高，分別為0.018 3%和0.016 4%，分別較CK組提高57.52%、19.61%和7.19%。方差分析結(jié)果顯示：各處理間的10-DAB Ⅲ含量存在顯著差異；其中，PfPt處理組的10-DAB Ⅲ含量顯著高于CK組及Agr和Mic處理組，CK組的10-DAB Ⅲ含量顯著低于3個(gè)細(xì)菌肥料處理組。

3 討論和結(jié)論

細(xì)菌肥料是把從自然界中篩選出的優(yōu)良微生物菌種擴(kuò)大生產(chǎn)，用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)，并能產(chǎn)生特定肥效的新型肥料[30]。楊承棟等[23]認(rèn)為，細(xì)菌肥料具有改良土壤性質(zhì)、促進(jìn)林木生長(zhǎng)、提高林木抗逆性及維持土壤生態(tài)平衡等作用。本研究中，施用細(xì)菌肥料(Agr、PfPt和Mic)后翌年11月份，3個(gè)細(xì)菌肥料處理組的曼地亞紅豆杉幼苗的株高和冠幅的增幅均大于CK(不施肥，對(duì)照)組，表明施用細(xì)菌肥料對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗生長(zhǎng)均有一定的促進(jìn)作用。與CK組相比，施用PfPt能夠顯著增加曼地亞紅豆杉幼苗株高增長(zhǎng)量，這一現(xiàn)象在劉輝等[31]和李守萍等[32]對(duì)其他樹(shù)種的研究中也存在。唐菁[33]認(rèn)為，細(xì)菌肥料可以提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤內(nèi)部微環(huán)境，增加土壤通透性，細(xì)菌肥料中的活菌株可以分泌一些次生代謝物，活化植物根基細(xì)胞的新陳代謝，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。因而，PfPt能夠顯著提高曼地亞紅豆杉幼苗株高生長(zhǎng)的原因可能有3個(gè)：一是PfPt施入土壤后，通過(guò)增強(qiáng)曼地亞紅豆杉幼苗對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收利用能力而促進(jìn)其植株的生長(zhǎng)[34]；二是通過(guò)促進(jìn)植株產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)等內(nèi)源激素，進(jìn)而促進(jìn)植株生長(zhǎng)[35]；三是通過(guò)產(chǎn)生某些抗菌物質(zhì)抑制土壤中病原微生物，間接促進(jìn)植株生長(zhǎng)[36]。此外，本研究中，雖然施用Agr和Mic后曼地亞紅豆杉幼苗株高和冠幅的增長(zhǎng)量均高于CK組，但并無(wú)顯著差異，說(shuō)明不同細(xì)菌肥料對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗生長(zhǎng)的影響不一致。

次生代謝物是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的一類具有抗逆性的物質(zhì)，當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化并影響植物生長(zhǎng)時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的次生代謝物以維持其正常的生理代謝[37]。Wheeler等[38]認(rèn)為，土壤肥沃程度顯著影響紫杉醇及其衍生物的含量。本研究使用的細(xì)菌肥料來(lái)源于馬尾松(PinusmassonianaLamb.)、杉木〔Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.〕和楊樹(shù)(Populussp.)等林分的土壤，且為具有溶磷能力的細(xì)菌菌株。孫華等[39]認(rèn)為，溶磷細(xì)菌肥料可以促進(jìn)土壤中無(wú)機(jī)磷的轉(zhuǎn)化，從而提高土壤中有效磷含量。焦如珍等[26]認(rèn)為，Pseudomonasfluorescence、Micrococcus和Agrobacteriumradiobacter等菌株可以增強(qiáng)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)磷向有效磷的轉(zhuǎn)化。劉智等[40]研究認(rèn)為，磷元素參與紅豆杉〔Taxuschinensis(Pilger) Rehder〕植株中某些物質(zhì)的合成，這些物質(zhì)在調(diào)控紅豆杉體內(nèi)紫杉醇等次生代謝物合成的過(guò)程中起重要作用。本研究結(jié)果表明：雖然Agr和PfPt處理對(duì)提高曼地亞紅豆杉幼苗枝葉中10-去乙酰紫杉醇含量無(wú)顯著作用，但施用Agr、PfPt和Mic均可以顯著提高其枝葉中紫杉醇、三尖杉寧堿和10-DAB Ⅲ的含量，施用Mic還可以顯著提高其枝葉中10-去乙酰紫杉醇含量。推測(cè)Agr、PfPt和Mic細(xì)菌肥料在溶磷過(guò)程中通過(guò)對(duì)土壤中無(wú)機(jī)磷的轉(zhuǎn)化，使土壤中的有效磷含量增加，從而利于曼地亞紅豆杉植株體內(nèi)紫杉醇等次生代謝物的合成和積累。

綜上所述，不同細(xì)菌肥料對(duì)曼地亞紅豆杉幼苗生長(zhǎng)及次生代謝物合成和積累均有一定的促進(jìn)作用，但不同細(xì)菌肥料的促進(jìn)作用有所不同，因此，適宜曼地亞紅豆杉的細(xì)菌肥料仍需深入研究。另外，本研究只針對(duì)Agr、PfPt和Mic對(duì)曼地亞紅豆杉生長(zhǎng)和次生代謝物含量影響進(jìn)行了單因子實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同細(xì)菌肥料配施及施用其他細(xì)菌肥料對(duì)其生長(zhǎng)和次生代謝物代謝的影響仍未知，因此，后續(xù)將開(kāi)展其他細(xì)菌肥料或者細(xì)菌肥料配施等一系列研究，篩選出適于曼地亞紅豆杉生長(zhǎng)及活性成分積累的最優(yōu)施肥配方。

致謝: 廣東省韶關(guān)市金山地紅豆杉科技有限公司趙世君和肖慧協(xié)助測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)，謹(jǐn)此致謝！

[1] 馬 均, 馬明東. 曼地亞紅豆杉的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)[J]. 林業(yè)科學(xué), 2007, 43(7): 30-34.

[2] 王呈偉, 鄭玉紅, 李 瑩, 等. 曼地亞紅豆杉‘Hicksii’花粉活力檢測(cè)條件優(yōu)化和適宜儲(chǔ)藏溫度分析[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 2012, 21(2): 13-18.

[3] ONRUBIA M, CUSIDR M, RAMIREZ K, et al. Bioprocessing of plantinvitrosystems for the mass production of pharmaceutically important metabolites: paclitaxel and its derivatives[J]. Current Medicinal Chemistry, 2013, 20: 880-891.

[4] 王占和. 曼地亞紅豆杉及其市場(chǎng)前景[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物, 2005, 8(3): 32.

[5] SHELUDKO Y V. Recent advances in plant biotechnology and gen-etic engineering for production of secondary metabolites[J]. Cytology and Genetics, 2010, 44: 52-60.

[6] 邱德有, 吳小紅, 黃璐琦. 木本藥用植物紅豆杉研究的新進(jìn)展[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2009, 22(3): 439-445.

[7] 肖 穎, 趙玉斌. 紅豆杉中紫杉醇抗癌研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008, 17(35): 5557-5558.

[8] SANDERCOCK J, PARMAR M K B, TORRI V, et al. First-line treatment for advanced ovarian cancer: paclitaxel, platinum and the evidence[J]. British Journal of Cancer, 2002, 87: 815-824.

[9] 劉同祥, 張艷平, 徐 羽, 等. 紫杉醇聯(lián)合三尖杉寧堿誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2010, 16(9): 115-118, 122.

[10] 張 衡, 甘 慧, 吳卓娜, 等. 7-木糖紫杉烷類化合物生物轉(zhuǎn)化[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2013, 22(9): 1029-1033.

[11] 劉柿良, 楊秀利, 馬明東, 等. 曼地亞紅豆杉(Taxusmediacv “Hicksii”)栽培基質(zhì)中適宜的錳、鋅、銅濃度及采收時(shí)期研究[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2015, 21(2): 439-448.

[12] 付順華, 邵若玄, 莊毅煒, 等. 曼地亞紅豆杉營(yíng)養(yǎng)液栽培技術(shù)初探[J]. 分子植物育種, 2015, 13(12): 2889-2893.

[13] 王義存, 喬 旭, 王振坤, 等. 曼地亞紅豆杉全光照噴霧扦插技術(shù)研究[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究, 2013, 31(3): 165-168.

[14] 殷 勇. 曼地亞紅豆杉扦插苗成活率對(duì)比研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(22): 9487, 9491.

[15] 喬亮杰, 滿瑞林, 倪網(wǎng)東, 等. 曼地亞紅豆杉枝條中紫杉醇的提取純化研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2009, 34(8): 973-976.

[16] 滿瑞林, 喬亮杰, 倪網(wǎng)東. 曼地亞紅豆杉枝條中紫杉醇的超聲提取研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2008, 20(12): 1637-1640.

[17] 付順華, 史小娟, 苗國(guó)麗, 等. 曼地亞紅豆杉中紫杉醇等與產(chǎn)地因子的相關(guān)性[J]. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 28(2): 227-233.

[18] 史小娟, 徐志明, 付順華, 等. 采收季節(jié)與年齡對(duì)曼地亞紅豆杉主要活性成分的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(19): 2538-2540.

[19] 蔡玉梅, 李清蘭, 林茂帆, 等. HPLC法測(cè)定不同年齡曼地亞紅豆杉根中紫杉醇的含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(28): 15600-15601.

[20] 李乃偉, 汪 慶, 束曉春, 等. 營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)曼地亞紅豆杉生長(zhǎng)與生理指標(biāo)及紫杉醇含量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(4): 193-195.

[21] 李乃偉, 彭 峰, 馮 煦, 等. 不同施肥處理對(duì)曼地亞紅豆杉‘Hicksii’生長(zhǎng)和紫杉醇含量的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 2008, 17(2): 28-33.

[22] 沈興亮, 焦如珍. 細(xì)菌肥料對(duì)油茶幼林生長(zhǎng)的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2014, 27(4): 570-574.

[23] 楊承棟, 焦如珍, 孫啟武, 等. 細(xì)菌肥料促進(jìn)馬尾松生長(zhǎng)效應(yīng)的研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2002, 15(3): 361-363.

[24] 原 芩, 孫崇鳳, 李 華, 等. 微生物肥料對(duì)鋁礦廢棄地復(fù)墾區(qū)土壤有機(jī)碳的影響[J]. 土壤, 2013, 45(3): 419-425.

[25] 付學(xué)琴, 龍中兒, 魏賽金, 等. 硅酸鹽細(xì)菌肥料對(duì)水稻土壤微生物及肥力的影響[J]. 中國(guó)土壤與肥料, 2009(5): 69-71.

[26] 焦如珍, 楊承棟, 孫啟武. 細(xì)菌肥料菌株對(duì)無(wú)效磷的轉(zhuǎn)化利用[J]. 林業(yè)科學(xué), 2005, 41(4): 194-198.

[27] 王守宗, 楊承棟, 謝應(yīng)先, 等. 細(xì)菌肥料對(duì)楊樹(shù)生長(zhǎng)效應(yīng)的研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 1996, 9(6): 654-657.

[28] 于少帥, 孫啟武, 田勝尼, 等. 不同生境及采樣部位對(duì)南方紅豆杉活性成分含量的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2013， 22(1): 50-56.

[29] 高銀祥, 楊逢建, 張玉紅, 等. 南方紅豆杉枝葉中6種紫杉烷類化合物含量季節(jié)變化[J]. 植物研究, 2014, 34(2): 266-270.

[30] 楊承棟, 余 進(jìn), 焦如珍, 等. 細(xì)菌肥料的研究與應(yīng)用[J]. 世界林業(yè)研究, 2008, 21(6): 41-44.

[31] 劉 輝, 吳小芹, 任嘉紅, 等. 一株熒光假單胞菌的溶磷特性及其對(duì)楊樹(shù)的促生效果[J]. 林業(yè)科學(xué), 2013, 49(9): 112-118.

[32] 李守萍, 程玉娥, 唐 明, 等. 油松菌根促生細(xì)菌: 熒光假單胞菌的分離與鑒定[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2009, 29(10): 2103-2108.

[33] 唐 菁. 楊樹(shù)施用細(xì)菌肥料的增長(zhǎng)效應(yīng)及作用機(jī)理研究[D]. 北京: 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所, 2006.

[34] 陳應(yīng)龍, 弓明欽, 王鳳珍, 等. 混合接種Glomus與Pisolithus菌株對(duì)尾葉桉礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收的影響[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 1999, 12(3): 262-267.

[35] DEY R, PAL K K, BHATT D M, et al. Growth promotion and yield enhancement of peanut (ArachishypogaeaL.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Microbiological Research, 2004, 159: 371-394.

[36] UPADHYAY A, SRIVASTAVA S. Evaluation of multiple plant growth promoting traits of an isolate ofPseudomonasfluorescensstrain Psd[J]. Indian Journal of Experimental Biology, 2010, 48: 601-609.

[37] 閻秀峰, 王 洋, 李一蒙. 植物次生代謝及其與環(huán)境的關(guān)系[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 27(6): 2554-2562.

[38] WHEELER N C, JECH K, MASTERS S, et al. Effects of genetic, epigenetic, and environmental factors on taxol content inTaxusbrevifoliaand related species[J]. Journal of Natural Products, 1992, 55: 432-440.

[39] 孫 華, 熊德祥. 施用有機(jī)肥和溶磷細(xì)菌肥料對(duì)砂姜黑土磷素形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響[J]. 土壤通報(bào), 2002, 33(3): 194-196.

[40] 劉 智, 余龍江, 李春艷, 等. 磷甘霉素和洛伐它汀處理對(duì)中國(guó)紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生物合成紫杉醇的影響[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 31(2): 199-204.

(責(zé)任編輯： 張明霞)

Effect of bacterial fertilizer Agr, PfPt and Mic on growth and secondary metabolites content in Taxus media seedling

SHAO Guodong, AI Juanjuan, SUN Qiwu①

(Key Laboratory of Forestry Cultivation, State Forestry Administration， Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China),J.PlantResour. &Environ., 2016, 25(4): 62-67

Using single factor randomized block design and applying three kinds of bacterial fertilizers 〔Agrobacteriumradiobacterfertilizer (Agr),Pseudomonasfluorescencefertilizer (PfPt) andMicrococcusfertilizer (Mic) with concentration of 2×107CFU·mL-1, and fertilizing two times〕 on one-year-old seedling ofTaxusmediaRehder under field cultivation condition, changes in increments of height and crown width of seedling in growth period of next year and contents of four secondary metabolites 〔including taxol, cephalomannine, 10-deacetyl taxol and 10-deacetyl baccatin Ⅲ (10-DAB Ⅲ)〕 in branch and leaf were compared and analyzed. The results show that in November of next year after applied Agr, Mic and PfPt， increments of height and crown width ofT.mediaseedling is higher than those of CK (no fertilizing, the control) group, in which, after applied PfPt， increment of height is the largest, and is significantly higher than that of CK group (P<0.05); after applied Mic， increment of crown width is the largest, but there is no significant difference with that of CK group (P>0.05). After applied Agr, Mic and PfPt, contents of taxol, cephalomannine and 10-DAB Ⅲ in branch and leaf all are significantly higher than those of CK group, in which, content of taxol is the highest after applied Mic, contents of cephalomannine and 10-DAB Ⅲ are the highest after applied PfPt, and those are generally significantly higher than those of other treatment groups; after applied Mic， content of 10-deacetyl taxol is the highest, and is significantly higher than that of CK group and other treatment groups, while after applied Agr and PfPt， there is no significant difference in content of 10-deacetyl taxol with that of CK group. It is suggested that applying Agr, Mic and PfPt have a certain promotion effect on seedling growth and accumulation of secondary metabolites in branch and leaf ofT.media, while there is difference in promotion effect among different bacterial fertilizers. Therefore, appropriate bacterial fertilizer should be selected for different requirements during cultivation process ofT.media.

bacterial fertilizer;TaxusmediaRehder; growth; secondary metabolites; taxol

2016-04-25

國(guó)家林業(yè)局珍稀瀕危物種野外救護(hù)與人工繁育項(xiàng)目(2130211)

邵國(guó)棟(1990—)，男，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事土壤與植物利用相關(guān)方面的研究。

①通信作者E-mail: sqw@caf.ac.cn

S144.9; S791.49; R282.2

A

1674-7895(2016)04-0062-06

10.3969/j.issn.1674-7895.2016.04.08